专利摘要

本发明提供了一种大果榕中大环内酯类化合物，其结构式如下：本发明的还提供上述化合物的制备方法以及大果榕中大环内酯类化合物在制备治疗骨质疏松药物中的应用。本发明提供的大果榕中大环内酯类化合物制备工艺简单、成本低廉、原料来源广泛，提取的大大环内酯类化合物对骨质疏松具有很好的治疗效果、来源天然、副作用小。

权利要求

1.大果榕中大环内酯类化合物，其结构式如下：

其中，R₁为OH，R₂为OH，R₃为H；或R₁为OH，R₂、R₃为H；或R₁为OCH₃，R₂为H，R₃为=O；或R₁为OCH₃，R₂、R₃为H；或R₁为OCH₃，R₂为H，R₃为OH。

2.权利要求1所述的大果榕中大环内酯类化合物，其结构式如下：

3.权利要求1所述的大果榕中大环内酯类化合物，其结构式如下：

4.一种大果榕中大环内酯类化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：大果榕组织经阴干、粉碎后，用提取溶液回流提取，减压浓缩后得浸膏；浸膏中加入蒸馏水悬浮后，依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取；氯仿萃取液浓缩后，经柱层析、薄层层析、分子筛层析，即得。

5.根据权利要求4所述的一种大果榕中大环内酯类化合物的制备方法，其特征在于：大果榕组织为大果榕茎、叶或根。

6.根据权利要求4所述的一种大果榕中大环内酯类化合物的制备方法，其特征在于：提取溶液为乙醇水溶液或甲醇水溶液，提取溶液的浓度为95%；大果榕组织与提取溶液的用量比为1Kg:（2-10）L。

7.根据权利要求4所述的一种大果榕中大环内酯类化合物的制备方法，其特征在于：浸膏与水的体积比为1:（1-5）。

8.根据权利要求4所述的一种大果榕中大环内酯类化合物的制备方法，其特征在于：柱层析的条件为：用200-300目硅胶上柱，以乙酸乙酯体积百分数为10-30%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂；薄层层析条件为：以乙酸乙酯体积百分数为10%-30%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂展开剂，或以体积比为4:1的石油醚-丙酮为展开剂，或以体积比为10:1的氯仿-丙酮为展开剂；分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为0%-40%的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。

9.大果榕中大环内酯类化合物在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述大果榕中大环内酯类化合物包括以下结构式的化合物：

化合物1           化合物2           化合物3          化合物4         化合物5。

说明书

技术领域

本发明属于植物化学领域，涉及一种大果榕中大环内酯类化合物，还涉及该化合物的制备方法，以及大果榕中大环内酯类化合物的应用。

背景技术

骨质疏松(osteoporosis，OP)是各种原因引起的代谢性骨病，其发病机理比较复杂，其病变特点为骨量减少、骨微观结构退化、脆性加强和易发生骨折，多发于绝经后妇女、老人。最新资料显示因骨质疏松导致髋关节骨折其1年内病死率达20%，生存1年以上者约25%丧失活动能力，为此全球都予以了普遍关注和重视。我国是世界上拥有骨质疏松症患者最多的国家，骨质疏松率为15.7%，患者总人数超过9000万。在我国70%–80%的中老年骨折是因骨质疏松引起的，其中每年新发椎体骨折约有181万人，髋部骨折病例为23万。如何有效预防和治疗骨质疏松已成为全球共同关注的问题。

现代医学认为骨质疏松的基本病理机制是在骨代谢过程中骨吸收和骨形成的偶联出现了失衡，导致人体内的钙磷代谢不平衡，骨密度逐渐减少而引发的临床症状。由于西医对OP的病因缺乏明确的认识，用药针对性不强，且用药时间长、副作用大、禁忌症多，药价昂贵等问题，现在人们关注的热点转向从天然产物中寻找单体化合物或有效部位作为治疗骨质疏松的药物。

