专利摘要

本发明公开了一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白及其制备方法和应用，具体步骤为：(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种培养后，制成种子液，并接种至诱导培养基A中，静止诱导培养，得诱导工作发酵剂；(2)将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，静止诱导培养，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白培养液；(3)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，清洗后离心，得菌体；(4)在菌体中加入提电子供体蛋白缓冲液，加入溶菌酶，混匀后破壁，破壁溶液经离心后的上清液为降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。粗蛋白液经纯化得到电子供体蛋白。所述电子供体蛋白与亚硝酸盐还原酶的混合液可快速高效降解亚硝酸盐。

权利要求

1.一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于30℃～40℃静止培养18h～36h后，制成种子液；

(2)以1％～10％的体积百分比，将种子液接种至诱导培养基A中，于30℃～40℃静止诱导培养18h～24h，得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO2浓度为5μg/mL～20μg/mL的MRS培养基；

(3)以5％～15％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃～40℃静止诱导培养24h～36h，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白培养液；所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO2浓度为10μg/mL～50μg/mL的MRS培养基；

(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗后离心，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的菌体；

(5)在步骤(4)的菌体中加入提电子供体蛋白缓冲液，使菌体浓度为150mg/mL～400mg/mL，加入溶菌酶，混匀后破壁1h～3h，破壁溶液经离心后的上清液为降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液；所述电子供体粗蛋白液还经过如下分离纯化步骤：

(a)将硫酸铵研成细粉，加入硫酸铵至饱和度为20-30％，缓慢添加并搅拌，于0-4℃冰箱放置2-4h、离心后，收集沉淀溶于HEPES缓冲液；

(b)经硫酸铵沉淀后的电子供体粗蛋白液在50mM、pH7.8的HEPES缓冲液透析，每隔1小时换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全；

(c)透析后的蛋白液再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱和Sephadex G-100葡聚糖凝胶过滤层析中的一种或两种层析，制得降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述电子供体蛋白缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为2μg/mL～10μg/mL和2.0μmol/mL～20.0μmol/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述溶菌酶的浓度为10mg/mL～50mg/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种为Lactobacillus casei subsp.rhamnosus 6013。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，

步骤(c)所述层析是将透析后的蛋白液上样量为20-40mL至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0.5-1.0M的NaCl的100-200mL的HEPES缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱液，测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定电子供体蛋白所在的峰，并且合并所有电子供体蛋白液，并用聚乙二醇20000浓缩；将经过离子交换层析、透析、浓缩后的电子供体蛋白上样于经HEPES缓冲液预平衡好的SephadexG-100葡聚糖凝胶柱；用同一缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，制得纯的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白液。

6.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，

所述离心条件为7000-9000r/min下离心10-20min；

所述阴离子交换层析HEPES缓冲液浓度为20mM～80mM，pH为7.0～8.6。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品领域，为一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacillus caseisubsp.rhamnosus 6013(简称为LCR 6013)中降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法。

背景技术

亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，在蔬菜发酵过程中极易积累，给产品带来潜在的食品安全问题，且过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症，因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常重要。许多研究表明亚硝酸盐是亚硝胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化系统中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。鉴于食品可能存在超标亚硝酸盐污染，肉制品中含有亚硝酸盐的潜在食品安全问题，水产养殖水体亚硝酸盐超标导致潜在食品安全问题等一系列的问题，寻求有效控制或降解亚硝酸盐的方法势在必行，除了加入食用安全的微生物外，还可利用亚硝酸盐还原酶(Nitrite reductase，简称为NiR)进行亚硝酸盐的生物降解。但是NiR是一种氧化还原酶，反应过程中需要电子传递体的参与，而且受氧气的抑制。现在公认的反硝化过程分为4步，分别由不同的还原酶催化。其中NO2-转变成NO由亚硝酸还原酶(NiRs)所催化，其催化反应为：NO2-+e-+2H+→NO+H2O，是反硝化作用区别于其它硝酸盐代谢的标志性反应，在反硝化过程中扮演了重要角色。NiRs分布于细胞壁与细胞膜之间，根据其辅基的不同分为血红素cd 1型亚硝酸还原酶(cd 1-NiRs)和铜型亚硝酸还原酶(Cu-NiRs)两种类型，它们分别以血红素cd 1和Cu作为辅基，每种反硝化细菌具有两种不同形式NiRs中的一种。

