专利摘要

本发明涉及一种调节肝脏细胞的miR‑183调节物在制备治疗调节肝脏细胞药物中的应用，调节物包括抑制Tnfrsf1α表达和/或促进肝细胞增殖相关蛋白表达的调节物；调节肝脏细胞药物为含有所述调节物的药物以使所述调节物能够发挥作用。调节物包括能够促进肝脏细胞增殖的miR‑183模拟物。调节物还包括能够促进肝脏细胞凋亡的抑制物。本发明提供了一种能够调节肝脏细胞的调节物及其在制备治疗调节肝脏细胞增殖药物中的应用，本申请人通过研究发现了能够调节肝脏细胞增殖或凋亡的调节物，即miR‑183模拟物和抑制物，二者分别具有显著的促进肝细胞增殖和抑制肝细胞增殖的作用，故可制成相应的药物，来实现对肝细胞的调节。

权利要求

1.一种miR-183模拟物在制备促进正常肝脏细胞增殖的药物中的应用，所述miR-183模拟物的碱基序列为：SEQ ID NO.1。

2.miR-183抑制物在制备抑制正常肝脏细胞增殖的药物中的应用，所述miR-183抑制物的碱基序列为：SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抑制物为能够与所述miR-183进行结合的抑制物，所述抑制物与所述miR-183的结合位点为GTGCCATC。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抑制物的碱基序列SEQ ID NO.2中的5'和3'末端均添加有限制性酶切位点，该限制性酶切位点为在酶切后产生粘性末端的限制性酶切位点。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物还包括重组表达载体，所述重组表达载体中包含所述miR-183抑制物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体中的标记基因为双荧光素酶基因。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体是通过将所述的miR-183抑制物连接到psi-CHECK-2载体中得到的重组表达载体。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种能够调节肝脏细胞的miR-183 的模拟物、抑制物、抑制物的重组表达载体及其用途。

背景技术

肝脏是机体的重要器官，具有储存、代谢、生物转化、解毒、造血、合成胆色素、分泌、再生等功能。研究肝再生相关基因对肝细胞增殖和肝再生的作用，对揭示肝再生机制、构建人工肝、建立治疗和预防肝病方法等都有重要理论意义和应用价值。

microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA 分子。miRNA识别并连接靶基因转录的mRNA 3'UTR，并通过其特异性结合位点结合5'UTR上的特异性识别区，然后与一系列功能性蛋白形成沉默复合物，诱发mRNA的降解，从而阻断靶基因的翻译和蛋白在转录后水平的表达。根据靶基因的功能不同，miRNA可参与细胞周期、分化和凋亡，越来越多地受到研究人员的高度重视。

miR-183是miR-183家族(包括miR-183、miR-182和miR-96)之一，通过研究发现，miR-183在结直肠癌、前列腺癌等肿瘤组织中的表达高于肿瘤周围组织，可作为肿瘤早期诊断和预后评估的指标之一。miR-183在肝硬化、癌前病变和肝癌组织的表达水平高于健康对照组，并且通过抑制其靶基因AKAP12基因的表达，参与肝癌的发生发展过程。多种生物信息学软件预测显示miR-183能调节 MTA1、Tnfrsf1α、PDCD4和AKAP12等多个靶基因的表达。其中，Tnfrsf1α基因的编码产物是TNF-α诱导肝细胞凋亡主要受体。在受到各种损伤时，肝细胞膜上大量表达TNFRI，Tnfrsf1α在TNF-α诱导急性肝衰竭过程中处于关键地位。

发明内容

本发明提供了一种肝脏细胞的miR-183调节物及其在制备治疗调节肝脏细胞药物中的应用，该模拟物及抑制物可用于调节Tnfrsf1α蛋白表达，并实现在调节肝细胞增殖或凋亡的基础医学和临床医学的研究，有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进miRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种肝脏细胞的miR-183调节物在制备治疗调节肝脏细胞药物中的应用，所述调节物包括抑制Tnfrsf1α表达和/或促进肝细胞增殖相关蛋白表达的调节物；所述调节肝脏细胞药物为含有所述调节物的药物以使所述调节物能够发挥促进和/或抑制肝脏细胞增殖的作用。

