专利摘要

本发明公开了一种它包括以下步骤：(1)取生药，水提取，得水提液；所述生药由栝楼、桂枝、白芍、生姜、大枣和甘草组成；(2)取水提液，离心，过滤，得上样液；(3)取上样液，经HPD‑100大孔树脂纯化，得中药提取物。本发明的中药提取物制备方法，有效保留了中药中的多种活性成分，以得到的该中药提取物为原料所制得滴丸，减少了患者服用剂量，提高了疗效。

权利要求

1.一种中药提取物的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)取生药，水提取，得水提液；所述生药由栝楼、桂枝、白芍、生姜、大枣和甘草组成；

(2)取水提液，离心，过滤，得上样液；

(3)取上样液，经HPD-100大孔树脂纯化，得中药提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述生药中，栝楼、桂枝、白芍、生姜、大枣和甘草的重量比为30：9：9：9：9：6。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述水提取是加入10倍量的水，煎煮2次，每次1.5小时。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中上样液的生药浓度为0.2～0.4g生药/mL；优选的生药浓度为0.3g生药/mL。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的大孔树脂纯化中，吸附流速1～3BV·h^-1，优选2BV·h^-1。

6.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的大孔树脂纯化中，洗脱剂为70～90％乙醇。

7.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的大孔树脂纯化中，洗脱剂用量为6BV。

8.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的大孔树脂纯化中，洗脱流速1～3BV·h^-1，优选2BV·h^-1。

9.一种中药提取物，其特征在于：它是通过权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的。

10.根据权利要求9所述的中药提取物，其特征在于：每100mL该提取物中，含有下述成分：芍药苷49.68±0.03mg、芍药内酯苷14.15±0.05mg肉桂酸0.88±0.02mg、姜酚1.07±0.02mg、甘草苷10.55±0.01mg、甘草酸8.12±0.03和甘草素0.38±0.01mg。

说明书

技术领域

本发明涉及中药提取物的制备方法及该方法制备得到的中药提取物。

背景技术

栝楼桂枝汤出自东汉末年张仲景《金匮要略》，主要由栝楼、桂枝、白芍、生姜、大枣、甘草等组成，具有解肌调营、养营生津、柔润筋脉的功效[1]。

已有研究报道栝楼桂枝汤和栝楼桂枝颗粒具有良好的脑保护作用[2-7]。但是，其服药剂量相对较大，适从性不高。为了减少患者服用剂量，提高疗效，有必要对其进行进一步地改进。

[1]田文熙.《金匮要略》中桂枝汤类方调和阴阳的作用[J].中国中医基础医学杂志,2010,08:646-647.

[2]张玉琴,李煌,许文,徐伟,黄枚,褚克丹,陈立典.栝楼桂枝颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠的血脑屏障通透性及神经保护作用[J].中华中医药杂志,2015,05:1410-1417.

[3]朱晓勤,李钻芳,毛敬洁,胡海霞,林如辉,陈立典.栝楼桂枝汤对谷氨酸所致的PC12细胞损伤的保护作用[J].福建中医药,2015,02:35-36.

[4]林羽,徐伟,张玉琴,李煌,许文.栝楼桂枝颗粒抗缺血性脑卒中大鼠神经元及原代海马神经元凋亡研究[J].康复学报,2015,01:38-43.

[5]Huang J,Tao J,Xue X,Yang S,Han P,Lin Z,Xu W,Lin J,Peng J,Chen L.Gua Lou Gui Zhi decoction exerts neuroprotective effects on post-stroke spasticity via the modulation of glutamate levels and AMPA receptor expression.Int J Mol Med.2013 Apr；31(4):841-8.

[6]Hu H,Li Z,Zhu X,Lin R,Lin J,Peng J,Tao J,Chen L.Gua Lou Gui Zhi decoction suppresses LPS-induced activation of the TLR4/NF-κB pathway in BV-2 murine microglial cells.Int J Mol Med.2013 Jun；31(6):1327-32.

[7]Hu H,Li Z,Zhu X,Lin R,Peng J,Tao J,Chen L.GuaLou GuiZhi decoction inhibits LPS-induced microglial cell motility through the MAPK signaling pathway.Int J Mol Med.2013 Dec；32(6):1281-6.11.