微生物降解亚硝酸盐是最常用的方法，主要有乳酸菌属和假单胞菌属。由于假单胞菌可能有毒性，不适合于食品中降亚硝酸盐，从食用安全的乳酸菌干酪乳杆菌中提取亚硝酸盐降解的电子供体蛋白未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，通过层析分离制备纯化亚电子供体蛋白液。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于30℃～40℃静止培养18h～36h后，制成种子液；

(2)以1％～10％的体积百分比，将种子液接种至诱导培养基A中，于30℃～40℃静止诱导培养18h～24h，得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO2浓度为5μg/mL～20μg/mL的MRS培养基；

(3)以5％～15％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃～40℃静止诱导培养24h～36h，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白培养液；所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO2浓度为10μg/mL～50μg/mL的MRS培养基；

(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的菌体；

(5)在步骤(4)的菌体中加入提电子供体蛋白缓冲液，使菌体浓度为150mg/mL～400mg/mL，加入溶菌酶，混匀后破壁1h～3h，破壁溶液经离心后的上清液为降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。

步骤(5)所述溶菌酶的浓度为10mg/mL～50mg/mL。

步骤(5)所述电子供体蛋白缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为2μg/mL～10μg/mL和2.0μmol/mL～20.0μmol/mL。

所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种为Lactobacillus casei subsp.rhamnosus6013。

步骤(5)所述电子供体粗蛋白液还经过如下分离纯化步骤：

(1)将硫酸铵研成细粉，加入硫酸铵至饱和度为20-30％，缓慢添加并搅拌，于0-4℃冰箱放置2-4h、离心后，收集沉淀溶于HEPES缓冲液；

(2)经硫酸铵沉淀后的电子供体粗蛋白液在50mM、pH7.8的HEPES缓冲液透析，每隔1小时换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全；

(3)透析后的蛋白液再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱和Sephadex G-100葡聚糖凝胶过滤层析中的一种或两种层析，制得降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。

所述离心条件为7000-9000r/min下离心10-20min。

所述阴离子交换层析是将透析后的蛋白液上样量为20-40mL至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0.5-1.0M的NaCl的100-200mL的HEPES缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱液，测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定电子供体蛋白所在的峰，并且合并所有电子供体蛋白液，并用聚乙二醇20000浓缩；将经过离子交换层析、透析、浓缩后的电子供体蛋白上样于经HEPES缓冲液预平衡好的SephadexG-100葡聚糖凝胶柱；用同一缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，制得纯的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白液。

所述阴离子交换层析HEPES缓冲液浓度为20mM～80mM，pH为7.0～8.6；

本发明电子供体蛋白降解亚硝酸盐的应用：此电子供体蛋白与NiR按1/5～1/15比例混合，其中反应体系(总体积为1mL)：亚硝酸盐还原酶为0.2mg/mL，亚硝酸盐浓度为100μg/mL，加入纯化后的电子供体蛋白，最后用pH7.4的50mM HEPES缓冲溶液使得反应体系为1mL于30℃下静置反应20h后，灭酶后测定反应体系中亚硝酸盐含量。

从文献报道可知Cu-NiRs中的电子传递在催化过程中包括3个快速的氧化还原过程：(a)T1Cu被外源电子供体还原；(b)分子内电子从T1Cu向T2Cu转移；(c)NO2-在T2Cu中心被还原。在反硝化细菌的周质空间发现一系列小型氧化还原蛋白作为潜在的电子供体传递给NiRs，它们包括细胞色素c(Cyt c)、假天青蛋白(Paz)和天青蛋白(Az)，而本文发现的电子供体蛋白非常可能是细胞色素C，在体外生物氧化过程中作为电子供体传递给NiRs使T1Cu被还原。

本发明所述的电子供体蛋白可以安全运用到食品中，为降解亚硝酸盐提供了一种新的食用安全的电子供体蛋白，为以后的组织缺氧的辅助治疗提供一种新方法。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明中使用的干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacillus casei subsprhamnosus 6013的产电子供体蛋白所需的培养基来源广泛，生产成本低，具有良好的商业前景。

(2)由于干酪乳杆菌鼠李糖亚种LCR 6013是食用安全的，因此从中制备电子供体蛋白也是食用安全的。

(3)本发明所公开的方法可制备的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的数量和性质稳定，不容易损失，为降解蔬菜发酵、肉制品和养殖水体等3个领域中亚硝酸盐提供了一种新方法。