进一步地，所述调节物包括能够促进肝脏细胞增殖的miR-183模拟物，所述miR-183模拟物的碱基序列为：SEQ ID NO.1，该SEQ ID NO.1：uauggcacug guagaauuca cu。

进一步地，所述调节物还包括能够促进肝脏细胞凋亡的抑制物，所述抑制物的碱基序列为：SEQ ID NO.2，该SEQ ID NO.2为：ggccacaccc ccacctcagg aacgggactcgaaggaccat cctgctagat gccctgcttc cctgtgaacc tcctctttgg tcctctaggg ggcaggctcgatctggcagg ctcgatctgg cagccacttc cttggtgcta ccgacttggt gtacatagct tttcccagctgccgaggaca gcctgtgcca gccacttgtg catggcaggg aagtgtgcca tctgctccca gacagctgagggtgccaaaa gccaggagag gtgattgtgg agaaaaagca caatctatct gatacccact tgggatgcaaggacccaaac aaagcttctc agggcctcct cagttgattt ctgggccctt ttcacagtag ataaaacagtctttgtattg attatatcac actaatggat gaacggttga actccctaag gtaggggcaa gcacagaacagtggggtctc cagctggagc ccccgactctTgtaaa taca ctaaaaatct aaaagtg。

进一步地，所述抑制物为能够与所述miR-183模拟物进行结合的抑制物，所述抑制物与所述miR-183模拟物的结合位点为GTGCCATC；二者若通过该序列位点结合，能够极其有效的抑制miR-183模拟物的作用，从而释放了Tnfrsf1 α的促肝脏细胞凋亡的作用，因此实现促进肝脏细胞凋亡的目的。

进一步地，所述抑制物的碱基序列SEQ ID NO.2中的5'和3'末端均添加有限制性酶切位点，该限制性酶切位点为在酶切后产生粘性末端的限制性酶切位点；

进一步地，所述的限制性酶切位点分别为XhoⅠ和NotⅠ对应的核苷酸序列；所述XhoⅠ酶切位点位于5'末端，所述NotⅠ酶切位点位于3'末端。

进一步地，所述调节物还包括能够促进肝脏细胞凋亡的重组表达载体，所述重组表达载体中包含所述的抑制物。

进一步地，所述重组表达载体中的标记基因为双荧光素酶。

进一步地，所述重组表达载体是通过将如权利要求3-5中任意一项所述的 miR-183抑制物连接到psi-CHECK-2(即psi-CHECKTM-2)载体中得到的重组表达载体。

一种能够调节肝脏细胞的调节物，所述调节物为上述所述的调节物。

一种能够调节肝脏细胞的调节物在促进、抑制肝脏细胞增殖中的应用，所述调节物为上述任一项所述的调节物，所述调节物包括能够促进肝脏细胞增殖的miR-183模拟物、能够抑制肝脏细胞增殖的抑制物或能够抑制肝脏细胞增殖的重组表达载体，具体参见以上限定。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

本发明提供了一种肝脏细胞的miR-183调节物及其在制备治疗调节肝脏细胞药物中的应用，本申请人通过研究惊喜的发现了能够调节肝脏细胞增殖或凋亡的调节物，即miR-183模拟物和抑制物，二者分别具有显著的促进肝细胞增殖和抑制肝细胞增殖的作用，故可制成相应的药物，来实现对肝细胞的调节。

