专利摘要

本发明公开了一种微生物转化制备羟基螺内酯的方法，所述方法为：以雅致小克银汉霉（Cunninghamellaelegans）ATCC9245经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以螺内酯为底物，以无水乙醇为助溶剂，于原发酵液或pH6.8的磷酸缓冲液中构成转化体系，在25～32℃、150～300r/min恒温振荡条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯；本发明生物转化法合成了2种羟基螺内酯，利尿作用较原螺内酯有一定的提高；用作生物催化剂的微生物菌株安全无毒，培养条件简单，抗杂菌污染能力强，易于大规模培养；转化操作简便，反应过程中不需要使用任何其他试剂，转化收率高，成本低，易于实现工业化应用。

权利要求

1.一种螺内酯衍生物，其特征在于所述螺内酯衍生物为式（Ⅰ）所示12β-羟基-螺内酯或式（Ⅱ）所示2α-羟基-螺内酯：

2.一种微生物转化法制备权利要求1所述螺内酯衍生物的方法，其特征在于所述方法为：以雅致小克银汉霉（Cunninghamella elegans）ATCC9245经发酵培养获得的含菌发酵液或发酵液离心后的湿菌体与pH6.8的磷酸缓冲液制成的含菌体悬液为生物催化剂，以螺内酯为底物，以无水乙醇为助溶剂构成反应体系，在25～32℃、150～300r/min恒温振荡条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯；所述生物催化剂的用量以含湿菌体重量计为30～40g/L转化体系，所述底物的初始浓度为20～80mg/L转化体系，所述无水乙醇的体积终浓度为0.2～0.8%。

3.如权利要求1所述微生物转化法制备螺内酯衍生物的方法，其特征在于所述生物催化剂的质量用量以含湿菌体重量计为35g/L转化体系，所述底物的初始浓度为60mg/L转化体系，所述无水乙醇的体积终浓度为0.6%。

4.如权利要求2所述微生物转化法制备螺内酯衍生物的方法，其特征在于所述转化反应时间为1～3天。

5.如权利要求2所述微生物转化法制备螺内酯衍生物的方法，其特征在于所述生物催化剂的制备方法为：

（1）菌种活化培养：将雅致小克银汉霉ATCC9245接种到马铃薯琼脂培养基，25～32℃培养2～4天，获得雅致小克银汉霉ATCC9245的孢子；

（2）种子扩大培养：从步骤（1）经活化培养的平板上用棉签蘸取孢子转接到马铃薯液体培养基，于25～32℃、150～300r/min振荡培养2～3天，获得种子液；

（3）菌体发酵培养：将步骤（2）制备的种子液以体积浓度1～5%的接种量接种于马铃薯液体培养基中，于25～32℃、150～300r/min振荡培养2～4天，获得含菌发酵液，将发酵液离心，去上清，收集沉淀即为湿菌体，将湿菌体悬浮于pH6.8的磷酸缓冲液制成含菌体悬液。

6.如权利要求2所述微生物转化法制备螺内酯衍生物的方法，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：将反应液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯连续萃取2～3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压蒸馏除去乙酸乙酯后用无水甲醇溶解并过滤，滤液进行MCI柱色谱分离，以体积浓度30～70%的乙醇水溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，收集体积浓度70%洗脱液的流出液，流出液减压浓缩去除洗脱液，即可得到含12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯的混合液；将混合液进行HPLC分离，以体积比1:1的甲醇和水混合溶液作为流动相，流速1mL/min，检测波长240nm，分别收集含目标组分的流出液，将流出液分别减压浓缩后真空干燥，分别获得12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯。

7.一种权利要求1所述式（Ⅰ）所示12β-羟基-螺内酯或式（Ⅱ）所示2α-羟基-螺内酯在制备利尿药物中的应用。

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种羟基螺内酯的合成方法，特别涉及一种以雅致小克银汉霉（Cunninghamella elegans）ATCC9245为生物催化剂，以螺内酯为底物制备12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯的新方法。

（二）背景技术

螺内酯（spironolactone），化学名为17β-羟基-3-氧-7α-(乙酰硫基)-17α-孕甾-4-烯-21-羧酸-γ-内酯，临床药物又称安体舒通（antisterone），分子结构为式（Ⅲ）所示：

