专利摘要

本发明公开了一种DNA标记用荧光探针及其合成方法和用途，该方法步骤为以乙醇为溶剂，加入摩尔比为1.05～2：1的N-(4-丁磺酸基)-4-甲基喹啉内盐和3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑以及催化量的哌啶，加热回流4-8小时；反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。本发明的DNA标记用荧光探针与双链DNA(ds26)有强烈的相互作用，在抗肿瘤药物合成具有潜在的应用价值。本发明的DNA标记用荧光探针具有荧光背景低、与双链DNA(ds26)结合特异性强、制备简单和结构稳定等特点。

权利要求

1.一种DNA标记用荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针结构如下：

2.一种如权利要求1所述DNA标记用荧光探针的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

以乙醇为溶剂，加入摩尔比为1.05～2：1的N-(4-丁磺酸基)-4-甲基喹啉内盐和3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑以及催化量的哌啶，加热回流4-12小时；反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。

3.一种如权利要求1所述DNA标记用荧光探针的用途，其特征在于，用于与双链DNA的相互作用，用于抗肿瘤药物先导化合物的筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及化学合成和生物分析领域，尤其涉及一种DNA标记用荧光探针的制备方法。

背景技术

DNA是生物体中主要的遗传物质。生物体中的核酸链包括单链、双链、三螺旋和四链体等多种结构，这些结构之间相互联系、转化，在机体的生长、发育和繁殖等生命过程中起着重要作用，因此DNA分子的定量分析、特异识别，对病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。荧光探针法较传统的同位素检测快速，重复性好，用量少，无辐射，在DNA自动测序、抗体免疫分析和抗癌药物分析方面已得到广泛的应用。同时，DNA分子荧光探针在新型抗癌药剂的开发和抗癌机理的研究也早有报道。

DNA荧光探针的灵敏度是影响检测结果的重要因素，因而开发出更灵敏的荧光探针，同事避免生物荧光背景的研究已经成为目前研究的热点。研究一些染料在水溶液中的荧光量子产率低、与核酸结合后荧光量子产率显著增加是目前研究的趋势。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种DNA标记用荧光探针及其合成方法和用途。

为了解决上述问题，本发明的DNA标记用荧光探针，所述的荧光探针是咔唑吡啶喹啉类荧光探针，其结构如下：

本发明所述荧光探针制备方法概述如下：

以乙醇为溶剂，加入摩尔比为1.05～2：1的N-(4-丁磺酸基)-4-甲基喹啉内盐和3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑以及催化量的哌啶，加热回流4-8小时；反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。

一种DNA标记用荧光探针的应用为与双链DNA(ds26)的特异性结合。

荧光探针用于与双链DNA(ds26)的特异性结合，用于抗肿瘤药物先导化合物的筛选。

本发明的优点：1)荧光背景低、显色强。2)与双链DNA(ds26)作用强，荧光强度增加倍数大。3)在抗肿瘤先导化合物研究方面具有潜在的参考价值。

附图说明

图1为本发明的荧光探针与DNA作用后的荧光光谱(荧光探针最终浓度为6μM，DNA的最终浓度为18μM)。

图2为本发明荧光探针与DNA作用后增强倍数(荧光探针最终浓度为6μM，DNA的最终浓度为18μM)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的合成方程式：

一种DNA标记用荧光探针的制备方法包括以下步骤：

以乙醇为溶剂，加入摩尔比为1.05～2：1的N-(4-丁磺酸基)-4-甲基喹啉内盐和3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑以及催化量的哌啶，加热回流4-8小时；反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。

探针与DNA相互作用。

将探针用DMSO配制成浓度为1×10^-3mol/L的母液。G-四链体DNA采用pH＝7.4且含有10mmol/L KCl(或NaCl)的Tri-HCl进行溶解，根据样品在260nm处的吸收值和摩尔消光系数计算其浓度。

紫外吸收光谱测定。配制待测样品总体积为500μL，化合物的浓度固定为6μM。DNA的浓度分别为0、1.5、3.0、6.0、9.0、12和18μM。在4℃下孕育2小时，分别用紫外分光光度计来测定300-700nm之间的吸收光谱。再使用荧光分光度计进行荧光发射光谱的测定。

实施例1

在50ml的四口瓶中加入N-(4-丁磺酸基)-4-甲基喹啉内盐(0.29g,1.05mmol)、3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑(0.33g,1.0mmol)、25ml无水乙醇和50μL哌啶，加料完毕加热至回流4小时，TLC监控反应完毕，浓缩后进行柱层析分离，用二氯甲烷/甲醇(10:1)作为流动相得到荧光探针0.44g，收率75.0％。

实施例2

在50ml的四口瓶中加入N-(4-丁磺酸基)-4-甲基喹啉内盐(0.56g,2.0mmol)、3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑(0.33g,1.0mmol)、30ml无水乙醇和50μL哌啶，加料完毕加热至回流8小时，TLC监控反应完毕，浓缩后进行柱层析分离，用二氯甲烷/甲醇(3:1)作为流动相得到荧光探针0.38g，收率66.1％。

实施例3

在50ml的四口瓶中加入N-(4-丁磺酸基)-4-甲基喹啉内盐(0.42g,1.5mmol)、3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑(0.48g,1.0mmol)、40ml无水乙醇和50μL哌啶，加料完毕加热至回流6小时，TLC监控反应完毕，浓缩后进行柱层析分离，用二氯甲烷/甲醇(3:1)作为流动相得到荧光探针0.41g，收率70.2％。¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆):δ1.20-1.26(m,2H),1.50-1.53(t,3H),1.98-2.05(m,2H),2.28-2.35(m,2H),3.00-3.05(t,J＝6.8Hz,2H),4.40-4.46(m,2H),5.02-5.05(m,2H),7.12(d,J＝14Hz,1H),7.5-8.74(m,17H),9.28(d,J＝6Hz,1H),ESI Mass：m/z＝587.2(M+Na+).

实施例4

将荧光探针用DMSO配制成浓度为1×10^-3mol/L的母液。G-四链体DNA(采用pH＝7.4且含有10mmol/L KCl(或NaCl)的Tri-HCl进行溶解，根据样品在260nm处的吸收值和摩尔消光系数计算其浓度。

紫外吸收光谱测定。配制待测样品总体积为500μL，化合物的浓度固定为6μM。DNA的浓度分别为0、1.5、3.0、6.0、9.0、12和18μM。在4℃下孕育2小时，分别用紫外分光光度计来测定300-700nm之间的吸收光谱。再使用荧光分光度计进行荧光发射光谱的测定。如图中所显示结果，荧光探针与ds26作用后荧光增强倍数大于60倍。与其他DNA作用强度都小于35倍以下，与DNA结合特异性明显。

其中，所用的DNA序列为：

A24：(ttaggg)4；

H24：ttggg(ttaggg)3a；

c-myc2345:tgagggtggggagggtggggaa；

c-kit1:agggagggcgctgggaggaggg；

bcl-22345:gggcgcgggaggaattgggcggg；

S22:(ccctaa)3ccct；

VEGF:gggcgggccgggggcggg；

22AG in Na+:AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG；

S24:(ccctaa)4；

ds26:CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG；

D24(A24和S24按照1：1混合)。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

一种DNA标记用荧光探针及其合成方法和用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。