专利摘要

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种1,3‑[2H,4H]‑异喹啉二酮衍生物及其制备方法和应用。所述1,3‑[2H,4H]‑异喹啉二酮衍生物结构通式如通式(1)所示，其中，R基为H、F、Cl、Br、－CH3、‑OCH3、甲硫基、乙基、氨基和乙酰基中的一种或两种；R1基为H、F、Cl、Br、－CH3、‑OCH3、甲硫基、乙基、氨基和乙酰基中的一种或两种；R2基为－CH3、乙基、乙酰基、苄基、丙烯基和苯基中的一种。本发明的1,3‑[2H,4H]‑异喹啉二酮衍生物对鲍曼不动杆菌群体感应系统有着较好的抑制作用，大大减小了鲍曼不动杆菌的危害，且制备方法简单，制备出来的产品可以作为生物膜抑制剂应用于制备抗感染手性药物。

权利要求

1.一种1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物，其特征在于，其结构通式如通式(1)所示：

其中，R基为H、F、Cl、Br、－CH3、-OCH3、甲硫基、乙基、氨基和乙酰基中的一种或两种；

R1基为H、F、Cl、Br、－CH3、-OCH3、甲硫基、乙基、氨基和乙酰基中的一种或两种；

R2基为苄基。

2.根据权利要求1所述的1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物，其特征在于，所述1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物包括如下具体结构式：

中的任意一种。

3.一种如权利要求1或2任一项所述的1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物的制备方法，其特征在于，反应方程式如下：

上述反应方程式的具体反应步骤如下：

A、化合物b和化合物c混合于甲醇溶液中，接着在室温和充满N2的环境中反应48小时，得到催化剂cat，化合物b与化合物c和甲醇溶液的摩尔比例为1： (1.2～2.5)：(100～500)；

在方程式(1)中，R3基为H和－CH3中的一种，MeOH为甲醇溶液，rt代表室温；

B、如方程式(2)所示，化合物f偶氮二甲酸二叔丁酯和步骤A中得到的催化剂cat在室温下反应25～35min,接着加入化合物e后在二氯甲烷溶液中反应45～50小时，得到溶液，将溶液蒸发至固体，最后将所述固体通过快速柱色谱法过滤后，得到化合物g；

在方程式(2)中，cat为步骤A中得到的催化剂，DCM为二氯甲烷，rt代表室温。

4.根据权利要求3所述的1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤B中，加入化合物e后在二氯甲烷溶液中反应45～50小时的反应过程用TLC分析监测反应,将反应溶液点在薄层板上，利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成,当原料斑点消失的时候，反应完成。

5.根据权利要求3所述的1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤B中，所述蒸发采用旋转蒸发器。

6.根据权利要求3所述的1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤B中，所述快速柱色谱法采用的500mL的洗脱剂洗涤，洗脱剂中己烷和乙酸乙酯的体积比为(50～20)：1。

7.根据权利要求3至6任一项所述的1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤B中，所述化合物f偶氮二甲酸二丁酯、化合物e和催化剂cat的摩尔比为(0.015～0.099)：0.03:0.1。

8.根据权利要求3至6任一项所述的1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤A中，在室温和充满N2的环境中反应48小时，得到催化剂cat；

在步骤B中，化合物f偶氮二甲酸二丁酯和步骤A中得到的催化剂cat在室温下反应30min,接着加入化合物e后在二氯甲烷溶液的环境中反应48小时得到溶液。

9.一种如权利要求1或2任一项所述1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物作为细菌生物膜抑制剂在制备抗感染手性药物上的应用。

