专利摘要

本发明涉及微生物土壤调理修复领域，具体涉及一种假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis sp.)NT‑2及其作为酸性土壤改良剂的应用。假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis sp.)NT‑2，该菌株该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2015年11月5日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.11585。本发明的土壤改良剂能够调节土壤pH值，促进土壤团粒结构的形成，改善土壤的物理性状，促进植物的生长；含有有机质、钙、镁、硅及利于作物生长的微量元素；添加的微生物菌剂有较强的重金属抗耐性和促生能力，能够降低重金属对植物的毒性，改善土壤微生态，改善矿质营养，促进植物生长。本发明的土壤改良剂对酸性土壤具有较好的调节效果，增加土壤肥力，在重金属污染土壤的生物修复中具有较好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物土壤调理修复领域，具体涉及一种假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)NT-2及其作为酸性土壤改良剂的应用。

背景技术

土壤酸化是指土壤中氢离子增加的过程或者是土壤酸度由低变高的过程，它是一个持续不断的自然过程。土壤酸化会直接导致土壤理化性质变差，并打破原有的适宜作物生长的土壤生态环境条件，使土壤pH下降，导致土壤中有效硼、钼等含量下降，而土壤中有效铁、铝、锰等含量增加，使作物产生锰、铝中毒等，进而导致土壤中钙、镁等元素的流失，使作物的生长发育不良，产量和品质下降。由于化肥的过量施用、有机肥施用量不足和大水漫灌的灌溉方式等不当的农业措施，大大加速了土壤酸化的进程。

为了改善土壤酸化和提高作物产量，石灰被广泛应用，但石灰的施用有很多限制条件，并且极易引发负面效应，特别是导致土壤有机质含量的下降和引发土壤板结，不利于作物生长。因此，研制和施用合适的土壤改良剂以中和土壤酸度、提高土壤肥力和恢复酸性土壤的生产力对于农业的持续发展和生态环境的保护具有双重意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)NT-2及其作为酸性土壤改良剂的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种假单胞菌，假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)NT-2，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2015年11月5日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.11585。

该菌株是从果园高铜土壤中分离纯化得到的，经鉴定为假单胞菌属(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)。该菌株在牛肉膏蛋白胨平板上生长36h，呈乳白色不透明，菌落直径约为2-4mm，表面光滑，菌落凸起，边缘整齐(见图1)。经染色镜检，该菌为革兰氏阴性菌，杆状(见图2)。

该菌具有较强的重金属抗耐性和吸附能力，并能促进植物生长，可以分泌促进植物生长的物质，比如ACC脱氨酶、吲哚乙酸(Indole-3-aceticacid)、铁载体(Siderophore)，并能溶解土壤中难溶性磷酸盐(Phosphate)。

假单胞菌的应用，所述假单胞菌在制备调节酸性土壤的制剂中的应用。

一种微生物菌剂，微生物菌剂为含有所述假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)NT-2。

一种微生物菌剂的制备方法：

1)斜面培养：将假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)NT-2接种于斜面培养基，在28-37℃恒温下培养36-48h；

2)摇床培养：将上述步骤1)培养的菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在pH6.8-7.2，28-37℃，150-180r/min振荡培养至对数生长期；

3)发酵罐培养：按2-5％(v/v)的接种量将步骤2)培养的菌液接种于装有牛肉膏蛋白胨培养基的发酵罐中，pH6.8-7.2，28-37℃，通风量为1:0.8-1.1的条件下培养48-72h；发酵培养后发酵液低温浓缩，即得微生物菌剂。

所述发酵液于40-50℃干燥浓缩至原体积的3/4，优选发酵液于40℃干燥。

所述牛肉膏蛋白胨培养基配方如下：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl5.0g/L，琼脂20g/L，加水至1L，调节pH6.8-7.2。

上述微生物菌剂的制备方法中，每一步骤的培养均是在无菌条件下进行的。

一种微生物菌剂的应用，所述微生物菌剂作为调节酸性土壤的微生物菌剂中的应用。

一种酸性土壤改良剂，改良剂按重量百分比计，50-60％含假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)NT-2的微生物菌剂、20-25％生物炭和20-25％膨润土复配而成，具有良好的改良酸化土壤和提高土壤肥力的效果。

所述含假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)NT-2的微生物菌剂中有效菌总含量≥5亿cfu/g。

