专利摘要
一株假单胞菌及其应用，它涉及一种假单胞菌及其应用。本发明解决了现有的生物表面活性剂的生产成本较高以及合成生物表面活性剂的微生物工程菌的生产能力有限的问题，而提供了一株假单胞菌及其应用。本发明的假单胞菌为假单胞菌Pseudomonassp.PbA，利用假单胞菌Pseudomonassp.PbA在提取糖脂类生物表面活性剂中的应用；本发明假单胞菌Pseudomonassp.PbA制备生物表面活性剂的方法简单，产能能力达到0.2g/L以上，所获得的表面活性剂具有优异的分散性和乳化性。
权利要求
1.一株假单胞菌，其为假单胞菌Pseudomonas sp.PbA，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018928。
2.权利要求1所述的假单胞菌在提取糖脂类生物表面活性剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的假单胞菌在提取糖脂类生物表面活性剂中的应用，其特征在于提取方法按照以下步骤进行：一、将权利要求1所述的假单胞菌Pseudomonas sp.PbA接种于含有1％葡萄糖的无机盐培养基中，在温度为27℃、pH为8.0的条件下180rpm摇床培养72h，收集发酵液；二、将发酵液用1M盐酸调节pH至2.0后静置过夜，离心留沉淀，再用乙酸乙酯萃取沉淀物3次，合并有机溶剂层，干燥后即得到了糖脂类生物表面活性剂。
说明书
技术领域
本发明涉及一种假单胞菌及其应用。
背景技术
生物表面活性剂是微生物在一定生长条件下产生的一类具有亲水端和疏水端的代谢产物。根据亲水端的结构不同，可分为糖脂类、氨基酸类、磷脂类等类型。其中糖脂类表面活性剂由糖(亲水端)和链状脂肪酸(疏水端)构成，按糖结构不同又可以分为四类：鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂和甘露糖赤藓糖醇脂。生物表面活性剂除具有与化学合成表面活性剂类似的乳化、润湿、发泡以及杀菌等特性之外，还具有低毒、生物可降解和生态安全等化学合成表面活性剂不具备的优良特点。在石油、食品、医药、环境保护中具有广泛的应用前景。鼠李糖脂是最早发现的含有鼠李糖环和链状脂肪酸的生物表面活性剂，根据所含的鼠李糖的个数又分为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂两种类型，主要由假单胞菌属和伯克氏菌属作为生产菌株发酵获得。
尽管生物表面活性剂的应用前景广泛，但其工业化生产仍在起步阶段。目前全球的生物表面活性剂的用量只占总表面活性剂的2％，限制其应用的主要原因在于：生物表面活性剂的生产成本较高，包括发酵需要的碳源成本和提取与纯化的成本；另外目前发现的能够合成生物表面活性剂的微生物工程菌的生产能力有限。为了降低其生产成本和提高产量，具有强生产能力的生物表面活性剂菌株的筛选，廉价碳源的利用，合成表面活性剂基因的改造以及提纯方法的改进等研究方向成为热点。
发明内容
本发明为了解决现有的生物表面活性剂的生产成本较高以及合成生物表面活性剂的微生物工程菌的生产能力有限的问题，而提供了一株假单胞菌及其应用。
本发明菌株为假单胞菌Pseudomonas sp.PbA，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2018928。
本发明的假单胞菌在提取糖脂类生物表面活性剂中的应用。糖脂类生物表面活性剂的提取方法按照以下步骤进行：一、将假单胞菌Pseudomonas sp.PbA接种于含有1％葡萄糖的无机盐培养基中，在温度为27℃、pH为8.0的条件下180rpm摇床培养72h，收集发酵液；二、将发酵液用1M盐酸调节pH至2.0后静置过夜，离心留沉淀，再用乙酸乙酯萃取沉淀物3次，合并有机溶剂层，干燥后得到了糖脂类生物表面活性剂；其中通过旋转蒸发除去有机溶剂，再将合并后的有机溶剂层放入冻干机中真空冻干至恒重。
本发明的菌株Pseudomonas sp.PbA为假单胞菌属，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2018年12月27日，保藏号为CCTCC NO：M2018928。
本发明的假单胞菌提取得到的生物表面活性剂的疏水端为十六烷酸，利用本发明的假单胞菌提取生物表面活性剂的方法简单，产能能力达到0.2g/L以上，即每升假单胞菌发酵液中含有0.2g以上的表面活性剂；所获得的表面活性剂还具有优异的分散性和乳化性。
附图说明
图1是假单胞菌Pseudomonas sp.PbA的系统进化树；
图2是假单胞菌Pseudomonas sp.PbA温度优化图；
图3是假单胞菌Pseudomonas sp.PbA pH优化图；
图4是假单胞菌Pseudomonas sp.PbA菌落形态图；
图5是实施例1中表面活性剂TLC结果图；