10.一种抗感染手性药物，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体的涉及一种1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是非发酵的革兰氏阴性杆菌，其强大的获得耐药性和克隆传播能力已经引起了全球的广泛关注，广泛耐药和全面耐药的鲍曼不动杆菌也一再被报道，其中58％的菌种显示多重耐药性。鲍曼不动杆菌也是院内感染的主要致病细菌之一，尤其是在重症监护室(ICU)，死亡率高达43％。该菌在医院内部的持续传播和反复发作已是困扰各大医院并亟待解决的严峻问题。近年来，国内外临床实践和研究结果均证明细菌的耐药性、慢性感染疾病难以治愈和反复发作都与细菌的生物膜密切相关。生物膜长期存活于人体的组织里以及附着于医疗器械的表面，使细菌减少受脱水、环境变化、紫外光和抗生素的作用的影响。生物膜顽固的黏附性和致密性对游离细菌的保护，致使广泛应用的抗生素无法有效渗透并破坏生物膜彻底杀死膜内外所有细菌，生物膜可使得细菌对抗生素的耐药性增加10-1000倍。尤其是超级细菌的出现使人们对有效控制和破坏细菌生物膜从而控制感染和传播的需求异常迫切。因此，对细菌生物膜抑制剂的研究、开发具有极其重要的医学价值。手性药物(chiral drug)，是指药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物与镜像的对映异构体。每一对化学纯的对映异构体的理化性质有所不同(不仅仅体现在旋光性上)，根据不同的命名法则可以被命名为R-型或S-型、D-型或L-型、左旋或右旋。

群体感应(Quorum Sensing，QS)是指微生物群体在其生长过程中，由于群体密度的增加，导致其生理和生化特性的变化，显示出少量菌体或单个菌体所不具备的特征。这个变化的原因在于：当环境中微生物种群密度达到阈值，信号分子的浓度也达到一定的水平，通过包括受体蛋白在内相关蛋白的信号传递，诱导或抑制信号最终传递到胞内，影响特定基因的表达，调控微生物群体的生理特征，如生物发光、抗生素合成、生物膜形成等。所以信号分子在细菌生物膜形成中发挥了重要作用，应用群体感应信号分子拮抗剂来抑制细菌致病因子表达可以达到治疗的目的，被国内外学者认为是目前研究耐药性问题很好的突破口。一些研究者通过合成出化合物干扰自体诱导信号分子可以干扰细菌的QS系统，使之对抗生物细菌生物膜的形成，降低细菌致病性的同时又不使细菌产生耐药性。

到目前为止，对鲍曼不动杆菌生物膜抑制剂的开发明显不足，国内科学工作者主要采用中药提取液如苦参、金银花和连翘等进行研究，并取得一定成效。缺点是中药提取液成分复杂，结构不明确，不能为研发更有效的生物膜抑制剂提供活性成分和构效关系方面的指导。

发明内容

本发明为了解决上述背景技术中的技术问题，提供一种能够对鲍曼不动杆菌生物膜进行抑制的一种1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物及其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物，其结构通式如通式(1)所示：

其中，R基为F、Cl、Br、－CH₃、-OCH₃、甲硫基、乙基、氨基和乙酰基中的一种或两种；

R¹基为F、Cl、Br、－CH₃、-OCH₃、甲硫基、乙基、氨基和乙酰基中的一种或两种；

R²基为－CH₃、乙基、乙酰基、苄基、丙烯基和苯基中的一种。

本发明1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物的有益效果是：

1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物对鲍曼不动杆菌群体感应系统有着较好的抑制作用，确定的结构通式能够有效的进行生产，大大减小了鲍曼不动杆菌的危害，为抗感染手性药物提供了很好的抑制剂。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物包括如下具体结构式：

中的任意一种。

采用上述进一步方案的有益效果是，3a～3t总共20种化合物能均能有效对鲍曼不动杆菌群体感应系统有着较好的抑制作用，减小鲍曼不动杆菌的危害。

本发明还提供上述1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物的制备方法，反应方程式如下：

具体包括如下反应步骤：

A、化合物b和化合物c混合于甲醇溶液中，接着在室温和充满N₂的环境中反应48小时，得到催化剂cat，化合物b与化合物c和甲醇溶液的摩尔比例为1；(1.2～2.5)：(100～500)；