大果榕(Ficus auriculata)为桑科榕属植物，乔木或小乔木，多生长在低山谷沟潮湿雨林中，高3-10米，分布较广，树冠呈圆伞形，色浓绿碧亮。经文献检索，目前大果榕仅用于园林观赏，在治疗骨质疏松上的应用尚未见报道。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的是提供一种大果榕中大环内酯类的单体化合物。

本发明的第二目的是提供上述化合物的制备方法。

本发明的第三目的是提供大果榕中大环内酯类化合物在制备质量骨质疏松药物中的应用。

技术方案：本发明提供的一种大果榕中大环内酯类化合物，其结构式如下：

其中，R₁为OH，R₂为OH，R₃为H；或R₁为OH，R₂、R₃为H；或R₁为OCH₃，R₂为H，R₃为=O；或R₁为OCH₃，R₂、R₃为H；或R₁为OCH₃，R₂为H，R₃为OH。

优选地，大果榕中大环内酯类化合物，其结构式如下：

另一种优选地，大果榕中大环内酯类化合物，其结构式如下：

本发明还提供了一种大果榕中大环内酯类化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：大果榕组织经阴干、粉碎后，用提取溶液回流提取，减压浓缩后得浸膏；浸膏中加入蒸馏水悬浮后，依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取；氯仿萃取液浓缩后，经柱层析、薄层层析、分子筛层析，即得。

其中，大果榕组织为大果榕茎、叶或根。

其中，提取溶液为乙醇水溶液或甲醇水溶液，提取溶液的浓度为95%；大果榕组织与提取溶液的用量比为1Kg:（2-10）L。

其中，浸膏与水的体积比为1:（1-5）。

其中，柱层析的条件为：用200-300目硅胶上柱，以乙酸乙酯体积百分数为10-30%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂；薄层层析条件为：以乙酸乙酯体积百分数为10%-30%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂，或以体积比为4:1的石油醚-丙酮为展开剂，或以体积比为10:1的氯仿-丙酮为展开剂；分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为0%-40%的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。

本发明还提供了大果榕中大环内酯类化合物在制备治疗骨质疏松药物中的应用；所述大果榕中大环内酯类化合物包括以下结构式的化合物：

化合物1                化合物2          化合物3             化合物4       化合物5。

有益效果：本发明提供的大果榕中大大环内酯类化合物制备工艺简单、成本低廉、原料来源广泛，提取的大大环内酯类化合物对骨质疏松具有很好的治疗效果、来源天然、副作用小。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

大果榕中大环内酯类化合物的制备方法，包括以下步骤：

取大果榕茎、叶或根，阴干、粉碎后，用其重量的10倍体积的95%乙醇回流提取3次每次6天，过滤、合并提取液，减压浓缩后得浸膏；浸膏中加入5倍体积的蒸馏水悬浮后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。

其中，氯仿萃取液浓缩后，经柱层析、薄层层析、分子筛层析；柱层析的条件为：用200-300目硅胶上柱，以乙酸乙酯体积百分数为15%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂；薄层层析条件为：以乙酸乙酯体积百分数为20%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂；分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为40%的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。

得到5个大环内酯类化合物，分别为：

4-hydroxy-de-O-methyllasiodiplodin(1)，6-oxolasiodiplodin(2)(R)-(+)-lasiodiploidin(3)，(+)-(R)-de-O-methyllasiodiplodin(4)，(3R,6S)-6-hydroxylasiodiplodin(5)；结构式如下：

化合物1            化合物2            化合物3          化合物4       化合物5；

其中，化合物1和2为新化合物。

各化合物理化性质、氢谱及质谱检测数据如下：

化合物1为无色晶体，易溶于氯仿、乙酸乙酯，254nm紫外灯下呈黑色暗斑。HRESI-MS[m/z295.1542,计算值294.1467]推出该化合物分子量为294，分子式为C₁₆H₂₂O₅，不饱和度为6。¹H NMR(400MHz in CDDl₃)和¹³C NMR(100MHz in CDDl₃)见表。

