专利摘要
本发明公开了一种磷脂型多不饱和脂肪酸的酶法制备方法。该方法采用由游离脂肪酸、多不饱和脂肪酸甘油酯、多不饱和脂肪酸乙酯、磷脂和水组成的反应体系，按质量比，游离脂肪酸：磷脂＝10～30:100；多不饱和脂肪酸甘油酯：磷脂＝50～300:100；多不饱和脂肪酸乙酯：磷脂＝10～30:100；水：磷脂＝1～5:100。制得控制反应温度为30～80℃；反应时间为6～48hr；控制催化剂的加入量为底物质量的1‐5％；反应得到磷脂型多不饱和脂肪酸。该方法具有实施方便，反应效率高的优点。
权利要求
1.一种磷脂型多不饱和脂肪酸的酶法制备方法，其特征在于，采用脂肪酶和/或磷脂酶为催化剂，催化剂为具有脂肪酶活力的酶制剂，酶制剂选用固定化方式，采用A、B、C、D和E五种组分为底物的催化体系，进行催化反应，控制反应温度为30～80℃；反应时间为6～48hr；控制催化剂的加入量为底物质量的1-5％；
A：游离脂肪酸型PUFA；
B：甘油酯型PUFA；
C：乙酯型PUFA；
D：磷脂；
E：水
其中，A:B:C:E:D的质量比为10～30:50～300:10～30:1～5:100；
反应完成后，滤去固定化酶，洗涤，得到磷脂型多不饱和脂肪酸；
所述磷脂选用大豆磷脂和蛋黄磷脂中的一种或两种的混合物。
2.根据权利要求1所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的酶法制备方法，其特征在于，所述的脂肪酶和/或磷脂酶的来源为根霉属、曲霉属、毛霉属、细菌、酵母菌或动物胰脏。
3.根据权利要求1所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的酶法制备方法，其特征在于，所述的洗涤为用丙酮洗涤。
4.根据权利要求1所述的磷脂型多不饱和脂肪酸的酶法制备方法，其特征在于，所述的催化剂的加入量为底物质量的2-4％。
说明书
技术领域
本发明涉及多不饱和脂肪酸，特别是涉及一种具有健康功能的一种磷脂型多不饱和脂肪酸的酶法制备方法。
背景技术
多不饱和脂肪酸(PUFA)指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸。通常分为omega－3和omega－6，在PUFA分子中，距羧基最远端的双键在倒数第3个碳原子上的称为omega‐3脂肪酸，如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等；在第六个碳原子上的，则称为omega‐6脂肪酸，如花生四烯酸等。PUFA通常都具有显著的生理功能，是人体不可缺少的营养成分。
PUFA产品通常分为乙酯型、甘油三酯型和磷脂型几种。其中甘油三酯型和磷脂型属于天然结构，也就是，在生物体内天然存在的结构，而乙酯型属于非天然结构，之所以存在乙酯型，是因为在多不饱和脂肪酸的分离、浓缩过程，需要PUFA转化为单体，脂肪酸乙酯是一种易于生产加工的结构。
对于不同结构的PUFA产品，人们关心的是哪种结构更好一些。早在1988年，TarryD.等人就比较了乙酯型、甘油酯型和脂肪酸型的鱼油产品，表明脂肪酸型最容易吸收，其次是甘油三酯型，最差是乙酯型，之后的研究也进一步验证了该结论。磷虾油中含有大量磷脂型的PUFA，很多宣传宣称磷虾油具有更高的生物利用度。针对磷脂型和甘油三酯型PUFA的生物利用度，人们进行研究，结果表明，二者的生物利用度大体相当，表明磷脂型PUFA也是一种优秀的结构。另外，磷脂本身就具有健康功能，将磷脂和PUFA结合起来，可以获得二者的复合作用，所以磷脂型PUFA是一种重要的产品形式。天然来源的磷脂型PUFA，一般源于南极磷虾油。由于磷虾油成本高，通过人工的方式合成磷脂型PUFA就成为另一种获取途径。