在方程式(1)中，R₃基为H和－CH₃中的一种，MeOH为甲醇溶液，OEt代表对苯二甲酸乙二醇酯，rt代表室温；

B、如方程式(2)所示，化合物f偶氮二甲酸二丁酯和步骤A中得到的催化剂cat在室温下反应25～35min,接着加入化合物e后在二氯甲烷溶液中反应45～50小时，得到溶液，将溶液蒸发至固体，最后将所述固体通过快速柱色谱法过滤后，得到化合物g；

在方程式(2)中，cat为步骤A中得到的催化剂，DCM为二氯甲烷，rt代表室温。

本发明1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物的制备方法的有益效果是：

首先合成催化剂cat,然后化合物e和化合物f在催化剂cat的作用下发生反应，制备得到成品g。本发明的制备方法流程少，工艺简单高效，能够有效的生产1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物。通过蒸发器将溶剂蒸发去除，得到固体的初级产品。然后通过快速柱色谱法对得到的固体进行分离除去杂质，得到化合物g。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，在步骤B中，加入化合物e后在二氯甲烷溶液中反应45～50小时的反应过程用TLC分析监测反应,将反应溶液点在薄层板上，利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成,当原料斑点消失的时候，反应完成。

采用上述进一步方案的有益效果是，TLC称为薄层色谱，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。本发明可以将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。可以根据需要将反应溶液点成若干条线，利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成，原料斑点消失反应完成。有效的监控了反应的进行，提高了成功率。

进一步，在步骤B中，所述蒸发采用旋转蒸发器。

采用上述进一步方案的有益效果是，旋转蒸发器适用于回流操作、大量溶剂的快速蒸发、微量组分的浓缩和需要搅拌的反应过程等。能够快速将溶剂蒸发去除，留下所需的固体初级产品。

进一步，在步骤B中，所述快速柱色谱法采用的500mL的洗脱剂洗涤，洗脱剂中己烷和乙酸乙酯的体积比为(50～20)：1。

采用上述进一步方案的有益效果是，快速柱色谱法是一种快速而且容易的分离复杂混合物的方法。本发明的快速柱色谱法使用快速柱色谱，己烷和乙酸乙酯作为洗脱剂，己烷和乙酸乙酯的体积比为(50～20)：1，将固体产品内的杂质有效的进行去除，得到化合物g。

进一步，在步骤B中，所述化合物f偶氮二甲酸二丁酯、化合物e和催化剂cat的摩尔比为(0.015～0.099)：0.03:0.1。

采用上述进一步方案的有益效果是，具体的摩尔比能够让最终得到的化合物g的品质更好。

进一步，在步骤A中，在室温和充满N₂的环境中反应48小时得到催化剂cat；

在步骤B中，化合物f偶氮二甲酸二丁酯和步骤A中得到的催化剂cat在室温下反应30min,接着加入化合物e后在二氯甲烷溶液的环境中反应48小时得到溶液。

采用上述进一步方案的有益效果是，在具体的温度和反应时间的条件下，这个制备过程更加的顺利，得到的化合物g品质更好。

本发明还提供一种上述所述1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物作为细菌生物膜抑制剂在制备抗感染手性药物上的应用，所述1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物作为细菌生物膜抑制剂用于合成抗感染手性药物。

本发明的有益效果是，由于1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物具有很好的抑制生物膜的性能，所以在合成抗感染手性药物的过程中，能够让抗感染手性药物具有很好的抑制生物膜的性能，从而也就减小了鲍曼不动杆菌的耐药性，从而起到更好的药效。

本发明还提供一种抗感染手性药物，包括上述1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物。

附图说明

图1为本发明化合物3a～3t的生物膜比色分析的吸光度柱形图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1制备3a化合物