所提到的miR-183模拟物可以用于降低Tnfrsf1α蛋白的表达，从而促进肝脏细胞的增殖，因此，miR-183模拟物可应用在促进肝细胞增殖的基础医学和临床医学的研究，也可进一步制成药物来实现促进肝细胞增殖的目的。抑制物及其重组表达载体可以用于抑制miR-183，增加Tnfrsf1α蛋白的表达，从而促进了肝脏细胞的凋亡，因此，该抑制物可应用在促进肝细胞凋亡的基础医学和临床医学的研究，也可进一步制成药物来实现对肝脏细胞的调节。二者有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进miRNA 在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。

附图说明

图1为miR-183的高通量检测结果与qRT-PCR检测结果的比较；

图2为用MTT法检测miR-183的mimic及inhibitor对BRL-3A细胞增殖活性的影响；

图3a为EdU法检测miR-183的mimic及inhibitor对BRL-3A细胞增殖活性的影响；

图3b为miR-183的mimic及inhibitor对BRL-3A细胞增殖活性统计分析结果；

图4为miR-183的mimic和inhibitor对BRL-3A细胞周期的影响；

图5为双荧光素酶方法验证miR-183与Tnfrsf1α的3'-UTR的结合。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：大鼠肝再生模型制备与取材

实验大鼠为成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重230±20g，由河南师范大学实验动物中心提供。饲养温度为21±2℃，相对湿度为60±10％，光照时间12h/d(8:00-20:00)，自由饮水、摄食。取114只上述大鼠，随机分为19组，每组6只。其中，正常对照(0h)1组，2/3肝切除(partial hepatectomy，PH) 与假手术对照(sham operation，SO)各9组。PH组按Higgins和Anderson方法进行，SO组除不切除肝叶外，其他同PH。手术后2、6、12、24、30、36、72、120和168h时，取肝右叶置于组织储存试剂(例如RNALater)中，于-20℃保存备用。

实施例2：miRNAs的高通量测序

取适量上述保存于-20℃的肝组织置于装有液氮的研钵中研磨，按试剂盒(mirVana miRNAIsolation Kit,Ambion,USA)操作指南提取和纯化miRNAs。用琼脂糖凝胶电泳(180V，0.5h)检测总RNA质量，28S rRNA:18S rRNA约为 2:1，且时分别测定OD₂₆₀和OD₂₈₀，在OD₂₆₀/OD₂₈₀≥2.0，视为RNA合格。miRNAs 的定性和定量分析由上海伯豪生物技术公司进行，测序方法为单端Solexa microRNA-Seq测序，读长36nt。将测序得到的miRNAs序列与miRNAs库比对，确定miRNAs的种类和丰度。

实施例3：大鼠肝再生相关miRNAs

用单端Solexa microRNA-Seq高通量测序法，从实验组(PH)和假手术组 (SO)的0、2、6、12、24、30、36、72、120和168h等10个时间点的大鼠再生肝中检测出425条miRNAs，经过ratio值分析表明，信号值大于20的126 条miRNAs中，39条发生了有意义的表达变化。其中，31条的ratio值≥对照2 倍，视为有意义表达上调。4条的ratio值≤对照2倍，视为有意义表达下调。4 条在有的时间点上调，有的时间点下调，视为上/下调。T-检验表明，上述39条发生了有意义表达变化的miRNAs中，23条miRNAs与肝再生相关(表1)。

表1大鼠肝再生中发生有意义转录变化的miRNAs

注： 表示ratio值≥2； 表示ratio值≤0.5； 表示P＜0.05,推测为大鼠肝再生相关microRNAs。

实施例4：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测

设计特异性Stem-Loop反转录(RT)引物(SEQ ID NO.3)、qRT-PCR上下游引物序列和U6内参引物序列，qRT-PCR引物包括miR-183上游引物(SEQ ID NO. 4)和miR-183下游引物(SEQ ID NO.5)，U6内参引物序列包括U6上游引物(SEQ ID NO.6)和U6下游引物(SEQ IDNO.7)，并与miRBase进行物种比对，确定引物的特异性，各个引物序列如表2所示。