一种酸性土壤改良剂的制备方法，将假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)NT-2依次进行斜面培养、摇床培养和发酵罐培养后至处于对数生长期的菌悬液浓缩，而后按照上述比例与生物炭混合，混匀后加入膨润土，低温干燥制成酸性土壤改良剂。

一种酸性土壤改良剂的应用方法，所述土壤改良剂在调节酸性果园土壤中的应用。

本发明所具有的有益效果：

1、利用本发明的菌株获得的微生物菌剂具有较强的重金属抗耐性和吸附能力，能够在条件较为恶劣的土壤环境中发挥修复作用，可以分泌促进植物生长的物质，释磷解钾，增加土壤肥力，改善土壤微生态。并且制备方法先进科学，简便可行，有效菌含量高。

2、本发明的酸性土壤改良剂以生物炭为调节土壤酸度的主要物质。生物炭中含有碱性物质，加入土壤后，碱性物质释放，可以显著提高土壤pH，增加土壤盐基离子交换量，从而缓解酸性土壤中铝对植物的毒害。同时，生物炭还含有丰富的有机碳，可以增加土壤有机质含量，促进土壤肥力的提高，并提高土壤的保水能力。生物炭的孔隙结构也为土壤微生物提供了良好的栖息环境，为微生物提供附着位点，调控土壤微环境的理化性质。

3、本发明的酸性土壤改良剂以膨润土为调节土壤酸度的重要物质。膨润土有良好的透气保水性，施入土壤可以增加土壤团聚体的数量，降低土壤容重，增大土壤孔隙度。膨润土还具有优良的离子交换作用及吸附性，降低土壤交换性酸度，通过离子交换性能将土壤中重金属固定和钝化，降低其生物有效性，对重金属污染的土壤也有良好的修复作用。此外，膨润土还含有植物生长所需的一些常量和微量元素，对土壤的理化性质和生态群落有一定的改良作用。

4、本发明所述的酸性土壤改良剂是将微生物菌剂、生物炭和膨润土进行合理的复配，尤其是按照本发明的用量配比进行搭配，可以起到很好的协同作用。并且施用方法简便，效果明显。

5、本发明所述的酸性土壤改良剂具有良好的改酸效果，能够迅速并显著提高土壤pH，土壤盆栽实验表明，施用后一周土壤pH由5.13升高到6.00，并且效果稳定，在施用后4个月内pH稳定提升0.7个单位。

总之，本发明的酸性土壤改良剂将微生物菌剂和酸性土壤调理剂有机的组合起来，充分发挥各组分的效果，能迅速提高土壤pH，促进土壤团粒结构的形成，增加土壤肥力，为植物生长提供良好的生态环境。本发明的酸性土壤改良剂具有高效、无毒、无污染的优点，符合生态农业的发展趋势，具有良好的应用推广价值。

附图说明

图1为本发明实施例提供的菌株NT-2在固体培养基上的菌落形态图；

图2为本发明实施例提供的菌株NT-2经革兰氏染色在显微镜下的形态图；

图3为本发明实施例提供的酸性土壤改良剂对果园土壤的改良效果图。

具体实施方式

以下实施实例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容并不局限于此。

本发明假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)NT-2，该菌株分类学名为：PseudomonasfrederiksbergensisNT-2，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.11585，保藏日期为：2015年11月5日。

利用上述菌株获得的土壤改良剂能够调节土壤pH值，促进土壤团粒结构的形成，改善土壤的物理性状，促进植物的生长；含有有机质、钙、镁、硅及利于作物生长的微量元素；添加的微生物菌剂有较强的重金属抗耐性和吸附能力，能够降低重金属对植物的毒性，改善土壤微生态，改善矿质营养，促进植物生长。本发明的土壤改良剂对酸性土壤具有较好的调节效果，增加土壤肥力，在重金属污染土壤的生物修复中具有较好的应用前景。

实施例1：假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)NT-2的分离、鉴定及特性

1.1供试土壤

采自烟台市经波尔多液喷洒后的苹果园土壤。新鲜的土壤样品过2mm尼龙筛，于4℃冰箱暗处保存。

1.2培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl5.0g/L，蒸馏水1000mL，琼脂20g/L，pH7.0。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl5.0g/L，蒸馏水1000mL，pH7.0。