(4)所制备的电子供体蛋白与NiR一起作用于亚硝酸盐，可快速高效降解亚硝酸盐，降解亚硝酸盐的最适合浓度为100μg/mL。

(5)所制备的电子供体蛋白与NiR一起作用的比例为1:5～1:15。

附图说明

图1为实施例1透析后的蛋白液用阴离子交换层析柱DEAE Sepharose Fast Flow分离后的电子供体蛋白质曲线图(其中箭头部分的峰为电子供体蛋白组分)。

图2为实施例1阴离子交换层析后经SephadexG-100葡聚糖凝胶柱分离纯化后的电子供体蛋白曲线图(其中箭头部分的峰为电子供体蛋白组分)。

图3为实施例1中阴离子柱分离后浓缩后电子供体蛋白液的电泳图；其中，电泳条带1、2、3分别指蛋白Marker、细胞色素C、LCR6013的电子供体蛋白液。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1

1、一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，包括如下步骤和工艺条件：

(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于37℃静止培养24h后，制成种子液；所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC 6013，命名为Lactobacillus casei subsp.rhamnosus 6013(简称为LCR 6013)。

(2)以5％体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于37℃静止诱导培养24h，得诱导工作发酵剂。所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO2浓度为10μg/mL的MRS培养基。

(3)以5％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于37℃静止诱导培养24h，含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液。所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO2浓度为10μg/mL的MRS培养基。

(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得到含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的LCR 6013菌体并称重。

(5)加入含胰蛋白酶抑制剂10μg/mL和二硫苏糖醇20.0μmol/mL的电子供体蛋白缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为200mg/mL，加入20mg/mL溶菌酶，混匀后破壁3h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。

2、LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体蛋白还经过如下分离纯化步骤：

(1)将硫酸铵研成细粉，加入硫酸铵至饱和度为30％，缓慢添加并搅拌，于4℃冰箱放置3h，于9000r/min下离心20min后，收集沉淀溶于50mM、pH7.8HEPES缓冲液。

(2)经硫酸铵沉淀后的蛋白液在50mM、pH7.8的HEPES缓冲液透析，每隔1小时换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全，利用硫酸钡检验蛋白液是否还有硫酸铵。

(3)透析后的蛋白液再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱、Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱过滤层析，制得降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。

所述阴离子交换层析是将透析后的蛋白液上样量为30mL至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的50mM、pH7.8的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含1M的NaCl的200mL的HEPES缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱液，测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定电子供体蛋白所在的峰，并且合并所有电子供体蛋白液，如图1所示，箭头所指示的就是电子供体蛋白所在的峰。然后用聚乙二醇20000浓缩；将经过离子交换层析、透析、浓缩后的5mL电子供体蛋白上样于经50mM、pH7.8的HEPES缓冲液预平衡好的SephadexG-100葡聚糖凝胶柱(1.6cm×50cm)。用同一缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，每1.5mL收集一管。测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定最终得到纯的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白，其中图2中箭头指示的就是电子供体蛋白的峰。

此电子供体蛋白与NiR按1：5比例混合，其中反应体系(总体积为1mL)：亚硝酸盐还原酶为0.2mg/mL，亚硝酸盐浓度为100μg/mL，纯化的电子供体蛋白为0.04mg/mL，最后用pH7.4的50mM HEPES缓冲溶液使得反应体系为1mL于30℃下静置反应20h后，灭酶后测定反应体系中亚硝酸盐含量。

具体测定方法为：用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，取1mL待测样品加入到25mL比色管中，加蒸馏水定容至20mL，再分别加入2mL的0.4％对氨基苯磺酸，摇匀，静置5min，最后加入1mL的0.2％盐酸萘乙二胺，用蒸馏水定容25mL，摇匀，静置15min，用分光光度计测定其在538nm的吸光度，该吸光度代入标准曲线方程后，可计算出降解亚硝酸盐的百分含量，单位为μg/mL，经上述条件降解后亚硝酸盐的含量为0.0μg/mL。

3、通过SDS-PAGE电泳确定此电子供体的表观分子量约为13kDa，如图3所示，根据蛋白Marker和细胞色素C的分子量，可推断本技术提纯得到的电子供体蛋白的表观分子量约为13kDa。