图6是实施例1中表面活性剂红外光谱图；
图7是实施例1中生物表面活性剂气相(GC)结果；
图8是实施例1中十六烷酸(MS—质谱图)结果图；
图9是实施例1中表面活性剂排油圈直径对比图；
图10是实施例1中表面活性剂乳化性质对比图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式假单胞菌Pseudomonas sp.PbA，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2018928。
本实施方式的假单胞菌Pseudomonas sp.PbA所用的培养基为pH为8.0的含有1％葡萄糖的无机盐培养基，培养条件：27℃、180rpm/min震荡培养72h。
本实施方式菌株假单胞菌Pseudomonas sp.PbA筛选、鉴定方法如下：
一、2017年取5g长春西郊污水厂底泥，加入50mL无菌水，在27℃、180rpm/min条件下摇床振荡2h后静置30min，取上清液5mL接种到装有100mL的LB培养基的摇瓶中，于27℃、180rpm的恒温摇床振荡培养3d后得到培养液；
二、取步骤一的培养液转接至LB培养基中，于27℃、180rpm的恒温摇床振荡培养14h得到发酵液；
三、取步骤二的发酵液用无菌水进行10
四、挑取初筛菌株的单克隆于LB培养基中，于27℃、180rpm恒温摇床振荡培养培养3d后，在5000rpm条件下离心10min除去菌体，保留上清液；
五、滴加200μL发酵上清液于含有10％(v/v)液体石蜡的20mL蒸馏水培养皿中，室温下观察排油圈的大小，选取排油圈直径最大的菌株进行鉴定；
六、将步骤五得到的菌株进行提取基因组DNA，利用27F/1492R引物进行PCR，即得到1397bp的16S rRNA序列，然后利用BLAST对菌株的16S rRNA基因和Genebank中与已登录细菌进行同源性比对，该菌株的系统进化树如图1所示，确定步骤三所获得的菌株为Pseudomonas属，并命名为Pseudomonas sp.PbA。
本实施方式假单胞菌Pseudomonas sp.PbA最适生长温度、最适PH值的测定，具体方法为：
1、待测样品的制备：取100μL假单胞Pseudomonas sp.PbA接种到5mLLB培养基中，在27℃、180rpm条件震荡培养14h得到培养液；
然后取100μL培养液接种于装有5mL LB培养基的试管中。
2、最适生长温度的测定：取100μL步骤一的待测样品分别接种于装有5mL LB培养基的试管中，分别于16℃、27℃、37℃、42℃摇床中培养10h，每隔1h在595nm波长下测定吸光度，以时间为横轴，吸光度为纵轴，绘制该菌的温度生长曲线(每个温度3组平行实验，取平均值)；
3、最适PH值的测定：取4个pH分别为6.0、7.0、8.0、9.0的5mL LB培养基的试管，然后将取400μL步骤一中的待测样品平均接种到这四个试管中，在最适温度(步骤二中获得的温度)的摇床中进行震荡培养10h，每隔1h在595nm波长下测定吸光度，以时间为横轴，吸光度为纵轴，绘制该菌的pH值生长曲线(每个pH值进行3组平行实验，取平均值)；
温度生长曲线如图2所示，从图2中可以看出本发明的菌株Pseudomonas sp.PbA的最适生长温度为27℃；pH值生长曲线如图3所示，从图3中可以看出该菌株的pH生长曲线，菌株Pseudomonas sp.PbA的最适生长pH为8.0。
对本实施方式的假单胞菌Pseudomonas sp.PbA进行生理生化实验，实验结果如表1所示。
表1 Pseudomonas sp.PbA生理生化实验结果
本实施方式的假单胞菌Pseudomonas sp.PbA菌落形态如图4所示，图中A为菌落形态图，B为革兰氏染色结果；从图4可以看出，本申请的假单胞菌Pseudomonas sp.PbA属于革兰氏阴性菌，菌落较小，乳白色，边缘规则，呈圆球状。
具体实施方式二：如具体实施方式一所述的假单胞菌在提取糖脂类生物表面活性剂中的应用。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是糖脂类生物表面活性剂的提取方法按照以下步骤进行：一、将具体实施方式一所述的假单胞菌Pseudomonassp.PbA接种于含有1％葡萄糖的无机盐培养基中，在温度为27℃、pH为8.0的条件下180rpm摇床培养72h，收集发酵液；二、将发酵液用1M盐酸调节pH至2.0后静置过夜；离心留沉淀，再用乙酸乙酯萃取沉淀物3次，合并有机溶剂层，干燥后即得到糖脂类生物表面活性剂。其他与具体实施方式二相同。
本实施方式步骤一无机盐培养基(g/L)(pH7.0-7.2)：母液：Na2HPO4·12H2O 9.0g，KH2PO4 1.5g，NH4Cl 0.5g；MgSO4·7H2O 0.2g；微量元素(浓度)：FeCl3 9.7×10-3g，CaCl27.8×10