改变磷脂的脂肪酸构成，一般可以选择酯交换反应或者酸解反应。酯交换反应是选用目的脂肪酸的酯类化合物和磷脂上的脂肪酸进行交换；酸解反应是采用游离脂肪酸和磷脂上的脂肪酸进行交换。由于磷脂具有很高的极性，通常要选择和其极性接近的底物与其反应，反应效率才会更高。研究表明，磷脂和几乎所有的酯化形式的PUFA反应效率都很低。酸解反应时，由于脂肪酸的极性和磷脂更加接近，反应效率得以大幅度提高。PUFA供体的形式对于反应很重要，现有的报道多为游离脂肪酸型；也有采用酯化形式的PUFA，但反应过程中需要添加水，推测实际反应机理PUFA仍然主要是以游离脂肪酸的形式与磷脂发生反应。采用游离脂肪酸作为PUFA的供体，存在以下缺点：第一，脂肪酸型的PUFA的制备通常是采用化学水解的方式，制备成本高，反应产物的后分离更复杂；第二，制备的磷脂型PUFA颜色较深。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺点，提供一种底物容易获得，反应效率高，制备的磷脂型PUFA颜色较浅的磷脂型多不饱和脂肪酸的酶法制备方法。
本发明提供一种新型反应体系，开发了一种适用于酶法高效转化，同时又可以获得高质量产物的反应体系，克服了传统游离脂肪酸型PUFA作为供体制备磷脂型PUFA的缺点。
一种磷脂型多不饱和脂肪酸的酶法制备方法：采用脂肪酶和/或磷脂酶为催化剂，催化剂为具有脂肪酶活力的酶制剂，酶制剂选用固定化方式，采用A、B、C、D和E五种组分为底物的催化体系，进行催化反应，控制反应温度为30～80℃；反应时间为6～48hr；控制催化剂的加入量为底物质量的1‐5％；
A：游离脂肪酸型PUFA；
B：甘油酯型PUFA；
C：乙酯型PUFA；
D：磷脂；
E：水
其中，A:B:C:E:D的质量比为10～30:50～300:10～30:1～5:100；
反应完成后，滤去固定化酶，洗涤，得到磷脂型多不饱和脂肪酸。
所述磷脂选用大豆磷脂和蛋黄磷脂中的一种或两种的混合物。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述的脂肪酶和/或磷脂酶的来源为根霉属、曲霉属、毛霉属、细菌、酵母菌或动物胰脏。
所述的催化剂的加入量为底物质量的2‐4％。
本发明脂肪酸可以采用任何方式获得游离脂肪酸。脂肪酸在磷脂的修饰反应中发挥重要作用，本发明中的反应底物必需要包含一定量的游离脂肪酸，而且，该游离脂肪酸是在反应零时刻就存在的。之所以要求反应零时刻要包含一定量的游离脂肪酸，主要原因在于游离脂肪酸可以抑制磷脂的过度水解。本发明所需要的游离脂肪酸，可以采用化学水解法获得，也可以采用酶法水解法获得，优选以甘油酯型PUFA为底物采用酶解方法获得。
本发明反应体系中包含了一定量的乙酯型多不饱和脂肪酸。乙酯型多不饱和脂肪酸和磷脂具有良好的相容性，可以大幅度降低磷脂粘度，对于提高反应体系的传质具有重要作用。通过监控反应过程中乙酯型多不饱和脂肪酸成分的变化。乙酯型多不饱和脂肪酸的变化要落后与脂肪酸型PUFA，推测乙酯型多不饱和脂肪酸优先和脂肪酸型PUFA发生交换，然后脂肪酸型PUFA再和磷脂发生反应。
本发明反应体系中需要水的参与，对于磷脂脂肪酸的置换反应，其反应历程似乎和甘油酯不同，采用酶法改变甘油酯中的脂肪酸，可以采用近乎无水的反应体系，而磷脂脂肪酸的改变，需要先生成溶血性磷脂或者甘油磷酰化合物，然后再以酯化的方式结合目的脂肪酸。一般酶制剂本身包含水分，水分的量往往影响反应效率，一般反应系统中水分的量控制为磷脂的1～5％(w/w)。