实施例2

1、一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，包括如下步骤和工艺条件：

(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于30℃静止培养36h后，制成种子液。

(2)以10％体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于40℃静止诱导培养18h，得诱导工作发酵剂。所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO2浓度为5μg/mL的MRS培养基。

(3)以15％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃静止诱导培养24h，含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液。所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO2浓度为20μg/mL的MRS培养基。

(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得到含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的LCR 6013菌体并称重。

(5)加入含胰蛋白酶抑制剂2μg/mL和二硫苏糖醇10.0μmol/mL的电子供体蛋白缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为250mg/mL，加入10mg/mL溶菌酶，混匀后破壁3h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。

2、LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体蛋白还经过如下分离纯化步骤：

(1)将硫酸铵研成细粉，加入硫酸铵至饱和度为20％，缓慢添加并搅拌，于0℃冰箱放置4h，于9000r/min离心10min后，收集沉淀溶于20mM、pH7.0的HEPES缓冲液。

(2)经硫酸铵沉淀后的蛋白液在20mM、pH7.0的HEPES缓冲液中透析，每隔1小时换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全，利用硫酸钡检验蛋白液是否还有硫酸铵。

(3)透析后的蛋白液再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱、Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱过滤层析制得降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。

所述阴离子交换层析是将透析后的蛋白液上样量为30mL至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的20mM、pH7.0的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含1M的NaCl的100mL的HEPES缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱液，测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定电子供体蛋白所在的峰，并且合并所有电子供体蛋白液，并用聚乙二醇20000浓缩；将经过离子交换层析、透析、浓缩后的8mL电子供体蛋白上样于经20mM、pH7.0的HEPES缓冲液预平衡好的SephadexG-100葡聚糖凝胶柱(1.6cm×50cm)。用同一缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，每1.5mL收集一管。测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定最终得到纯的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。

此电子供体蛋白与NiR按1：15比例混合，其中反应体系(总体积为1mL)：亚硝酸盐还原酶为0.2mg/mL，亚硝酸盐浓度为100μg/mL，纯化的电子供体蛋白为0.013mg/mL，最后用pH 7.4的50mM HEPES缓冲溶液使得反应体系为1mL于30℃下静置反应20h后，灭酶后测定反应体系中亚硝酸盐含量，单位为μg/mL。

具体测定方法为与实施例1相同，经上述条件降解后亚硝酸盐的含量为10.0μg/mL。

3、此电子供体蛋白与NiR混合，都可降解亚硝酸盐，通过SDS-PAGE电泳确定此电子供体的表观分子量为13KDa。

实施例3

1、一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，包括如下步骤和工艺条件：

(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于37℃静止培养24h后，制成种子液；

(2)以1％体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于40℃静止诱导培养24h，得诱导工作发酵剂。所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO2浓度为5μg/mL的MRS培养基。

(3)以10％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃静止诱导培养24h，含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液。所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO2浓度为5μg/mL的MRS培养基。

(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得到含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的LCR 6013菌体并称重。

(5)加入含胰蛋白酶抑制剂10μg/mL和二硫苏糖醇2.0μmol/mL的电子供体蛋白缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为200mg/mL，加入50mg/mL溶菌酶，混匀后破壁3h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。

LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体蛋白还经过如下分离纯化步骤：

(1)将硫酸铵研成细粉，加入硫酸铵至饱和度为30％，缓慢添加并搅拌，于4℃冰箱放置3h，于8000r/min下离心20min，收集沉淀溶于80mM、pH8.6的HEPES缓冲液。

(2)经硫酸铵沉淀后的蛋白液在80mM、pH8.6的HEPES缓冲液透析，每隔1小时换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全，利用硫酸钡检验蛋白液是否还有硫酸铵。

(3)透析后的蛋白液再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱、Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱过滤层析制得降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。

所述阴离子交换层析是将透析后的蛋白液上样量为40mL至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的80mM、pH8.6的HEPES的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含1M的NaCl的200mL的80mM、pH8.6的HEPES S缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱液，测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定电子供体蛋白所在的峰，并且合并所有电子供体蛋白液，并用聚乙二醇20000浓缩；将经过离子交换层析、透析、浓缩后的10mL电子供体蛋白上样于经HEPES缓冲液预平衡好的SephadexG-100葡聚糖凝胶柱(1.6cm×50cm)。用同一缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，每1.5mL收集一管。测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定最终得到纯的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。。