化合物2为淡黄色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯，254nm紫外灯下呈黑色暗斑。由HRESI-MS[m/z307.1544,计算值306.1467]推出该化合物分子量为306，分子式为C₁₇H₂₂O₅，不饱和度为7，¹H NMR(400MHz in CDDl₃)和¹³C NMR(100MHz in CDDl₃)见表。

化合物3为无色晶体，易溶于氯仿、乙酸乙酯，254nm紫外灯下呈黑色暗斑。¹H NMR(400MHz in CDDl₃):δ6.21(1H,d,J=2.0Hz,H-14),6.20(1H,d,J=2.0Hz,H-12),5.28(1H,m,H-3),3.70(3H,s,-OCH₃),2.63(1H,m,Ha-10),2.46(1H,m,Hb-10),1.91(1H,m,Ha-4),1.65(2H,m,H-5),1.62(1H,m,Hb-4),1.61(2H,m,H-9),1.41(2H,m,H-6),1.32(3H,d,J=6.4Hz,H-17),1.30(2H,m,H-8),1.25(2H,m,H-7);¹³C NMR(100MHz in CDDl₃):δ169.4(C-1),158.0(C-13),157.9(C-15),143.1(C-11),117.3(C-16),108.5(C-12),97.1(C-14),72.6(C-3),55.9(-OCH₃),32.4(C-4),30.5(C-10),30.2(C-9),26.5(C-6),25.6(C-8),24.3(C-7),21.4(C-5),19.6(C-17).

化合物4为无色晶体，易溶于氯仿、乙酸乙酯，254nm紫外灯下呈黑色暗斑。¹H NMR(400MHz in CDDl₃):δ11.94(1H,brs,15-OH),6.27(1H,d,J=2.5Hz,H-14),6.22(1H,d,J=2.5Hz,H-12),5.17(1H,m,H-3),3.28(1H,m,Ha-10),2.50(1H,m,Hb-10),1.92(1H,m,Ha-4),1.79(1H,m,Hb-4),1.65(1H,m,Ha-5),1.62(1H,m,Ha-9),1.61(1H,m,Ha-7),1.60(1H,m,Hb-5),1.55(1H,m,Hb-9),1.51(2H,m,H-8),1.44(1H,m,Hb-7),1.43(2H,m,H-6),1.36(3H,d,J=6.2Hz,H-17);¹³C NMR(100MHz in CDDl₃):δ172.0(C-1),165.5(C-15),160.2(C-13),149.6(C-11),110.9(C-12),105.7(C-16),101.5(C-14),75.3(C-3),33.7(C-10),31.2(C-4),30.9(C-9),27.4(C-8),24.8(C-5),24.2(C-6),21.3(C-7),20.2(C-17).

化合物5为无白色晶体，易溶于氯仿、乙酸乙酯，254nm紫外灯下呈黑色暗斑。¹H NMR(400MHz in DMSO-d₆):δ9.67(1H,s,OH-13),6.26(1H,d,J=1.9Hz,H-14),6.21(1H,d,J=2.0Hz,H-12),5.10(1H,m,H-3),4.31(1H,d,J=4.5Hz,OH-6),3.69(3H,s,-OCH₃),3.58(1H,m,H-6),2.46(1H,m,Ha-10),2.35(1H,m,Hb-10),1.96(1H,m,Ha-4),1.60(1H,m,Ha-5),1.55(1H,m,Ha-9),1.54(1H,m,Hb-4),1.52(1H,m,Ha-7),1.51(1H,m,Hb-9),1.46(1H,m,Hb-5),1.25(1H,m,Ha-8),1.21(3H,d,J=6.4Hz,H-17),1.13(1H,m,Hb-7),1.12(1H,m,Hb-8);¹³C NMR(100MHz in DMSO-d₆):δ167.7(C-1),159.1(C-13),157.3(C-15),141.7(C-11),116.0(C-16),107.7(C-12),96.9(C-14),71.2(C-3),68.6(C-6),55.6(-OCH₃),32.2(C-7),29.7(C-9),29.3(C-5),29.1(C-10),28.2(C-4),22.5(C-8),18.7(C-17).