螺内酯在细胞水平上和醛固酮竞争性地与醛固酮特异性受体结合，因此减弱了醛固酮的生物学作用；它在远端肾小管与醛固酮竞争性的与受体结合，从而抑制钠与钾的交换，具有利尿作用。自1957年问世的此后40多年里，因其利尿降压作用较弱，须与其他降压药合用才能起效。近些来的研究表明醛固酮受体几乎分布于整个机体的钠转运部位，包括心肌和血管，螺内酯具有抑制或逆转心肌间质重塑、抑制或逆转血管重塑、扩张血管和抗高血压作用、对血离子的有益影响与血管紧张素转化酶抑制剂有协同作用等心血管作用，临床治疗的疾病种类在扩大。目前临床应用于慢性心功能不全，慢性肾功能衰竭，高血压，肝硬化，原发性醛固酮增多症以及一些皮肤病等疾病的治疗。

生物转化研究是发现新一代的先导化合物的有力工具，也是指导药物结构修饰，从而获得高效长效下一代新药的有效方法，例如从硝苯啶（nifedipine）到络活喜（amlodipine），足可说明生物转化研究与新药开发的重要关系。

微生物转化是利用微生物代谢过程中产生的一个或一系列的酶对底物特定部位或基团进行催化反应，从而获得新的化合物的方法。微生物来源广泛，种类繁多，其自身一般都具有一套特殊的酶系，以及具备生物量积累快、转化时间短、酶的表达活性高等特点，且易应用于工业化生产，因此，利用微生物转化生产药物或对药物进行结构修饰是近年来研究的热点之一。

羟基化是最重要的微生物转化反应，其专一性较强，主要是碳氢化合物中非活泼C-H键的羟基化。传统有机化学合成几乎不能进行这样的直接羟化反应。微生物及其酶体系能够对某些药物的C-H键进行羟基化，以提高药物生物活性或制备中间体，特别是在甾体药物合成过程中，微生物转化法进行羟基化，有效地提高了甾体类药物的生物活性和水溶性。

本发明利用微生物细胞对使用多年的老药物螺内酯进行生物转化，旨在获得结构修饰的新化合物，使其生物活性较原螺内酯有一定提高，扩大该药物的临床疗效或应用范围。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种螺内酯衍生物及制备方法与应用，所述制备方法以螺内酯为底物，经微生物转化制备12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯的方法，该方法催化效率高、反应条件温和、环境友好、成本低廉，易于工业化应用等优点。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种螺内酯衍生物，所述螺内酯衍生物为式（Ⅰ）所示12β-羟基-螺内酯或式（Ⅱ）所示2α-羟基-螺内酯：

本发明还提供一种微生物转化法制备螺内酯衍生物的方法，所述方法为：以雅致小克银汉霉（Cunninghamella elegans）ATCC9245经发酵培养获得的含菌发酵液或发酵液离心后的湿菌体与pH6.8的磷酸缓冲液制成的含菌体悬液为生物催化剂，以螺内酯为底物，以无水乙醇为助溶剂构成反应体系（优选先用无水乙醇溶解螺内酯，然后再与生物催化剂混合），在25～32℃、150～300r/min恒温振荡条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯；所述生物催化剂的质量用量以含湿菌体重量计为30～40g/L转化体系（优选35g/L），所述底物的初始浓度为20～80mg/L转化体系（优选60mg/L），所述无水乙醇的体积终浓度为0.2～0.8%（优选0.6%），此外本发明所述的无水乙醇用于溶解螺内酯，无水乙醇体积加入量以螺内酯质量计为100mL/g。

进一步，优选所述转化反应时间为1～3天。

进一步，本发明所述生物催化剂的制备方法为：

（1）菌种活化培养：将雅致小克银汉霉ATCC9245接种到马铃薯琼脂培养基（PDA），25～32℃培养2～4天，获得雅致小克银汉霉的孢子；所述马铃薯琼脂培养基终浓度39g/L，其质量组成为：马铃薯淀粉0.4%，葡萄糖2%，琼脂1.5%，溶剂为水，自然pH值（优选6.5），优选购自美国EMD Millipore Chemicals；

（2）种子扩大培养：从步骤（1）经活化培养的平板上用棉签蘸取孢子转接到种子培养基（即马铃薯液体培养基，PDB），于25～32℃、150～300r/min振荡培养2～3天，获得种子液；所述的种子培养基终浓度24g/L，其质量组成为：马铃薯淀粉0.4%，葡萄糖2%，溶剂为水，自然pH值（优选6.5），优选购自美国EMD Millipore Chemicals；