按RNA提取试剂(Trizol)操作说明书(Invitrogen,USA)进行细胞总RNA 抽提，分光光度计测定OD₂₆₀和OD₂₈₀，在OD₂₆₀/OD₂₈₀≥2.0，且变性琼脂糖凝胶电泳(70V,20min)检测28S rRNA:18S rRNA约为2:1时视为RNA合格。以 2μg RNA为模板，按AMV反转录试剂盒(Promega,USA)的操作说明进行反转录，得到第一链cDNA。接着，取1μl cDNA，加入10μl荧光染料混合物(SyBr GreenⅠMix)、0.4μl引物、8.6μl去核酸酶的纯水。混匀后，放入荧光定量PCR 仪(Rotor-Gene 3000)(Corbett Robotics,Australia)中扩增基因，检测扩增产物的荧光信号值，并以β-actin(NM_031144)为内参计算基因的相对表达量(ratio 值)。qRT-PCR的条件均为：95℃2min，95℃15sec，60℃20sec，72℃20sec， 40个循环。每个样品重复检测三次，所得数据用2^-ΔΔCt法作相对定量处理。

表2反转录引物及PCR引物序列

注：RT.反转录引物；FP.上游引物；RP.下游引物。

用qRT-PCR验证miR-183在大鼠再生肝中表达变化，验证结果如图1所示， miR-183的表达趋势与高通量测序结果基本吻合。

实施例5：大鼠肝细胞培养

实验所用大鼠正常肝细胞BRL-3A购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，培养基为含10％胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基，细胞培养于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱里。取对数生长期细胞进行传代，5× 10⁴个细胞/瓶。

实施例6：MTT法检测经过本发明调节物处理后的肝细胞增殖情况

取对数生长期的BRL-3A细胞，0.25％胰酶(Invitrogen,USA)消化，按1ml/ 孔、含5×10⁴个/ml细胞的细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，培养12h后，按脂质体转染试剂(Lipofectamine RNAiMAX,Invitrogen,USA)的操作说明书进行细胞转染。简言之，分别在25μl OPTI-MEM培养基中加入miR-183 mimic(miR-183模拟物)(100nM)、mimic NC(模拟物阴性对照)(150nM)、 inhibitor(抑制物)(100nM)、inhibitorNC(抑制物阴性对照)(150nM)和1.5μl 转染试剂，室温静置5min。将上述溶液轻轻混匀，形成转染复合物，室温静置20min，加入到含0.45ml OPTI-MEM培养基(Gibco,USA)的细胞中，37℃孵育4h，换正常培养基。实验重复3次，每个实验组设置3个复孔。

在含细胞和培养基的96孔板里加入10μl/孔MTT(Geneview,USA)，使其最终浓度达0.5g/L，于37℃避光培养4h，彻底弃去培养液后，每孔加入100 μl二甲基亚砜(DMSO,Geneview,USA)，轻轻震荡10min，充分溶解甲瓒晶体。最后，用酶标仪(Biotek,USA)于490nm波长处检测各孔的吸光值。实验重复3次，每个实验组设置3个复孔。

检测结果如图2所示，miR-183mimic处理组，细胞增殖活性高于mimic NC 组，说明miR-183mimic促进BRL-3A细胞的增殖；inhibitor处理组，细胞增殖活性低于inhibitorNC组，说明inhibitor抑制BRL-3A细胞增殖(P<0.05)。

实施例7：EdU标记法检测经过本发明调节物处理后的肝细胞增殖情况

取对数生长期的BRL-3A细胞，按5×10⁴/孔的细胞密度接种于预置圆玻片的24孔板中，培养12h后,mimic(100nM)和inhibitor(150nM)转染体外培养的BRL-3A细胞，转染后48h取出细胞爬片，取材前2h加入EdU(锐博，广州)使其终浓度为50μM，4％的多聚甲醛固定30min。再于甘氨酸溶液(2g/L) 中脱色孵育5min。然后，再于0.5％TritonX-100脱色孵育10min。接着，于1 ×Apollo染色反应液(锐博，广州)中孵育30min，再于0.5％TritonX-100孵育10-30min，并于1×Hoechst 33342反应液(锐博，广州)中室温孵育30min 标记细胞核，上述每进行一个步骤，均用PBS洗3次，每次5min。最后，荧光显微镜下随机选取5个不重叠的视野(20×)，进行观察和拍照，并用Image-Pro Plus 6.0软件对EdU阳性细胞和相应视野下的细胞核分别进行计数。并用SPSS 13.0统计学软件的单因素方差分析方法分析组间差异。