由于反应中有水的参与，水优先和磷脂发生水解反应，磷脂会丢失一个或者2个脂肪酸，生成溶血性磷脂或者甘油磷酰化合物，这些生成物又和脂肪酸反应生成磷脂和水，同时，系统中甘油酯、乙酯和游离脂肪酸之间不断在发生脂肪酸交换反应，以此模式，使得反应系统中各底物中脂肪酸不断发生交换。
本发明所述反应催化剂的加入量可以取底物质量的1‐5％；反应温度为30～80℃；反应时间为6～48hr。
本发明反应体系中，磷脂可以选用大豆磷脂、蛋黄磷脂中的一种或两种的混合物。磷虾油占南极磷酰的湿重的2～5％，主要的成分包括卵磷脂33‐36％，磷脂酰乙醇胺5‐6％，中性甘油酯33‐40％，游离脂肪酸8‐16％。磷虾油中的磷脂中EPA和DHA的含量一般在35％以内，可以通过酶法转化进一步提高含量获得加入其它功能性的PUFA。蛋黄磷脂和大豆磷脂中通常不包含大量的功能性PUFA，来源丰富，成本较低，是PUFA的重要载体。
本发明反应体系中，催化剂为具有脂肪酶活力的酶制剂，酶制剂可以选用固定化方式的，也可以选用游离酶，但是，优选固定化酶。固定化酶反应器可以采用任何形式的反应器，优选填充床反应器。具有脂肪酶活力的酶制剂包括脂肪酶或磷脂酶A1/A2，它们通常的来源为根霉属、曲霉属、毛霉属、细菌、酵母菌或动物胰脏。通常，脂肪酶和磷脂酶A1/A2的界限不是很严格，脂肪酶对磷脂底物也具有水解活性，磷脂酶A1/A2对甘油三酯底物也具有水解活性。
相对于现有技术，本发明具有如下优点：
1)底物容易获得。本发明所采用的PUFA供体主要为甘油酯型PUFA和乙酯型PUFA，这两种物质均为批量化制造的商品，容易采购取材，而游离脂肪酸型PUFA因其容易氧化，没有该原料供应。而且，游离脂肪酸型PUFA需要以以前两种物质为前体制备，制备过程对抗氧化有着严格要求。
2)具有良好的反应效率。通常，在生产磷脂型PUFA时，采用游离脂肪酸型的PUFA作为底物进行反应效率最高。研究表明，采用本发明反应体系，同样可以获得和游离脂肪酸型的PUFA为底物时类似的反应效率，可以认为，本发明反应体系具有良好的反应效率。
3)可以获得浅色的磷脂型PUFA。研究表明，反应产物的颜色和游离脂肪酸型PUFA的用量有相关性，颜色产生的机理尚不清楚。本发明反应体系由于采用更少的游离脂肪酸型PUFA，可以获得更加浅色的磷脂型PUFA产品。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式不限如此。
下面实施例中的主要原材料：
PUFA甘油酯，以质量百分比计，包含EPA60％，DPA6％，DHA10％，舟山新诺佳生物工程有限公司生产。
PUFA乙酯，以质量百分比计，包含EPA60％，DPA6％，DHA10％，舟山新诺佳生物工程有限公司生产。
脂肪酸型PUFA，以质量百分比计，包含EPA60％，DPA6％，DHA10％，舟山新诺佳生物工程有限公司生产。
大豆磷脂，美国ADM公司出品。
蛋黄磷脂，陕西嘉德生物工程有限公司出品。
自制固定化磷脂酶，采用Lecitase Ultra(Novozymes公司的一种磷脂酶A1产品)，用Purolite ECR1030M吸附固定化，以质量百分比计，酶的载量为树脂的12.1％。