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种中药提取物的制备方法及该方法制备得到的中药提取物。

本发明提供了一种中药提取物的制备方法，它包括以下步骤：

(1)取生药，水提取，得水提液；所述生药由栝楼、桂枝、白芍、生姜、大枣和甘草组成；

(2)取水提液，离心，过滤，得上样液；

(3)取上样液，经HPD-100大孔树脂纯化，得中药提取物。

进一步地，步骤(1)中，所述生药中，栝楼、桂枝、白芍、生姜、大枣和甘草的重量比为30：9：9：9：9：6。

进一步地，步骤(1)中，所述水提取是加入10倍量的水，煎煮2次，每次1.5小时。

进一步地，所述步骤(2)中上样液的生药浓度为0.2～0.4g生药/mL；优选的生药浓度为0.3g生药/mL。

进一步地，所述步骤(3)的大孔树脂纯化中，吸附流速1～3BV·h^-1，优选2BV·h^-1。

进一步地，所述步骤(3)的大孔树脂纯化中，洗脱剂为70～90％乙醇。

进一步地，所述步骤(3)的大孔树脂纯化中，洗脱剂用量为6BV。

进一步地，所述步骤(3)的大孔树脂纯化中，洗脱流速1～3BV·h^-1，优选2BV·h^-1。

本发明还提供了一种中药提取物，它是以前述的方法制备得到的。

进一步地，每100mL该提取物中，含有下述成分：芍药苷49.68±0.03mg、芍药内酯苷14.15±0.05mg肉桂酸0.88±0.02mg、姜酚1.07±0.02mg、甘草苷10.55±0.01mg、甘草酸8.12±0.03和甘草素0.38±0.01mg。

本发明的中药提取物制备方法，有效保留了中药中的多种活性成分，以得到的该中药提取物为原料所制得滴丸，减少了患者服用剂量，提高了疗效。

BV：resin bed volume树脂床体积。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1上图为混合对照品的HPLC，下图为样品液的HPLC，1:芍药内酯苷；2:芍药苷；3:甘草苷；4:甘草素；5:肉桂酸；6:甘草酸；7:6-姜酚。

图2为吸附泄露曲线考察结果。

具体实施方式

实施例1 本发明中药提取物的制备方法

处方：栝楼30g，桂枝9g，白芍9g，生姜9g，大枣9g，甘草6g。

取处方比例的各味药材，加10倍量(720mL)的水，煎煮2次，每次1.5h，合并煎液，滤过，浓缩至溶液浓度0.3g生药/mL，离心30min，离心转速为3000r·min^-1，滤过，即得上样液；取上样液经HPD-100型大孔树脂柱分离纯化，纯化工艺为：最大上样量为2.5g生药·g^-1，吸附流速为2BV·h^-1，洗脱剂为70％乙醇，洗脱流速为3BV·h^-1，洗脱剂用量为6BV；合并收集70％乙醇洗脱液即得。

实施例2 以本发明中药提取物为原料制备的滴丸

将实施例1制备本发明中药提取物浓缩，减压干燥，粉碎，即得栝楼桂枝汤浸膏粉。

按3:2:1比例取聚乙二醇4000、聚乙二醇6000和栝楼桂枝汤浸膏粉，混合均匀，90℃下加热熔融，按以下条件滴制成丸：滴速为20滴·min^-1、滴距为2cm、冷凝温度为10℃。

实施例3 本发明制备方法的工艺筛选

1仪器与药品

U-3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司)；XS105型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，TGL-16G型台式离心机(上海安亭科技仪器厂)；ELX-800型多功能酶标仪(帝肯(上海)贸易有限公司)；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

天花粉(批号：20151213)、白芍(批号：20151211)，购自安徽德昌药业饮片有限公司；桂枝(批号：160403)，购自亳州市永刚饮片厂有限公司；甘草(批号：15060901)，购自福州回春中药饮片厂有限公司；生姜、大枣为市售；芍药苷(批号：110736-201539)、芍药内酯苷(批号：16021410)、肉桂酸(批号：110786-200503)、甘草苷(批号：111610-201106)，购自中国药品生物制品研究院；6-姜酚(批号：PZ9M6R1)、甘草酸(批号：Z30A6B1)、甘草素(批号：ZMO314BD14)，购自上海源叶生物科技有限公司；HPD-100型大孔树脂购自郑州勤实科技有限公司；D101、NKA-9型大孔树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司；色谱级乙腈购自德国默克公司；水为超纯水。