实施例2

大果榕中大环内酯类化合物的制备方法，包括以下步骤：

取大果榕茎、叶或根，阴干、粉碎后，用其重量的2倍体积的95%乙醇回流提取3次每次6天，过滤、合并提取液，减压浓缩后得浸膏；浸膏中加入1倍体积的蒸馏水悬浮后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。

其中，氯仿萃取液浓缩后，经柱层析、薄层层析、分子筛层析；柱层析的条件为：用200-300目硅胶上柱，以乙酸乙酯体积百分数为30%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂；薄层层析条件为：以乙酸乙酯体积百分数为30%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂；分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为20%的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。

得到5个大环内酯类化合物，经检测与实施例1一致。

实施例3

大果榕中大环内酯类化合物的制备方法，包括以下步骤：

取大果榕茎、叶或根，阴干、粉碎后，用其重量的5倍体积的95%乙醇回流提取3次每次6天，过滤、合并提取液，减压浓缩后得浸膏；浸膏中加入3倍体积的蒸馏水悬浮后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。

其中，氯仿萃取液浓缩后，经柱层析、薄层层析、分子筛层析；柱层析的条件为：用200-300目硅胶上柱，以乙酸乙酯体积百分数为10%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂；薄层层析条件为：以乙酸乙酯体积百分数为10%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂；分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以纯甲醇为洗脱剂。

得到5个大环内酯类化合物，经检测与实施例1一致。

实施例4

与实施例1基本相同，不同之处仅在于：以体积比为4:1的石油醚-丙酮为展开剂。得到5个大环内酯类化合物，经检测与实施例1一致。

实施例5

与实施例1基本相同，不同之处仅在于：以体积比为10:1的氯仿-丙酮为展开剂。得到5个大环内酯类化合物，经检测与实施例1一致。

实施例6

实施例1中分离得到的单体化合物进行抗骨质疏松活性测试：

将实施1获得的单体化合物1至8分别用PBS（磷酸盐缓冲液）配制成10mg/mL储备液，临用前稀释成1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL。

实验步骤：取原代培养的鼠成骨细胞（OB）以2×10⁴个/mL接种于96孔板，每孔体积90μL，在CO₂培养箱中培养24h；待细胞贴壁后，加入化合物1至8的PBS溶液10μL，使化合物1至8的终浓度为100μg/mL，10μg/mL，1μg/mL，培养48h后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）10μL，继续在培养箱中孵育4h；倾去上清液后，每孔加入DMSO100μL，振荡后用酶标仪于570nm处测定各孔吸光度值。同时设定空白组（以同体积的PBS溶液代替单体化合物）。

以细胞存活率判断大果榕中大环内酯化合物对成骨细胞增殖的影响，根据下面公式计算细胞存活率（Cell viability）=（单体化合物组OD值/空白组OD值）×100%，实验结果见表1。

表1大果榕中大环内酯化合物促进成骨细胞增殖活性

注：与空白组比较*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

实验结果表明大环内酯新化合物1和2在三个浓度下均具有促进成骨细胞增殖活性，其中在高浓度下具有很好的促进成骨细胞增殖活性，中浓度下具有较好的促进成骨细胞增殖活性，低浓度下具有微弱的促进成骨细胞增殖活性；化合物4在中浓度下具有较好的促进成骨细胞增殖活性，低浓度下具有微弱的促进成骨细胞增殖活性；化合物3和化合物5在低浓度和高浓度下均具有微弱的促进成骨细胞增殖活性。

大果榕中大环内酯类化合物及其制备方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。