一种1,3-[2H,4H]-异喹啉二酮衍生物的制备方法，反应方程式如下：

具体包括如下反应步骤：

A、如方程式(1)所示，1mol化合物b和2mol化合物c混合于100mol的甲醇溶液中，接着在室温和充满N₂的环境中反应48小时，得到催化剂cat；

在方程式(1)中，R₃基为H或－CH₃中的一种，MeOH为甲醇溶液，OEt代表对苯二甲酸乙二醇酯，rt代表室温；

B、如方程式(2)所示，0.033mol的化合物f偶氮二甲酸二丁酯和0.1mol步骤A中得到的催化剂cat,在25℃下反应30min,接着加入0.03mol的化合物e后在二氯甲烷溶液的环境中反应48小时,得到溶液，将溶液通过蒸发器蒸发至固体，最后将所述固体经过快速柱色谱法过滤后，得到15.4mg的化合物g，快速柱中己烷和乙酸乙酯的体积比为(50～20)：1，化合物g为白色固体，产率为92％，熔点为183.3-183.8℃，旋光度:[α]21.5D＝-28.06(c0.9,CHCl₃)。

在方程式(2)中，DCM为二氯甲烷，rt代表室温。R²基为苄基，R基和R¹基为H。

化合物g的HRMS检测数据如下所示：

HRMS(ESI-TOF)m/z:分子式为C₃₂H₃₅N₃O₆Na，检测值[M+Na]⁺＝580.2424,计算值580.2417；

通过高效液相色谱得出对映体过量百分数为90.38％。[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝97:3,0.5mL/min]:19.2min(major),31.2min(minor)；

从上述数据能毫无疑义的得出，本实施例1制备的化合物g的结构式如下所示，即为本发明所要保护的化合物3a，其化学名称为(S)-二叔丁基1-(2-苄基-1,3-二氧代-4-苯基-1,2,3,4四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3a):

其中，92％为产率，ee为对映体过量百分数。

实施例2、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为－CH₃，R¹基为H，化合物g得到化合物3b。化合物3b的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-7-甲氧基-1,3-二氧代-4-苯基-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3b):

白色固体,17.4mg,99％yield.mp:149.0-149.4℃；

Optical rotation:[α]17.1D＝-32.94(c 0.7,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₃H₃₇N₃O₇Na 610.2529,found610.2529；

The enantiomeric excess was determined to be 88.55％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝97:3,0.5mL/min]:18.9min(major),38.7min(minor)；

实施例3、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为乙酰基，R¹基为H，化合物g得到化合物3c。化合物3c的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

白色固体,17.0mg,99％yield.mp:175.8–177.5℃；

Optical rotation:[α]17.4D＝+10.13(c 0.4,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₃H₃₇N₃O₆Na 594.2580,found594.2571；

The enantiomeric excess was determined to be 97.29％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝99:1,1.0mL/min]:12.6min(major),19.5min(minor)；

实施例4、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为-OCH₃，R¹基为H，化合物g得到化合物3d。化合物3d的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(4-甲氧基苯基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3d):

白色固体,17.4mg,99％yield.mp:155.1-155.6℃.

Optical rotation:[α]17.4D＝-104.97(c 0.4,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₃H₃₇N₃O₇Na 610.2529,found610.2528；

The enantiomeric excess was determined to be 91.52％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝97:3,0.5mL/min]:24.5min(major),32.4min(minor)；

实施例5、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为甲硫基，R¹基为H，化合物g得到化合物3e。化合物3e的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(4-(甲硫基)苯基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3e):

白色固体,16.8mg,93％yield.mp:178.1-178.4℃；

Optical rotation:[α]15.0D＝-78.07(c 0.6,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₃H₃₇N₃O₆SNa 626.2301,found626.2302；

The enantiomeric excess was determined to be 93.17％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝97:3,0.5mL/min]:20.5min(major),30.1min(minor)；

实施例6、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为甲硫基，R¹基为H，化合物g得到化合物3f。化合物3f的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(4-氟苯基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3f):

白色固体,17.1mg,99％yield.mp:162.9-163.5℃；

Optical rotation:[α]21.2D＝-24.14(c 0.8,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₂H₃₄N₃O₆FNa 598.2329,found598.2307；

The enantiomeric excess was determined to be 78.95％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝97:3,0.5mL/min]:14.5min(major),27.7min(minor)；