PC12细胞购自齐氏生物科技有限公司；磷酸盐缓冲溶液、DMEM高糖培养基、青霉素-链霉素双抗、胎牛血清，均购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；胰蛋白酶购自美国Life Technologies公司；谷氨酸、噻唑蓝购自美国SIGMA公司；二甲基亚砜购自国药集团化学试剂有限公司。

2方法与结果

2.1 7种指标成分的含量测定

2.2.1混合对照品溶液的制备分别精密称取芍药苷、芍药内酯苷、肉桂酸、6-姜酚、甘草苷、甘草酸、甘草素对照品适量，用甲醇溶解并稀释，摇匀，得各对照品贮备液；分别精密吸取各对照品储备液适量，用甲醇定容，摇匀，即得。

2.2.2色谱条件DIKMA C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％磷酸，梯度洗脱条件见表1；流速0.8mL·min^-1；柱温30℃；进样体积10μL，检测波长为236nm；色谱图见图1。

表1 HPLC梯度洗脱条件

2.2上样液的制备按处方比例称取各味药材，加10倍量的水煎煮提取2次，每次1.5h，提取液滤过，合并浓缩，蒸馏水定容至一定体积，离心30min(3000r·min^-1)，抽滤，即得上样液。

2.3大孔树脂的预处理取大孔树脂加95％乙醇浸泡24h，充分溶胀后湿法装柱，用95％乙醇洗脱，至流出液加5倍量水不呈白色混浊为止，用水洗至无醇味，备用。

2.4大孔树脂型号筛选

2.4.1大孔树脂动态吸附考察取上样液分别通过3种不同型号已处理好的树脂柱(柱体积为20mL)，进行动态吸附，完全吸附后，先用水洗至流出液近无色，再用乙醇100mL洗脱。分别收集残留液、水洗液和乙醇洗脱液。通过测定7种指标成分含量，以其比吸附量和解析率为评价指标，筛选最佳树脂，结果见表2和表3。

表2 大孔树脂比吸附量筛选结果

比吸附量＝(M_上样液-M_残留液-M_水洗液)/M_{大孔树脂重量}

表3 大孔树脂解析率筛选结果

解析率＝M_乙醇洗液/M_吸附量×100％

结果表明，D101大孔树脂的比吸附量相对较大，HPD-100大孔树脂的解析率相对较高，因此对HPD-100与D101大孔树脂进行进一步考察。

2.4.2MTT法活性筛选取对数期的PC12细胞接种至96孔培养板，每孔200μL，含2×10⁴个细胞，培养孵育过夜后用于实验。弃去培养基，并用PBS轻轻荡洗一遍，随机分成10组，正常组、模型组(谷氨酸损伤组，浓度为30mmol·L^-1)、HPD-100组(100、200、300和400μg·mL^-1)和D101组(100、200、300和400μg·mL)，正常组、模型组加入1％FBS的1640培养基，HPD-100组和D101组分别加入不同样品浓度的1％FBS的1640培养基，每孔均为100μL，培养24h后，正常组加入100μL 1％FBS的1640培养基，模型组、HPD-100组和D101组分别加入100μL的含30mmol·L^-1谷氨酸的1％FBS的1640培养基(谷氨酸终浓度为15mmol·L^-1)，继续培养6h，MTT法检测各组细胞活力。重复实验3次，各组设定为6个复孔，结果见表4

表4 MTT法活性筛选结果

与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.05；与HPD-100组相应浓度比较，^#P＜0.05。

结果表明，模型组的存活率明显降低(P＜0.01)，HPD-100组100、400μg·mL^-1浓度给药后存活率明显高于D101组对应浓度(P＜0.05)，且HPD-100组中200μg·mL^-1浓度给药后存活率明显高于模型组(P＜0.05)；综合考虑，选择HPD-100型大孔树脂为纯化栝楼桂枝汤的最佳树脂。

2.5纯化工艺参数优选

2.5.1上样液浓度的考察精密量取处理好的HPD-100湿树脂20mL 5份，湿法装柱，准备0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g生药·mL^-1 5种浓度的上样液，分别通过HPD-100树脂柱，进行动态吸附，完全吸附后，先用水洗至流出液近无色，再用乙醇洗脱并收集乙醇洗脱液，测定其中7种指标成分的含量，见表5。