检测结果表明，mimic组EdU阳性细胞比率为37.5％，明显高于其对照组 (30.5％)(P＜0.05)，inhibitor组的EdU阳性细胞比率为20.0％，明显低于其对照组(29.4％)(P＜0.05)(图3a、b)。上述结果表明，miR-183模拟物促进 BRL-3A细胞增殖，抑制物抑制BRL-3A细胞增殖。

实施例8：miRNAs的靶基因预测及其功能确认

根据miRNAs在大鼠肝再生中的表达变化，找出发生有意义表达变化的 miRNAs。用TargetScan、miRanda、PciTar、miRDB、miRWalk等在线分析工具预测上述miRNAs的靶基因。简要地说，在miRWalk(www.umm.uni-heidelberg.

de/apps/zmf/mirqwalk/index.html)主页上点击“MicroRNA targets”栏的“genetargets”，将目的miRNAs输入搜索栏，在数据库选项中选择TargetScan、miRanda、 PciTar、miRDB、miRWalk，点击“SEARCH”，获得靶基因。进一步查找KEGG (www.genome.Jp/keg/pathway.html)网站，确认miRNAs的靶基因。将确认的靶基因与GO数据库比对，找出靶基因参与的信号通路和/或细胞增殖和凋亡活动。继续将参与细胞增殖和凋亡信号通路的靶基因输入IPA等软件和Qiagen 等数据库，获得信号通路的结构、成分和信号传导路径。

实施例9：细胞周期检测本发明调节物的调节情况

为检测miR-183模拟物对大鼠正常肝细胞BRL-3A的细胞周期的影响，将细胞接种于24孔细胞培养板中，1×10⁵个细胞/孔，待细胞长到50～60％汇合度时，加入Lipofectamine 2000(Invitrogen)和模拟物及对照或抑制物及对照转染细胞，转染浓度为：模拟物及其对照浓度均为100nM/孔，抑制物及其对照浓度均为150nM/孔。在5％CO₂、37℃培养箱中培养48h后收集细胞。用70％乙醇于-20℃固定细胞过夜，用PBS洗涤和200目筛网过滤细胞后，再用PI染液(50 μg/mLPI、100μg/mL DNase-free RNaseA)室温避光染色30min，用流式细胞术检测细胞周期。

流式细胞术检测结果显示，miR-183mimic处理组的与其对照组的细胞增殖率(即S期细胞比例)分别为19.10％和12.10％(p＜0.05)，inhibitor处理组的与其对照组的细胞增殖率(S+G2/M％)分别为12.30％和16.20％(p＜0.05)。以上结果表明，如图4所示，miR-183促进了BRL-3A的细胞周期进程，inhibitor 抑制了BRL-3A的细胞周期进程。

实施例10：双荧光素酶报告基因检测系统的设计与构建

准备抑制物(即SEQ ID NO.2)，将部分抑制物序列SEQ ID NO.2中的 CACTGGA变为TATTAA，采用突变的方法或重新合成的方法进行改变，改变后的序列记为抑制物突变序列，即该抑制物突变序列仅仅将SEQ ID NO.2中的 CACTGGA变为TATTAA，其它碱基序列均与抑制物SEQ ID NO.2一致。

