专利摘要

本发明公开一个参与丹参酮类化合物合成代谢的细胞色素P450基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。该基因为首次从丹参中克隆得到，为丹参酮类化合物合成代谢途径的关键酶基因，催化铁锈醇至11-羟基铁锈醇。本发明所提供的CYP76AH3基因具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有序列表中SEQIDNo.2的氨基酸残基序列以及具有SEQIDNo.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQIDNo.2衍生的蛋白质。本发明提供的CYP76AH3基因与丹参酮类化合物合成代谢密切相关，对于调节生产植物二萜类化合物和通过生物技术提高丹参中二萜类活性成分丹参酮类的含量具有重要的理论和实际意义。

权利要求

1.一种与丹参酮类化合物生物合成相关的细胞色素P450基因CYP76AH3，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于：该基因的读码框为SEQ ID No.1的第1-1485位核苷酸。

3.一种由权利要求1所述的基因CYP76AH3编码的蛋白质，其氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。

4.含有权利要求1所述的基因的表达载体。

5.含有权利要求1所述的基因的转基因细胞系。

6.含有权利要求1所述的基因的宿主菌。

7.权利要求1所述的基因在调节和生产植物二萜类化合物11-羟基铁锈醇中的应用。

8.权利要求1所述的基因在丹参育种中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及丹参酮类化合物代谢途径相关细胞色素P450基因，并利用全细胞催化策略对该基因编码蛋白进行功能活性分析，涉及到丹参主要活性成分丹参酮类化合物生物合成途径中细胞色素P450基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。 

背景技术

药用植物有效成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为诠释药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。 

丹参为唇形科鼠尾草属药用植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效，其主要有效成分包括脂溶性的丹参酮和水溶性的丹酚酸。其中丹参酮类主要包括隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮IIB和二氢丹参酮等，具有扩张血管、抗血栓、抗菌消炎以及抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用，在制药以及美容、化妆品等领域得到广泛应用。丹参酮类化合物为松香烷型二萜醌类化合物，其生物合成在萜类化合物前体物质合成的基础上，通过异戊二烯基转移酶(Prenyl Transferases,PT)的作用产生20个碳原子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl Diphosphate,GGPP)，GGPP进一步在丹参柯巴基焦磷酸合酶(S. miltiorrhiza Copalyl Diphosphate Synthase，SmCPS)和丹参类贝壳杉烯合酶(S. miltiorrhiza ent-kaurene Synthase，SmKS)的作用下形成丹参类化合物的基本骨架次丹参酮二烯(Miltiradiene)，在次丹参酮二烯的基础上经过甲基化和羟基化等形成丹参酮类化合物，其中细胞色素P450酶在修饰过程发挥着重要作用，后期的研究结果表明CYP76AH1能够催化次丹参酮二烯生成铁锈醇。 

细胞色素P450酶为血红蛋白结合蛋白，在所有已知的细胞色素P450酶中 都存在一个保守的血红素结合域，是鉴定细胞色素P450基因的一个重要特征。拟南芥基因组中有272个细胞色素P450基因，水稻基因组注释显示有457个细胞色素P450基因，如此庞大的基因家族反映了植物次生代谢物的复杂多变。各种细胞色素P450酶催化的反应广泛并且复杂，包括：羟基化、N-、O-和S-端的脱烷基化、环氧基化、脱氨基作用、脱硫、脱卤作用和过氧化反应等。尽管催化反应各异，催化机理却相同，即通过NADPH或者NADH为细胞色素P450传递电子，激活氧分子，将其中的一个氧插入到底物上，同时生成一分子水。细胞色素P450酶作为萜类、黄酮类、脂肪酸类和植物激素等合成代谢途径的一类重要酶蛋白，不但催化相关代谢反应，由于大多数的细胞色素P450蛋白均有一段内质网膜定位蛋白，因此在代谢区室(Metabolon)的酶复合体中还具有固定酶复合体的作用。随着分子生物学以及相关检测技术的不断发展，次生代谢途径相关的细胞色素P450基因功能逐渐得以验证。真核表达、原核表达以及RNA干扰(RNA Interference，RNAi)等技术在细胞色素P450基因的功能验证中发挥了重要作用。近年来利用真核表达以及RNAi技术使得细胞色素P450酶在紫杉酚、青蒿素、植物抗毒素等代谢途径中的重要作用逐渐被解析。但是作为在植物次生代谢中发挥作用的细胞色素P450表达量相对较低，并且大多细胞色素P450蛋白具有严格的催化底物结构特异性，同时基因组中广泛存在的细胞色素P450基因为次生代谢相关基因的克隆和功能验证提供了难度，使之成为了近年来国际学术界的研究热点之一。 

本实验室在前期研究的基础上已克隆到了丹参酮化合物合成途径的上游的全部关键酶基因，并通过构建工程菌产生了丹参酮化合物的前体次丹参酮二烯和铁锈醇。本发明涉及的是催化铁锈醇(ferruginol)在C11的羟基化产生丹参酮类化合物合成途径中间产物11-羟基铁锈醇(Abieta-8,11，13-triene-11，12-diol)的关键细胞色素P450酶基因，该基因是首次从丹参中得到的丹参酮类成分合成的关键细胞色素P450基因，依据细胞素色P450基因命名法则命名为CYP76AH3。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中涉及的CYP76AH3基因及其氨基酸序列。 