本实施方式步骤二中离心条件为：在转速为5000r/min条件下离心20min。
本实施方式步骤二中合并有机溶剂层及干燥后的方法为：通过旋转蒸发除去有机溶剂，再将合并后的有机溶剂层放入冻干机中真空冻干至恒重。
本实施方式生物表面活性剂的产能能力达到0.2g/L以上，即每升步骤一中收集的发酵液中含有0.2g以上的表面活性剂。
实施例1假单胞菌Pseudomonas sp.PbA提取糖脂类产表面活性剂
一、将假单胞菌Pseudomonas sp.PbA接种于含有1％葡萄糖为碳源的1L无机盐培养基中(无机盐培养基组分母液：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化铵，七水硫酸镁；微量元素：三氯化铁、氯化钙、氯化钴、硫酸铜、氯化镍、氯化铬)，在27℃、pH8.0的条件下180rpm下摇床培养72h后结束发酵；离心除去菌体，收集发酵液；
二、步骤一发酵液用1M盐酸将pH调至2.0，静置过夜，将过夜后的发酵液离心，收集沉淀及絮状物，并将pH调至7.0；用乙酸乙酯萃取三次，合并有机溶剂层，旋转蒸发去除有机溶剂后得到黄色固体，然后于冻干机中真空冻干至恒重，即得到提取物。三、步骤二所获得的提取物进行分析；
1、薄层层析(TLC)：将步骤二的提取物溶于氯仿中作为样品，展开剂为氯仿：甲醇＝1:1，显色剂为苯酚-硫酸溶液。将展开剂倒入层析缸，静置20分钟，将样品和标准品点样于硅胶板上，待样品完全干燥后，放入层析缸将并在展开剂中，待样品跑至距离硅胶板上方1cm处时停止展开；将硅胶板上展开剂挥发干净，均匀喷洒显色剂，并于70℃烘箱中加热20分钟，观察其颜色；糖脂类表面活性剂在苯酚-硫酸显色剂中显棕色；薄层层析如图5所示，图中1号为步骤二得到的提取物，2号为鼠李糖脂标准品，二者均出现一个明显的棕色斑点，由此可知，步骤二得到的提取物为含有糖脂类物质，没有其他组分，组分单一。
2、红外检测(FT-IR)：取1mg步骤二的提取物和150mg溴化钾粉末放于研钵中进行研磨，溴化钾和样品充分混合后模具中，按压铺平，得到透明锭片，取出后立即测试。生物表面活性剂的红外光谱图如图6所示，图6中3353cm
3、气质联用(GC-MS)：取50mg步骤二的提取物和2mL15％硫酸/甲醇溶液，色谱氯仿2mL，于100℃沸水中加热3小时，放冷后，加入1mL水，激烈搅拌后静置分层，取下层氯仿层液体，加入无水硫酸钠进行除水，出水后过滤，取500μL放入试剂瓶中并在试剂瓶中加入500μL标准品，混匀后进行检测。生物表面活性剂气相(GC)结果如图7所示，图中峰1为标准品辛酸乙酯，质谱显示峰2为生物表面活性剂的基团；图8是图7所述的峰2的质谱图，图8质谱图的分析结果显示峰2即为十六烷酸甲酯(存在一个甲基化)；气质联用检测结果显示，步骤二得到生物表面活性剂的疏水端为十六烷酸。
4、实施例1所得到生物表面活性剂的产能能力达到了0.28g/L。
实施例2本申请利用假单胞菌Pseudomonas sp.PbA制备得到的生物表面活性剂与现有的鼠李糖生物表面活性剂进行比较
分散性和乳化性是衡量生物表面活性剂的重要指标，其待测样品分别为现有的鼠李糖脂标准品(西安瑞捷生物科技有限公司)水溶液和利用本申请假单胞菌Pseudomonassp.PbA发酵所提取的生物表面活性剂样品水溶液。
这两个待测样品分散性的结果如图9所示，图9中A为鼠李糖脂标准品水溶液，B为本申请的生物表面活性剂；从图9可以看出本申请假单胞菌Pseudomonas sp.PbA发酵所提取的生物表面活性剂样品水溶液和鼠李糖脂标准品(西安瑞捷生物科技有限公司)水溶液的排油圈平均直径分别为3.7cm和5.6cm，本申请假单胞菌Pseudomonas sp.PbA发酵所得的生物表面活性剂与鼠李糖脂标准品排油圈直径仅相差19mm，本申请假单胞菌Pseudomonassp.PbA获得的生物表面活性剂的分散性与现有的鼠李糖脂相比较具有相似的分散性能。
这两个待测样品乳化性的结果如图10所示，图10中A为鼠李糖脂标准品水溶液，B为本申请的生物表面活性剂；从图10可以看出，本申请假单胞菌Pseudomonas sp.PbA发酵所提取的生物表面活性剂样品水溶液和鼠李糖脂标准品(西安瑞捷生物科技有限公司)水溶液对液体石蜡的乳化指数分别为60.3％和62.1％，本申请假单胞菌Pseudomonas sp.PbA发酵所提取的生物表面活性剂具有良好的乳化性质。
综上所述，本发明的利用假单胞菌Pseudomonas sp.PbA提取得到的生物表面活性剂具有优异的分散性和乳化性性能，有利于假单胞菌Pseudomonas sp.PbA在表面活性剂方面的应用。
一株假单胞菌及其应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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