（3）菌体发酵培养：将步骤（2）制备的种子液以体积浓度1～5%的接种量接种于发酵培养基中，于25～32℃、150～300r/min振荡培养2～4天（即培养到湿菌体得率达到30～40g/L），获得发酵培养液，将发酵培养液离心，去上清，收集沉淀即为湿菌体，将湿菌体悬浮于pH6.8的磷酸缓冲液制成含菌体悬液；所述发酵培养基组成同步骤（2）的种子培养基。

进一步，本发明所述反应液分离纯化的方法为：将反应液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯连续萃取2～3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压蒸馏除去乙酸乙酯后用无水甲醇溶解并过滤，滤液进行MCI柱色谱分离，以体积浓度30～70%（优选30%、40%、50%、60%、70%）的乙醇水溶液作为洗脱液，收集70%乙醇水溶液收集的流出液，流出液减压蒸干，即可得到含12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯的混合液；将混合液进行HPLC分离，以体积比1:1的甲醇和水混合溶液作为流动相，流速1mL/min，检测波长240nm，分别收集这两个产物的出峰时间内的流出液，将流出液分别减压浓缩后真空干燥，分别获得12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯。

本发明还提供了一种所述螺内酯衍生物制备利尿药物中的应用，特别是式（Ⅰ）所示12β-羟基-螺内酯或式（Ⅱ）所示2α-羟基-螺内酯在制备利尿药物中的应用。

本发明所述雅致小克银汉霉（Cunninghamella elegans）ATCC9245购自美国模式培养物保藏中心（American Type Culture Collection）。

本发明的生物转化法合成12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯可扩大到发酵罐水平，保持步骤、培养基和培养条件不变。发酵培养和生物转化在机械搅拌通风式发酵罐中进行，为了保证菌体生长所需的氧气条件，通常需要300～500r/min的搅拌和0.5～1.0v/v·min通气量。

本发明的采用高效液相色谱和全波长扫描对产物进行跟踪和浓度分析，采用电喷雾电离液相色谱质谱（ESI-LC-MS)、红外光谱（IR）和核磁共振（NMR）对转化产物的分子量和结构进行鉴定。

本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明生物转化法合成了2种羟基螺内酯，是目前未报道过的新化合物，具有较原底物螺内酯更好的利尿功能；(2)用作生物催化剂的微生物菌株安全无毒，培养条件简单，抗杂菌污染能力强，易于大规模培养；(3)转化操作简便，反应过程中不需要使用任何其他试剂，转化收率高，成本低，易于实现工业化应用；(4)常温常压下就能实现生物转化反应，反应条件温和，环境友好，是一种清洁合成工艺。

（四）附图说明

图1羟基螺内酯生物转化合成的反应过程示意图。

图2HPLC对转化产物的跟踪分析图谱，曲线1为实施例2中提取液a的HPLC图谱；曲线2为实施例2中提取液b的HPLC图谱；曲线3为实施例2中阴性对照提取液c的HPLC图谱；曲线4为实施例2中阴性对照提取液d的HPLC图谱；曲线5为实施例2中空白对照提取液e的HPLC图谱；曲线6为实施例3中纯化产物Ⅰ的HPLC图谱；曲线7为实施例3中纯化产物Ⅱ的HPLC图谱。

图3转化产物的光谱吸收特征图谱。

图4转化产物的HMBC和¹H-¹H COSY相关信号图。

图5转化产物Ⅰ的红外光谱图。

图6转化产物Ⅱ的红外光谱图。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：生物催化剂的制备

（1）菌种活化培养：将雅致小克银汉霉（Cunninghamella elegans）ATCC9245（购自美国模式培养物保藏中心）接种到马铃薯琼脂培养基，28℃恒温培养3天，得该菌的孢子。所述的马铃薯琼脂（PDA）培养基（购自美国EMD Millipore Chemicals），按说明书加蒸馏水溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min；

（2）种子扩大培养：从步骤（1）经活化培养的平板上用棉签蘸取孢子转接到1只装有50mL种子培养基的三角瓶中，于28℃、250r/min恒温振荡培养3天，获得种子液。所述的种子培养基为马铃薯液体（PDB）培养基（购自美国EMD Millipore Chemicals），按说明书加蒸馏水溶解，50mL分装于250mL三角烧瓶，121℃高压蒸汽灭菌15min；