然后将抑制物(SEQ ID NO.2)、抑制物突变序列分别克隆到psi-CHECKTM-2 载体上，得到相应的含miR-183抑制物的载体(psi-CH-tnf-wt)、含miR-183的抑制物突变序列的载体(psi-CH-tnf-mut)，psi-CHECKTM-2载体作为对照(psi-CH)。

实施例11：miR-183的促进BRL-3A细胞生长增殖机制

取对数生长期的BRL-3A细胞，按5×10⁴/孔接种在24孔板中，用 psi-CH-tnf-wt、psi-CH-tnf-mu、psi-CH2分别与miR-183mimic/inhibitor共转。在转染后48h，使用双荧光素酶报告基因测定试剂盒(Promega)分析蛋白质提取物的荧光值。结果表明，miR-183模拟物能与Tnfrsf1α的3'-UTR结合，并降低荧光活性(p＜0.05)，但添加miR-183抑制物(SEQ IDNO.2)后，miR-183与 Tnfrsf1α的3'-UTR结合降低，也未见荧光活性降低(p＜0.05)，如图5所示。

此结果表明miR-183模拟物可以通过靶向结合Tnfrsf1α的3'-UTR，阻遏 Tnfrsf1α表达，从而抑制BRL-3A细胞凋亡，促进BRL-3A的增殖。而miR-183 的inhibitor可以抑制miR-183与Tnfrsf1α的3'-UTR结合，促进Tnfrsf1α表达，促进BRL-3A细胞凋亡。

在本发明中，miR-183的模拟物体内促细胞增殖的原理是用基因转染的方法将模拟物导入受体细胞，该模拟物与Tnfrsf1α的3'-UTR结合，导致Tnfrsf1α表达水平降低，从而阻遏Tnfrsf1α的促凋亡作用，促进细胞增殖；miR-183的抑制物体内发挥作用的原理是设计并构建重组载体，其内含有miR-183的抑制物核苷酸序列，用基因转移的方法将重组载体导入受体细胞，通过载体过表达 miR-183的抑制物核苷酸序列，此抑制物核苷酸序列与miR-183定点结合，从而抑制miR-183与Tnfrsf1α的3'-UTR结合，Tnfrsf1α表达水平增加，从而促进Tnfrsf1 α的促细胞凋亡作用。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明透露的技术范围内，可想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

序列表

<110> 河南师范大学

<120> 一种肝脏细胞的miR-183调节物及其在制备治疗调节肝脏细胞药物中的应用

<130> EY01PT011800885

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> HUMAN artificial

<400> 1

uauggcacug guagaauuca cu 22

<210> 2

<211> 507

<212> DNA

<213> HUMAN artificial

<400> 2

ggccacaccc ccacctcagg aacgggactc gaaggaccat cctgctagat gccctgcttc 60

cctgtgaacc tcctctttgg tcctctaggg ggcaggctcg atctggcagg ctcgatctgg 120

cagccacttc cttggtgcta ccgacttggt gtacatagct tttcccagct gccgaggaca 180

gcctgtgcca gccacttgtg catggcaggg aagtgtgcca tctgctccca gacagctgag 240

ggtgccaaaa gccaggagag gtgattgtgg agaaaaagca caatctatct gatacccact 300

tgggatgcaa ggacccaaac aaagcttctc agggcctcct cagttgattt ctgggccctt 360

ttcacagtag ataaaacagt ctttgtattg attatatcac actaatggat gaacggttga 420

actccctaag gtaggggcaa gcacagaaca gtggggtctc cagctggagc ccccgactct 480

tgtaaataca ctaaaaatct aaaagtg 507

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> HUMAN artificial

<400> 3

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagtgaa 50

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> HUMAN artificial

<400> 4

gcgtatggca ctggtagaat 20

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> HUMAN artificial

<400> 5

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> HUMAN artificial

<400> 6

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> HUMAN artificial

<400> 7

aacgcttcac gaatttgcgt 20

一种肝脏细胞的miR-183调节物及其在制备治疗调节肝脏细胞药物中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。