脂肪酸组成分析：对于本发明相关的游离脂肪酸型多不饱和脂肪酸、甘油酯型多不饱和脂肪酸、乙酯型多不饱和脂肪酸和磷脂等组分的脂肪酸组成分析均采用如下方法：取待分析物约30mg，加入到50ml圆底烧瓶中，再加入0.5M的KOH甲醇溶液2ml，置于70℃水浴回流皂化反应约10分钟，反应过程不时振荡，至油脂溶解，适当冷却2分钟，然后加入3mlBF3甲醇溶液，置于70℃水浴回流反应5分钟，使甲酯化完全。然后冷却，加入2ml正己烷，轻轻摇荡以促进甲酯在正己烷中的溶解。然后加入饱和食盐水使正己烷上升至瓶口，稍等约1分钟，吸取上层正己烷相于装有少量无水Na2SO4的样品瓶进行气相色谱分析。参考“GB/T17377‐2008动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析”进行分析。
实施例1‐6
按照表1所示的催化体系混合反应底物，然后加入一定量的固定化酶(采用树脂Purolite ECR1030M吸附固定化的Lecitase Ultra，Lecitase Ultra是一种同时具有典型脂肪酶和磷脂酶A1活力的酶制剂)，磁力搅拌反应，反应温度、反应时间和酶制剂用量如表2所示。反应完成后，取反应样品，滤去固定化酶，加入200ml丙酮，搅拌，可见沉淀，离心收集丙酮不溶物沉淀，再加入30ml丙酮洗涤3次，即可得到更加纯净的丙酮不溶物。磷脂型多不饱和脂肪酸是一种通用物质，容易通过红外光谱、TLC和NMR等多种方法定性分析表明所得到的丙酮不溶物为磷脂型多不饱和脂肪酸，进一步通过HPLC‐ELSD定量分析表明其中无明显的游离脂肪酸、脂肪酸乙酯和甘油三酯等反应物残留。评价该磷脂组分的颜色和测定反应后磷脂组分的脂肪酸组成，结果见表3。
表1底物配比
表2反应条件
表3磷脂产物评价
实施例7～8
按照表4所示的催化体系混合反应底物，然后加入一定量的固定化酶lipozyme TLIM(Novozyme的固定化脂肪酶产品)，磁力搅拌反应，反应温度和反应时间如表5所示。反应完成后，取反应样品，滤去固定化酶，加入200ml丙酮，搅拌，可见沉淀，离心收集沉淀，再加入30ml丙酮洗涤3次，即可得到丙酮不溶物磷脂。评价该磷脂组分的颜色和测定磷脂组分的脂肪酸组成，结果见表6。
表4底物配比
表5反应条件
表6磷脂产物评价
本发明，实施例1～5和实施例7为采用本发明反应体系的实施例，表3结果表明，所获得反应后磷脂产物中均结合了EPA和DHA，即均可以获得磷脂型PUFA产物，且颜色较浅。实施例6和实施例8的PUFA供体为游离脂肪酸型PUFA，获得的磷脂型PUFA产物颜色相对于其他实施例较深。脂类物质的颜色生成机制比较复杂，有的源于色素，有的源于双键的位置变化，有的源于氧化产物，目前，尚难以全面直接研究颜色产生的物质基础。本发明实施例也表明，当底物采用更多游离脂肪酸时，此时，反应体系酸价较高，所得到的产物颜色也较深。
本发明所采用的PUFA供体主要为甘油酯型PUFA和乙酯型PUFA，这两种物质均为批量化制造的商品，容易采购取材，而游离脂肪酸型PUFA因其容易氧化，没有该原料供应。而且，游离脂肪酸型PUFA需要以以前两种物质为前体制备，制备过程对抗氧化有着严格要求。
一般而言，在生产磷脂型PUFA时，采用游离脂肪酸型的PUFA作为底物进行反应效率最高。采用本发明反应体系，同样可以获得和游离脂肪酸型的PUFA为底物时类似的反应效率，可以认为，本发明反应体系具有良好的反应效率。
本发明反应体系由于采用更少的游离脂肪酸型PUFA，可以获得更加浅色的磷脂型PUFA产品。
一种磷脂型多不饱和脂肪酸的酶法制备方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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