(3)菌体发酵培养：将步骤（2）制备的种子液分别以体积浓度2%的接种量依次接种于2只装有50mL发酵培养基的三角瓶中，于28℃、250r/min恒温振荡培养3天，获得含菌体的发酵培养液共100mL，含3.28g湿菌体。所述发酵培养基为PDB培养基，按说明书加蒸馏水溶解，50mL分装于250mL三角烧瓶，121℃高压蒸汽灭菌15min。

实施例2螺内酯的生物转化产物的跟踪分析

取实施例1方法制备的雅致小克银汉霉ATCC9245含菌体发酵液50mL，含1.64g湿菌体；1mg螺内酯用0.1mL无水乙醇溶解，再加入到发酵液中构成反应体系（总体积以50mL计），在28℃、250r/min条件下恒温振荡转化4天，转化培养结束后，用纱布过滤使菌体与培养液分离，菌体用50mL的无水甲醇在25℃、100KHz条件下超声浸提30min，过滤除去菌体，滤液减压蒸干甲醇，获得浓缩物，浓缩物用0.5mL无水甲醇溶解并过滤，获得提取液a，待分析；培养液用50mL的乙酸乙酯萃取，减压蒸干乙酸乙酯，获得浓缩物，浓缩物用0.5mL的无水甲醇溶解并过滤，获得提取液b，待分析。

同样条件下，实施例1方法制备的雅致小克银汉霉ATCC9245含1.64g湿菌体的发酵液50mL做阴性对照，用纱布过滤使菌体与培养液分离，菌体和滤液按上述方法提取，获得菌体提取液c和培养液提取液d；以50mL的PBD培养基中加入底物，但不接种雅致小克银汉霉ATCC9245菌体的培养作为空白对照，培养液用50mL乙酸乙酯萃取，按上述方法获得提取液e。

用高效液相色谱色谱法（HPLC）分别分析菌株对螺内酯转化后的菌体提取液a和培养液提取液b，其中雅致小克银汉霉ATCC9245的转化培养液（提取液b）中，底物螺内酯的浓度大幅度下降（见图2所示），残留浓度仅为加入量的6.8%。在其出峰的保留时间前面，有2个光谱吸收特征与底物相似的峰出现，而菌体提取液a、阴性对照的提取液c和提取液d以及空白对照的提取液e相同方法分析，均未出现这2个峰，见图2所示。可以推断螺内酯在培养液中被生物转化，电喷雾液相色谱-质谱（ESI-LC-MS）分析表明，这个物质的分子量均为432，较螺内酯的分子量416增加了16，初步推断螺内酯分子上发生了羟基化反应。

由上述研究得出：雅致小克银汉霉ATCC9245可以生物转化螺内酯得到2种羟基螺内酯。

所述HPLC分析方法为：高效液相色谱仪为Agilent1200型，DAD检测器；色谱柱为Agilent Eclipse Plus C₁₈(5mm，4.6×150mm)，流动相为乙腈和水，30～70%乙腈25min内梯度洗脱，流速1mL/min；检测波长为240nm。

实施例3：生物催化剂的制备

（1）菌种活化培养：将雅致小克银汉霉（Cunninghamella elegans）ATCC9245接种到马铃薯琼脂（PDA）培养基，28℃恒温培养3天，得该菌的孢子。所述PDA培养基按说明书加蒸馏水溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min；

（2）种子扩大培养：从步骤（1）经活化培养的平板上用棉签蘸取孢子转接到4只装有50mL种子培养基的三角瓶中，于28℃、250r/min恒温振荡培养3天，获得种子液。所述的种子培养基为PDB培养基，按说明书加蒸馏水溶解，50mL分装于250mL三角烧瓶，121℃高压蒸汽灭菌15min；

(3)菌体发酵培养：将步骤（2）制备的种子液分别以体积浓度2%的接种量依次接种于20只装有500mL发酵培养液的瓶中，于28℃、250r/min恒温振荡培养3天，获得含菌体的发酵培养液10L，含325.5g湿菌体。所述发酵培养基为PDB培养基，按说明书加蒸馏水溶解，500mL分装于2L三角烧瓶，121℃高压蒸汽灭菌15min。