此电子供体蛋白与NiR按1：10比例混合，其中反应体系(总体积为1mL)：亚硝酸盐还原酶为0.2mg/mL，亚硝酸盐浓度为100μg/mL，纯化的电子供体蛋白为0.02mg/mL，最后用pH 7.4的50mM HEPES缓冲溶液使得反应体系为1mL于30℃下静置反应20h后，灭酶后测定反应体系中亚硝酸盐含量，单位为μg/mL。

具体测定方法为与实施例1相同，所测得降解亚硝酸盐的百分含量为2.0μg/mL。

3、此电子供体蛋白与NiR混合，都可降解亚硝酸盐，通过SDS-PAGE电泳确定此电子供体的表观分子量为13KDa。

实施例4

1、一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，包括如下步骤和工艺条件：

(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于37℃静止培养24h后，制成种子液；

(2)以5％体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于37℃静止诱导培养24h，得诱导工作发酵剂。所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO2浓度为10μg/mL的MRS培养基。

(3)以10％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃静止诱导培养24h，含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液。所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO2浓度为15μg/mL的MRS培养基。

(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得到含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的LCR 6013菌体并称重。

(5)加入含胰蛋白酶抑制剂8μg/mL和二硫苏糖醇10.0μmol/mL的电子供体蛋白缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为200mg/mL，加入20mg/mL溶菌酶，混匀后破壁3h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。

LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体蛋白还经过如下分离纯化步骤：

(1)将硫酸铵研成细粉，加入硫酸铵至饱和度为20％，缓慢添加并搅拌，于4℃放置2h，于8000r/min下离心20min后，收集沉淀溶于50mM、pH7.8的HEPES缓冲液。

(2)经硫酸铵沉淀后的蛋白液于在50mM、pH7.8的HEPES缓冲液透析，每隔1小时换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全，利用硫酸钡检验蛋白液是否还有硫酸铵。

(3)透析后的蛋白液再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱、Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱过滤层析制得降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。

所述阴离子交换层析是将透析后的蛋白液上样量为40mL至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的50mM、pH7.8的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含1M的NaCl的100mLHEPES缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱液，测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定电子供体蛋白所在的峰，并且合并所有电子供体蛋白液，并用聚乙二醇20000浓缩；将经过离子交换层析、透析、浓缩后的5mL电子供体蛋白上样于经50mM、pH7.0的HEPES缓冲液预平衡好的SephadexG-100葡聚糖凝胶柱(1.6cm×50cm)。用同一缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，每1mL收集一管。测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定最终得到纯的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。。

此电子供体蛋白与NiR按1：8比例混合，其中反应体系(总体积为1mL)：亚硝酸盐还原酶为0.2mg/mL，亚硝酸盐浓度为100μg/mL，纯化的电子供体蛋白为0.025mg/mL，最后用pH7.4的50mM HEPES缓冲溶液使得反应体系为1mL于30℃下静置反应20h后，灭酶后测定反应体系中亚硝酸盐含量，单位为μg/mL。

具体测定方法为与实施例1相同，经上述条件降解后亚硝酸盐的百分含量为2.5μg/mL。

3、此电子供体蛋白与NiR混合，都可降解亚硝酸盐，通过SDS-PAGE电泳确定此电子供体的表观分子量为13KDa。

实施例5

1、一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，包括如下步骤和工艺条件：

(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于30℃静止培养36h后，制成种子液；

(2)以8％体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于37℃静止诱导培养24h，得诱导工作发酵剂。所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO2浓度为10μg/mL的MRS培养基。

(3)以8％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于37℃静止诱导培养24h，含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液。所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO2浓度为20μg/mL的MRS培养基。

(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得到含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的LCR 6013菌体并称重。

(5)加入含胰蛋白酶抑制剂10μg/mL和二硫苏糖醇20.0μmol/mL的电子供体蛋白缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为200mg/mL，加入20mg/mL溶菌酶，混匀后破壁3h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。

2、LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体蛋白还经过如下分离纯化步骤：

(1)将硫酸铵研成细粉，加入硫酸铵至饱和度为20％，缓慢添加并搅拌，于4℃冰箱放置4h，于8000r/min下离心20min后，收集沉淀溶于50mM、pH7.8的HEPES缓冲液。