实施例7、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为F，R¹基为H，化合物g得到化合物3g。化合物3g的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(3-氟苯基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3g):

白色固体,16.2mg,94％yield.mp:196.3-196.5℃；

Optical rotation:[α]19.3D＝-40.95(c 0.9,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₂H₃₄N₃O₆FNa 598.2329,found598.2331；

The enantiomeric excess was determined to be 95.61％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝99:1,1.0mL/min]:18.2min(major),38.4min(minor)；

实施例8、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为Cl，R¹基为H，化合物g得到化合物3h。化合物3h的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(3-氯苯基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3h):

白色固体,17.6mg,99％yield.mp:199.6-200.2℃；

Optical rotation:[α]17.5D＝+15.07(c 0.5,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₂H₃₄N₃O₆ClNa 614.2034,found614.2032；

The enantiomeric excess was determined to be 98.89％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝99:1,1.0mL/min]:15.9min(major),39.7min(minor)；

实施例9、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为乙酰基，R¹基为H，化合物g得到化合物3i。化合物3i的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(4-(3-乙酰基苯基)-2-苄基-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3i):

白色固体,17.4mg,97％yield.mp:80.0-81.0℃；

Optical rotation:[α]17.4D＝-74.44(c 0.8,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₄H₃₇N₃O₇Na 622.2529,found622.2513；

The enantiomeric excess was determined to be 98.79％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝97:3,0.5mL/min]:26.8min(major),62.6min(minor)；

实施例10、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为－CH₃，R¹基为H，化合物g得到化合物3j。化合物3j的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-1,3-二氧代-4-(间甲苯基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3j):

白色固体,16.1mg,94％yield.mp:104.1-105.2℃；

Optical rotation:[α]18.7D＝-45.45(c 0.3,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₃H₃₇N₃O₆Na 594.2580,found594.2582；

The enantiomeric excess was determined to be 96.18％by HPLC.[IAcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝90:10,1.0mL/min]:10.1min(major),13.4min(minor)；

实施例11、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为-OCH₃，R¹基为H，化合物g得到化合物3k。化合物3k的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(3-甲氧基苯基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3k):

白色固体,17.3mg,98％yield.mp:160.8-161.0℃；

Optical rotation:[α]21.5D＝-47.94(c 0.8,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₃H₃₇N₃O₇Na 610.2529,found610.2511；

The enantiomeric excess was determined to be 97.59％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝99:1,0.5mL/min]:37.4min(major),57.0min(minor)；

实施例12、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为-CH₃，R¹基为H，化合物g得到化合物3l。化合物3l的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-1,3-二氧代-4-(邻甲苯基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3l):

白色固体,15.3mg,93％yield.mp:145.2-146.1℃；

Optical rotation:[α]16.9D＝-12.50(c 0.3,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₃H₃₇N₃O₆Na 594.2580,found594.2568；

The enantiomeric excess was determined to be 48.59％by HPLC.[ICcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝97:3,0.5mL/min]:25.4min(major),34.3min(minor)；

实施例13、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为两个Cl，R¹基为H，化合物g得到化合物3m。化合物3m的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(3,4-二氯苯基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3m):

白色固体,18.6mg,99％yield.mp:184.2-185.0℃；

Optical rotation:[α]21.2D＝-37.43(c 0.9,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₂H₃₃N₃O₆Cl₂Na 648.1644,found648.1626；

The enantiomeric excess was determined to be 93.73％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝97:3,0.5mL/min]:14.5min(major),22.6min(minor)；

实施例14、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为F和Cl,R¹基为H，化合物g得到化合物3n。化合物3n的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(3-氯-4-氟苯基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3n):

白色固体,17.4mg,95％yield.mp:172.8-173.9℃；

Optical rotation:[α]17.0D＝-71.16(c0.6,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₂H₃₃N₃O₆ClFNa 632.1940,found632.1929；

The enantiomeric excess was determined to be 94.94％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝99:1,1.0mL/min]:12.6min(major),36.3min(minor)；