实施例4：螺内酯转化产物的制备与结构鉴定

取实施例3方法雅致小克银汉霉ATCC9245含菌体发酵液10L，含湿菌体325.5g。取螺内酯600mg用60mL的无水乙醇溶解后加入发酵液中构成反应体系（总体积以10L计），于28℃、250r/min恒温振荡反应4天，反应结束制得转化液；将转化液用4层纱布过滤，获得菌体和9.6L滤液。滤液用10L的乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯，减压蒸馏除去乙酸乙酯，得残留物1.39g，用10mL无水甲醇溶解并过滤，滤液上MCI柱色谱，依次用体积浓度30、40、50、60、70%的乙醇水溶液洗脱，收集体积浓度70%乙醇水溶液的流出液183mL，减压浓缩至1.5mL后用HPLC进行纯化，最终纯化得到60mg的转化产物Ⅰ和7mg的转化产物Ⅱ。

所述的HPLC纯化方法是：Agilent1200型高效液相色谱仪，DAD检测器，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C₁₈(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为甲醇和水（体积比1:1），流速1mL/min，检测波长240nm。进样后，待产物出峰时，立刻收集检测器端的流出液，出峰结束时停止收集，获得收集液Ⅰ和收集液Ⅱ，最后分别将收集液，减压蒸干，再于45℃真空干燥，获得产物Ⅰ和产物Ⅱ。

转化产物Ⅰ和产物Ⅱ的电喷雾质谱（ESI-MS）在正离子模式下均显示准分子离子峰m/z357.2[M-HSCOCH₃]⁺、m/z455.2[M+Na]⁺及m/z887.3[2M+Na]⁺，表明它们的分子量均为432，较底物螺内酯分子量416增加了16，提示转化产物Ⅰ和产物Ⅱ可能均为羟化螺内酯。

转化产物Ⅰ的红外光谱（见图3所示）在3396cm^-1处显示强羟基吸收峰，其¹H NMR图谱在δ_H3.65(1H,dd,J=10.8,4.5Hz)处出现羟基化的次甲基质子信号，¹³C NMR谱在δ_C72.3处显示羟基化次甲基的信号，进一步提示转化产物Ⅰ为螺内酯的羟基化产物。转化产物Ⅰ的HMBC谱中显示H-12(δ_H3.65)与C-13(δ_C49.5)、C-17(δ_C95.5)及C-18(δ_C9.3)之间存在相关峰，H-18(δ_H1.00)、H-11(δ_H1.78,1.46)与C-12(δ_C72.3)之间存在相关峰，表明羟基与C-12相连，这一点可进一步通过其¹H-¹H COSY谱中H-11与H-12之间的相关信号得到确证。位于δ_H3.65(dd,J=10.8,4.5Hz)处的H-12的较大耦合常数提示C-12上所连羟基的构型为β，ROESY谱中H-12与H-9、H-14的相关信号可进一步证实该推断，由此可确定转化产物Ⅰ为12β-羟基螺内酯。

转化产物Ⅱ的红外光谱（见图6所示）于3450cm^-1处显示强羟基吸收峰，其UV和NMR图谱与转化产物I相似，主要区别在于转化产物Ⅰ、Ⅱ的羟基化次甲基在各自NMR谱中的化学位移值略有不同，说明转化产物Ⅱ也是螺内酯的羟基化产物，仅羟基所连位置与转化产物Ⅰ不同。该化合物HMBC谱中显示H-2(δ_H4.15)与C-1(δ_C39.2)和C-3(δ_C199.2)之间，H-1(δ_H2.47,1.56)、H-4(δ_H5.76)与C-2(δ_C68.8)之间存在相关信号，¹H-¹H COSY图谱中显示H-1(δ_H2.47,1.56)与H-2(δ_H4.15)之间存在相关峰，说明该化合物中的羟基与C-2相连。根据位于δ_H4.15(dd,J=13.8,5.7Hz)处的H-2的耦合常数，可推定羟基的构型为α，由此可确定转化产物Ⅱ为2α-羟基螺内酯。

12β-羟基螺内酯：白色无定型粉末；[α]²³_D-14.0(c0.10，MeOH)；IR(KBr)ν_max3396，2961，1763，1661cm^-1；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)和¹³C NMR(CDCl₃，75MHz)的具体数据见表1；ESI-MS:[M-HSCOCH₃]⁺m/z357.2，[M+Na]⁺m/z455.2，[2M+Na]⁺m/z887.3。

2α-羟基螺内酯：白色无定型粉末；[α]²³_D-125.5(c0.11，MeOH)；IR(KBr)ν_max3450，2953，1769，1686cm^-1；¹H NMR(CDCl₃，300MHz)和¹³C NMR(CDCl₃，75MHz)的具体数据见表1；ESI-MS:[M-HSCOCH₃]⁺m/z357.2，[M+Na]⁺m/z455.2，[2M+Na]⁺m/z887.3。