发明内容

本发明的目的在于提供一个丹参酮化合物合成代谢途径的细胞色素P450基 因CYP76AH3，其编码的蛋白在铁锈醇酿酒酵母工程菌株中能够催化铁锈醇生成11-羟基铁锈醇。 

本发明提供了一种与丹参酮类化合物合成代谢有关的基因：CYP76AH3，它是下列核苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列； 

2)与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有一个或几个碱基突变，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。 

一种由上述基因CYP76AH3编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代且具有SEQ ID No.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白质。 

本发明SEQ ID No.1的DNA序列由1485个碱基组成，编码序列表中由494个氨基酸残基组成的蛋白质序列SEQ ID No.2。 

含有本发明基因CYP76AH3的表达载体、细胞系及宿主菌和使用该基因在调节和生产植物二萜类化合物及丹参育种中的应用也在本发明的保护范围之内。将SEQ ID No.1基因克隆到真核表达载体pESC-His的限制性内切酶EcoR I和Sep I位点间，构建带有CYP76AH3基因的重组表达载体pESC-CYP76AH3；转入铁锈醇酿酒酵母工程菌株YJ35(BY4741，MATa；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0／LEU2／MET15／pYX212-(BST1-ERG20)+(SmKSL-SmCPS)／p424-tHMG1+CYP76AH1+SmCPR1)，表达宿主菌采用半乳糖诱导表达催化。通过15L发酵罐放大培养，正己烷萃取反应产物，柱层析分离纯化得到目标产物，高分辨质谱和核磁对产物结构进行表征。分析结果表明：铁锈醇在CYP76AH3蛋白酶的催化下，生成了分子量为302(m/z)的新物质，通过高分辨质谱以及核磁分析新产物，认为该产物的结构为11-羟基铁锈醇。研究结果表明，本发明与丹参酮类化合物合成有关的基因具有细胞色素P450基因的特征结构域，全细胞催化反应分析发现该基因催化铁锈醇的C11位羟基化形成丹参酮类化合物中间产物11-羟基铁锈醇，对于调节和生产植物二萜类化合物及培育高品质的丹参具有重要的理论及实际意义。 

附图说明

图1CYP76AH3基因编码蛋白全细胞催化反应产物结构分析 

A：核磁共振碳谱图；B：核磁共振氢谱图C：产物高分辨质谱图； 

图2CYP76AH3基因编码蛋白催化铁锈醇至11-羟基铁锈醇图示 

具体实施方式

实施例1：丹参中细胞色素P450基因的克隆 

1、取盛花期的丹参根，利用Trizol法提取丹参的总RNA，利用invitrogen的5’和3’RACE试剂盒分别进行扩增，得到CYP76AH3基因的5’和3’末端序列。 

2、全长cDNA的克隆和测序 

将5’和3'RACE结果进行拼接，搜索ORF区域，设计全长基因引物，以cDNA为模板进行扩增。琼脂糖凝胶电泳表明约在1500bp处出现特异片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收目标片段，克隆至pGEM-T easy载体(Promega)中，鉴定阳性克隆并进行测序验证)(北京华大基因)，用于表达载体的构建。 

实施例2、CYP76AH3基因序列的生物信息学 

本发明涉及的丹参二萜合成代谢途径细胞色素P450基因CYP76AH3基因全长开放读码框(ORF)的长度为1485bp，编码494个氨基酸，详细序列见序列表中的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。将CYP76AH3全长开放读码框用BLAST程序在NCBI数据库中进行同源性检索，该基因在氨基酸水平上比对分析显示，丹参CYP76AH3基因编码的蛋白质氨基酸序列与其它物种的同源性较低。 

实施例4、CYP76AH3基因真核表达及功能分析 

1、酵母表达载体的构建 

通过设计带有EcoR I和Spe I酶切位点的引物，利用PCR的方法，将克隆到的丹参细胞色素P450基因的开放阅读框，插入到酵母表达表达载体pESC-His的EcoR I和Spe I酶切位点之间，获得重组质粒pESC-CYP76AH3，于北京华大基因公司进行测序验证。 

2、诱导表达 

将构建的pESC-CYP76AH3质粒转化表达铁锈醇酵母工程菌YJ35，利用半乳糖进行诱导表达。 

3、丹参CYP76AH3的活性分析 

将CYP76AH3基因表达载体导入生产铁锈醇的酿酒酵母工程菌株，挑取3个单克隆接种于5ml SD液体培养基中，30℃，200rmin^-1培养24h；按照1：50的接种量接入50ml SD液体培养基中，30℃，200rmin^-1，培养至对数中期，2000g离心，用去离子水洗涤菌体后转接入含半乳糖的SD诱导培养基中，30℃，200rmin^-1，培养48h。发酵完全加入等体积正己烷萃取催化产物。结果发现包含有CYP76AH3基因重组表达载体pESC-CYP76AH3催化组与空载体对照以及其他基因表达载体反应产物相比有新物质产生。核磁谱图如图1A／B，高分辨质谱图如图1C，产物结构鉴定为11-羟基铁锈醇。说明CYP76AH3基因编码的蛋白在丹参酮类化合物合成代谢途径中能催化铁锈醇生成11-羟基铁锈醇。 

一个参与丹参酮生物合成的CYP450基因及其编码产物与应用专利购买费用说明

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Q:专利著录项目变更费用如何缴交

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