筛选培养基：牛肉膏蛋白胨培养基添加硫酸铜贮备液配成。

1.3土壤中耐铜微生物的筛选

称取5.0g土壤样品，装入含45mL无菌水的三角瓶中(放入少许玻璃珠)，恒温振荡30min以上，制成稀释倍数为10^-1的土壤悬液。用已灭菌的移液管取上述土壤悬液1mL于装有9mL无菌水的试管中，充分混匀，即为10^-2的土壤悬液，以此类推，制成10^-3、10^-4、10^-5的土壤悬液。

分别取稀释倍数为10^-3、10^-4、10^-5的稀释液0.1mL在超净工作台上涂布于铜离子浓度为100ppm的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，在恒温培养箱28℃条件下培养3d，待菌落长出后分别挑取菌落特征明显不同的菌株划线分离，经过多次划线分离获得纯化后的耐铜菌株，放入4℃冰箱中保存。

1.4菌株形态观察及鉴定

将菌株接种到牛肉高蛋白胨固体培养基上，培养48h，观察菌落的形态和颜色。菌体涂片，革兰氏染色，在普通光学显微镜下观察菌体形态。该菌株在牛肉膏蛋白胨平板上生长36h，呈乳白色不透明，菌落直径约为2-4mm，表面光滑，菌落凸起，边缘整齐(见图1)。经染色镜检，该菌为革兰氏阴性菌，杆状(见图2)。

1.5菌株16SrDNA鉴定

选取选用16SrDNAPCR反应的一对通用引物27F、1492R作为扩增引物，PCR反应条件：95℃5min，95℃1min；58℃1min；72℃2min，循环30次；72℃延伸10min。回收PCR反应产物，送生物工程公司进行测序。后用Blast软件在NCBI、EBI数据库中进行比对鉴定。

实施例2：酸性土壤改良剂对果园土壤的改良效果

1供试土壤

供试土壤采自山东省烟台海阳市苹果园，采集土壤时，去除表层土壤，风干后过2mm尼龙筛，混合均匀。土壤pH为5.13。

2材料与方法

2.1微生物菌剂的制备

1)斜面培养：将假单胞菌(Pseudomonasfrederiksbergensissp.)NT-2接种于斜面培养基，在28℃恒温培养箱中培养36-48h；

2)摇床培养：将上述步骤1)培养的菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在pH6.8-7.2，28℃，180r/min摇床中振荡培养36h至对数生长期；

3)发酵罐培养：按2％的接种量将步骤2)培养的菌液接种于装有牛肉膏蛋白胨培养基的发酵罐中，pH6.8-7.2，28℃，通风量为1:0.8-1.1的条件下培养48-56h；

4)将步骤3)所得的发酵液于40℃干燥、浓缩至原体积的3/4制备成所述的微生物菌剂。

2.2土壤改良剂的制备

将50份浓缩微生物菌剂与25份生物炭混合，发挥生物炭的孔隙结构与水肥吸附作用优势，与微生物结合形成良好的生物修复单元，搅拌混合30min，再加入25份膨润土混合均匀，40℃低温干燥成粉剂，即得酸性土壤改良剂。

2.3实验设计

处理1：生物炭

处理2：酸化土壤改良剂

处理3：NT-2菌剂

处理4：空白对照

分别将生物炭(加入量为每盆土重的2.5wt％)、制备的酸性土壤改良剂(加入量为每盆土重的2.5wt％)和NT-2菌剂(加入量为每盆土重的10wt％)与经风干、过2mm尼龙筛的果园土壤充分混合后装入90×80mm²的花盆，每盆土重300g，每个处理设置3个平行。然后将花盆放入温室中培育，温度25℃，培育150天。每隔3天补充一次水分，保持土壤湿度为饱和含水率的40％左右。在不同的时间间隔上取土壤样品进行测定分析。

2.3结果分析

试验结果表明，施用酸性土壤改良剂的的土壤，7天后测定土壤pH，发现土壤pH由5.13提升至6.00，之后缓慢提升至6.13，35天后土壤pH保持在5.94。说明本发明的酸性土壤改良剂能在短时间内迅速提高土壤pH，改良土壤。添加生物炭的土壤，7天后土壤pH仅提升至5.59，效果比较稳定；加入微生物菌剂的土壤pH略有升高，但效果均不如添加酸性土壤改良剂明显(图3)。

一种假单胞菌及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。