(2)经硫酸铵沉淀后的蛋白液在50mM、pH7.8的HEPES缓冲液透析，每隔1小时换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全，利用硫酸钡检验蛋白液是否还有硫酸铵。

(3)透析后的蛋白液再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱、Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱过滤层析制得降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。

所述阴离子交换层析是将透析后的蛋白液上样量为30mL至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的50mM、pH7.8的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0.8M的NaCl的100mL的HEPES缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱液，测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定电子供体蛋白所在的峰，并且合并所有电子供体蛋白液，并用聚乙二醇20000浓缩；将经过离子交换层析、透析、浓缩后的8mL电子供体蛋白上样于经50mM、pH8.0的HEPES缓冲液预平衡好的SephadexG-100葡聚糖凝胶柱(1.6cm×50cm)。用同一缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，每1mL收集一管。测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定最终得到纯的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。。

此电子供体蛋白与NiR按1：12比例混合，其中反应体系(总体积为1mL)：亚硝酸盐还原酶为0.2mg/mL，亚硝酸盐浓度为100μg/mL，纯化的电子供体蛋白为0.017mg/mL，最后用pH 7.4的50mM HEPES缓冲溶液使得反应体系为1mL于30℃下静置反应20h后，灭酶后测定反应体系中亚硝酸盐含量，单位为μg/L。

具体测定方法为与实施例1相同，经上述条件降解后亚硝酸盐的含量为5.2μg/mL。

3、此电子供体蛋白与NiR混合，都可降解亚硝酸盐，通过SDS-PAGE电泳确定此电子供体的表观分子量为13KDa。

实施例6

1、一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，包括如下步骤和工艺条件：

(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于35℃静止培养30h后，制成种子液。

(2)以5％体积百分比，将LCR 6013种子液接种至诱导培养基A中，于35℃静止诱导培养28h，得诱导工作发酵剂。所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO2浓度为20μg/mL的MRS培养基。

(3)以10％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃静止诱导培养24h，含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液。所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO2浓度为15μg/mL的MRS培养基。

(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得到含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的LCR 6013菌体并称重。

(5)加入含胰蛋白酶抑制剂10μg/mL和二硫苏糖醇20.0μmol/mL的电子供体蛋白缓冲液，使LCR 6013菌体浓度为400mg/mL，加入20mg/mL溶菌酶，混匀后破壁3h，破壁溶液经离心后的上清液为LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。

2、LCR 6013降解亚硝酸盐的电子供体蛋白还经过如下分离纯化步骤：

(1)将硫酸铵研成细粉，加入硫酸铵至饱和度为20％，缓慢添加并搅拌，于4℃冰箱放置4h，于9000r/min下离心10min后，收集沉淀溶于50mM、pH8.0的HEPES缓冲液。

(2)经硫酸铵沉淀后的蛋白液在50mM、pH7.8的HEPES缓冲液透析，每隔1小时换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全，利用硫酸钡检验蛋白液是否还有硫酸铵。

(3)透析后的蛋白液再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱、Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱过滤层析制得降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。

所述阴离子交换层析是将透析后的蛋白液上样量为40mL至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含1M的NaCl的100mL的50mM、pH7.4的HEPES缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱液，测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定电子供体蛋白所在的峰，并且合并所有电子供体蛋白液，并用聚乙二醇20000浓缩；将经过离子交换层析、透析、浓缩后的5mL电子供体蛋白上样于经50mM、pH7.8的HEPES缓冲液预平衡好的SephadexG-100葡聚糖凝胶柱(1.6cm×50cm)。用同一缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，每1mL收集一管。测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定最终得到纯的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。

此电子供体蛋白与NiR按1：10比例混合，其中反应体系(总体积为1mL)：亚硝酸盐还原酶为0.2mg/mL，亚硝酸盐浓度为100μg/mL，纯化的电子供体蛋白为0.002mg/mL，最后用pH 7.4的50mM HEPES缓冲溶液使得反应体系为1mL于30℃下静置反应20h后，灭酶后测定反应体系中亚硝酸盐含量，单位为μg/L。

具体测定方法为与实施例1相同，经上述条件降解后亚硝酸盐的含量为1.5μg/mL。

3、此电子供体蛋白与NiR混合，都可降解亚硝酸盐，通过SDS-PAGE电泳确定此电子供体的表观分子量为13KDa。

一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。