实施例15、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为两个－CH₃，R¹基为H，化合物g得到化合物3o。化合物3o的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(3,4-二甲基苯基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3o):

白色固体,16.6mg,98％yield.mp:189.9-190.3℃；

Optical rotation:[α]15.3D＝-71.84(c 0.4,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₄H₃₉N₃O₆Na 586.2917,found586.2907；

The enantiomeric excess was determined to be 98.73％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝97:3,0.5mL/min]:13.5min(major),16.5min(minor)；

实施例16、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为两个－CH₃，R¹基为H，化合物g得到化合物3p。化合物3p的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(3,5-二甲基苯基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3p):

白色固体,16.5mg,94％yield.mp:195.2-195.8℃；

Optical rotation:[α]16.8D＝-97.46(c 0.3,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₄H₃₉N₃O₆Na 608.2737,found608.2715；

The enantiomeric excess was determined to be 99.34％by HPLC.[IAcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝97:3,0.5mL/min]:17.8min(major),36.9min(minor)；

实施例17、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为两个－OCH₃，R¹基为H，化合物g得到化合物3q。化合物3q的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-苄基-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3q):

白色固体,17.8mg,99％yield.mp:171.0-171.8℃；

Optical rotation:[α]21.2D＝-42.85(c 1.2,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₃H₃₅N₃O₈Na 624.2322,found624.2303；

The enantiomeric excess was determined to be 98.57％by HPLC.[IAcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝85:15,1.0mL/min]:17.4min(major),23.8min(minor)；

实施例18、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为两个乙基，R¹基为H，化合物g得到化合物3r。化合物3r的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(萘-2-基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3r):

白色固体,17.3mg,95％yield.mp:95.0-95.1℃；

Optical rotation:[α]21.3D＝-40.89(c 0.6,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+H]⁺calculated for C₃₆H₃₈N₃O₆608.2761,found608.2752；

The enantiomeric excess was determined to be 96.46％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝99:1,1.0mL/min]:17.4min(major),29.0min(minor)；

实施例19、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为氨基和乙基，R¹基为H，化合物g得到化合物3s。化合物3s的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(1H-吲哚-5-基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3s):

白色固体,16.6mg,93％yield.mp:107.8-108.2℃；

Optical rotation:[α]15.5D＝-59.09(c 0.8,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+H]⁺calculated for C₃₄H₃₆N₄O₆H 597.2713,found597.2711；

The enantiomeric excess was determined to be 97.30％by HPLC.[IAcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝90:10,1.0mL/min]:26.5min(major),31.3min(minor)；

实施例20、

与实施例1不同的是，R²基为苄基，R基为甲硫基和－CH₃，R¹基为H，化合物g得到化合物3t。化合物3t的产物的性状、旋光性、质谱和高效液相色谱均测试如下所示：

(S)-二叔丁基1-(2-苄基-4-(4-甲氧基苯基)-1,3-二氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-4-基)肼-1,2-二羧酸酯(化合物3t):

白色固体,18.2mg,85％yield.mp:179.2-180.5℃；

Optical rotation:[α]21.5D＝-55.58(c 0.7,CHCl₃)；

HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+Na]⁺calculated for C₃₄H₃₅N₃O₆SNa 636.2144,found636.2130；

The enantiomeric excess was determined to be 94.09％by HPLC.[OD-Hcolumn,230nm,n-hexane:IPA＝97:3,0.5mL/min]:21.2min(major),33.0min(minor)；

上的数据可以看出，本发明生成的化合物g的结构式3a～3t确实如理论值一样，证明了合成的化合物g是成功的。对上述3b～3t结构式的yield(产率)和ee(对映体过量百分数)均统计如下：

测定效果实验

取上述实施例制备的化合物3a～3t，进行最低抑菌浓度测试(MIC)和生物膜抑制效果测试。

一、最低抑菌浓度测试(MIC)