表1转化产物Ⅰ和Ⅱ的¹H(300MHz)和¹³C(75MHz)NMR数据(CDCl₃,δin ppm,J in Hz)

实施例5螺内酯的生物转化

按实施3方法制备的雅致小克银汉霉ATCC9245含菌体发酵液1L，用4层纱布过滤，弃去滤液得湿菌体35.8g。将湿菌体悬浮于964.2mL的pH6.8的磷酸缓冲液中制成含菌悬液，80mg的螺内酯溶解于8mL的无水乙醇中，加入含菌悬液中构成反应体系（总体积以1L计），在30℃、200r/min条件下恒温振荡转化4天。转化反应结束后，用纱布过滤使菌体与缓冲液分离，缓冲液用1L的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，减压蒸馏除去乙酸乙酯，得残留物71.6mg，用1mL无水甲醇溶解并过滤，滤液上MCI柱色谱，依次用体积浓度30、40、50、60、70%的乙醇水溶液洗脱，收集70%乙醇水溶液的流出液94mL，将流出液经减压浓缩至0.5mL，HPLC对浓缩物进行分析，12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯的浓度分别为72.5mg/mL和9.43mg/mL，即80mg的螺内酯底物，经过生物转化、提取和分离纯化，得到了36.4mg的12β-羟基-螺内酯和4.72的mg的2α-羟基-螺内酯，收率分别为45.3%和5.89%，总收率为51.2%。

实施例6羟基螺内酯的利尿作用实验

实验动物:体重20±2g小鼠（购置浙江省实验动物中心），雌雄各半，饲养条件：湿度40%，温度25℃，市售普通小鼠饲料饲喂。取实验用小鼠30余只，用灌胃法给生理盐水，利用代谢笼收集尿液，24h后计算尿量，再除以灌胃量，能达到40%以上者可用于以下利尿实验。

取经过上述排尿功能筛选合格的小鼠20只，随机分为4组，每组5只，分别为生理盐水阴性对照组，螺内酯阳性对照组，12β-羟基螺内酯实验组和2α-羟基-螺内酯实验组。实验小鼠先禁食不禁水24h，以减少粪便的干扰，之后阴性对照组小鼠给以0.5mL/只的生理盐水灌胃，各给药组小鼠按0.5mL/只的药量灌胃，螺内酯阳性对照组、12β-羟基螺内酯实验组和2α-羟基-螺内酯实验组的给药浓度均为0.8mg/mL，即折算成给药剂量为20mg/kg。

给药后，将五组小鼠分别放入代谢笼内，收集给药后4h内的每只小鼠的总尿液，并分别用火焰光度法和硝酸银滴定法测定各鼠尿液中的Na⁺、K⁺、Cl^-的浓度。比较各组小鼠总尿液量和各离子浓度有无显著差异，采用组件t检验进行统计分析，分析结果见表2。

表2螺内酯及羟基螺内酯对小鼠的利尿作用

由实验数据统计分析表明：三个给药组的小鼠排尿量与生理盐水阴性对照组比较均有极显著差异(P<0.01)，说明螺内酯及2种羟基螺内酯均能显著提高小鼠的排尿量；12β-羟基螺内酯组和2α-羟基-螺内酯组的小鼠排尿量与螺内酯阳性对照组比较，均有显著差异(P<0.05)，说明2种羟基螺内酯利尿功能较螺内酯有所提升，分别提高了23.6%和19.2%；12β-羟基螺内酯组和2α-羟基-螺内酯组之间比较，小鼠排尿量无显著差异（(P>0.05)。

对各组小鼠尿液中Na⁺、K⁺、Cl^-结果表明：给药组小鼠尿液中的Na⁺和Cl^-浓度较生理盐水阴性对照组有极显著差异(P<0.01)，说明螺内酯及2种羟基螺内酯均能显著增加小鼠尿中Na⁺和Cl^-离子的排泄，但K⁺浓度较生理盐水阴性对照组无显著差异(P>0.05)，说明对螺内酯及2种羟基螺内酯对K+排泄无影响；与螺内酯阳性对照组相比，12β-羟基螺内酯2α-羟基-螺内酯给药组的小鼠尿液中Na⁺、K⁺、Cl^-浓度均无显著差异(P>0.05)，说明12β-羟基螺内酯2α-羟基-螺内酯在排钠储钾的功能与原螺内酯相同。

一种螺内酯衍生物及其微生物转化制备方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。