表5 上样液浓度的考察结果

结果表明，当上样液浓度达到0.3g生药·mL^-1时，7种指标成分含量达到最大值，浓度继续增大时，含量降低，故选取0.3g生药·mL^-1为上样浓度。

2.5.2吸附流速的考察精密量取处理好的HPD-100湿树脂20mL 3份，湿法装柱，取0.3g生药·mL^-1的上样液分别以1、2和3BV·h^-1流速进行动态吸附，完全吸附后，先用水洗至流出液近无色，再用乙醇洗脱并收集乙醇洗脱液，测定其中7种指标成分的含量，见表6。

表6吸附流速的考察结果

结果表明，7种指标成分含量随吸附流速的减小而增大，当吸附流速为1、2BV·h^-1时，含量相差不大，考虑到实际生产过程，缩短生产周期，故选取流速为2BV·h^-1为吸附流速。

2.5.3泄流曲线的考察精密量取处理好的HPD-100湿树脂20mL，湿法装柱，取0.3g生药·mL^-1的上样液以流速2BV·h^-1上样，分段收集流出液，每个柱体积(20mL)收集一份，测定其中7种指标成分的含量，并绘制泄漏曲线，见图2。

结果表明，芍药苷、芍药内酯苷、甘草苷和甘草酸在第6流份时明显泄露，而肉桂酸、6-姜酚和甘草素尚未泄露，为了尽可能减少有效成分损失，故确定药物的最大上样量为2.5g生药·g^-1。

2.5.4洗脱剂的考察精密量取处理好的HPD-100湿树脂20mL 5份，湿法装柱，取0.3g生药·mL^-1上样液100mL以流速2BV·h^-1上样，进行动态吸附，完全吸附后，先用水洗至流出液近无色，再分别用10％、30％、50％、70％和90％乙醇洗脱并收集乙醇洗脱液，测定其中7种指标成分的含量，见表7。

表7 洗脱剂的考察结果

结果表明，70％与90％乙醇洗脱能力较佳。

2.5.5洗脱剂用量的考察精密量取处理好的HPD-100湿树脂20mL，湿法装柱，取0.3g生药·mL^-1上样液100mL以流速2BV·h^-1上样，进行动态吸附，完全吸附后，先用水洗至流出液近无色，再用70％乙醇洗脱分段收集流出液，每个柱体积(20mL)收集一份，测定其中7种指标成分的含量，见表8。

表8 洗脱剂用量考察结果

结果表明，洗脱剂用量为6BV时较佳。

2.5.6洗脱流速的考察精密量取处理好的HPD-100湿树脂20mL，湿法装柱，取0.3g生药·mL^-1上样液100mL以流速2BV·h^-1上样，进行动态吸附，完全吸附后，先用水洗至流出液近无色，再用6BV的70％乙醇洗脱，分别以1、2和3BV·h^-1的流速洗脱并收集乙醇洗脱液，测定其中7种指标成分的含量，见表9。

表9 洗脱流速的考察结果

综合考虑，选取2BV·h^-1为洗脱流速。

2.5.7验证试验按最佳工艺条件进行验证，进行3批次，条件：上样浓度为0.3g生药·mL^-1，最大上样量为2.5g·g^-1，吸附流速为2BV·h^-1，洗脱剂为70％乙醇，洗脱流速为2BV·h^-1，洗脱剂用量为6BV洗脱，收集洗脱液，测定7种指标成分的含量，以成分保留率为评价指标，见表10。

表10 验证实验结果

成分保留率＝M_纯化后/M_纯化前×100％

实验得到纯化后样品平均质量0.329mg，在上述最佳工艺下，HPD-100型大孔树脂降低栝楼桂枝汤的浸膏率效果明显，且成分保留率较高。

以下通过试验例证明本发明实施例2滴丸的有益效果。

试验例

福建省第二人民医院院内制剂栝楼桂枝颗粒(批文为：2013S0001)的说明书中，标明12g/包，每日3包，共需服药量为36g·d^-1；现改为滴丸后，日处方量药材经大孔树脂纯化后，得到浸膏为0.79g，因成型后滴丸最佳工艺基质用量确定为浸膏量的5倍，即3.95g，所以最后滴丸的服用量为4.74g·d^-1，平均每粒滴丸丸重为35mg，有效减少了患者的服用剂量。

综上所述，本发明的中药提取物制备方法，有效保留了中药中的多种活性成分，以得到的该中药提取物为原料所制得滴丸，减少了患者服用剂量，提高了疗效。

一种中药提取物的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。