最低抑菌浓度测试(MIC)具体的方法如下；

1、供试菌液的制备

取鲍曼不动杆菌，无菌操作接种于LB培养基中，37℃振荡培养18～24h，制备得到供试菌液。

2、细菌MIC的测定

测定细菌的MIC根据临床实验室标准化协会所制定方法测定MIC。分别取化合物3a～3t各2.7mg，用无菌蒸馏水配制成浓度为1024μg/ml的抗生素原液；

取三组每组11支灭菌试管并编号，每支试管中等量加入MHB肉汤1.0ml备用，取化合物3a～3t的抗生素原液1.0ml加入第一支试管，振荡器混匀后从第一支试管中取1.0ml加入第二支试管，按此方法等倍稀释至第十管，第十管吸取1.0ml弃之，第十一管为对照管；依次制备其它两组抗生素溶液。在上述三组十一支试管中均加入含鲍曼不动杆菌浓度为105cfu/ml菌液50μl；将上述三组十一支试管放入37℃恒温培养箱中培养过夜；比较试管中液体浑浊情况，液体清亮的试管中最低的抗生素浓度即为其对鲍曼不动杆菌的MIC。根据MIC确定菌株是否属于耐药菌株。

3、检测结果

化合物3a～3t的MIC如表1所示。

表1化合物1-20的MIC值

从表1可以看出，化合物3a～3t对鲍曼不动杆菌生长基本无影响，可有效避免鲍曼不动杆菌应激产生耐药性。

二、生物膜抑制效果测试

将3a～3t的化合物做生物膜抑制效果测试,其方法如下：

1、生物膜的培养

使用96孔聚苯乙烯板构建生物膜，取20个孔，每孔加入190μL鲍曼不动杆菌，接着每个孔分别加入10μL的3a～3t化合物溶液，可使鲍曼不动杆菌浓度达到106CFU/mL，3a～3t化合物浓度达到100μM，即为目标浓度。生物膜抑制活性测试中使用上述已达到目标浓度的3a～3t的20个化合物，每个化合物平行测定8孔，每孔加入190μL鲍曼不动杆菌，放入电热恒温培养箱中37℃静止培养24h。

2、结晶紫染色法

a:培养24h后，将96孔聚苯乙烯板取出并且将其每个孔中的菌液吸出，再用双蒸水反复冲洗两次(200μL/孔)，以去除鲍曼不动杆菌；

b:接着将双蒸水吸出，加入95％乙醇溶液(200μL/孔)，固定生物膜30min；

c:接着将固定液去除，具体为每个孔均自然风干后，加入1％结晶紫染液(200μL/孔)，在室温下染色10min；

d:接着丢弃染液，具体为用流水把多余的染液冲洗干净；

e:接着把培养板倒置在滤纸上除去残余的水，并室温凉干或在37℃烘箱中烘干；

f:接着完全干燥后，每个孔内加入36％乙酸溶液(200μL/孔)，在电热恒温培养箱中以37℃作用30min以溶解结晶紫；

h:最后将96孔聚苯乙烯板的每个孔在590nm单波长条件下，用ELX800型酶联免疫检测仪测定培养孔中溶液的吸光度值(OD₅₉₀)值；

3、结果

试验数值去掉最高值和最低值，计算平均值和标准差。以未加目标化合物，以200μL的LB培养基作为空白对照。其中，3a～3t化合物对鲍曼不动杆菌(A.baumannii)生物膜抑制活性测试结果见表2。

表2化合物对鲍曼不动杆菌(A.baumannii)生物膜形成能力影响测试结果

注：OD₅₉₀值表示为平均值±标准差，当实验组数据平均值<阴性对照组数据平均値，说明其存在的生物膜少，说明了相应的化合物对相应的菌株生物膜形成具有抑制作用。

从表2可以看出，化合物均对细菌生物膜有较好抑制作用，具有进一步研究开发前景。将表2制成图1，横坐标为阳性对照和1～25的化合物，纵坐标为吸光度值(OD₅₉₀)。从图1中可以更直观的看出化合物均对细菌生物膜有较好的抑制作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

一种1，3-[2H，4H]-异喹啉二酮衍生物及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

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