专利摘要
本发明涉及一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法。首次揭示在土霉素生产菌株中，下调lsigB基因后，能够显著地提高土霉素生产菌株的土霉素产量，单位菌体的土霉素合成量可提高20％以上。本发明为土霉素生产菌株改造提供了一个新途径。
权利要求
1.一种生产土霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)在土霉素生产菌株中，下调lsigB基因的表达；其中，所述的土霉素生产菌株是龟裂链霉菌；
(2)培养步骤(1)制备的菌株，从而生产土霉素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过阻断或敲除lsigB基因，从而下调土霉素生产菌株中lsigB基因的表达。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在土霉素生产菌株中lsigB基因位置插入外源基因，从而阻断lsigB基因。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的土霉素生产菌株是龟裂链霉菌M4018。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)的培养方法包括：
培养龟裂链霉菌孢子以形成菌丝细球，之后接种至发酵培养基中，30±2℃，220±50rpm发酵。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括按照重量体积比：3％葡萄糖，1％蛋白胨，0.07％MOPS，0.02％氯化钙，0.02％硝酸钠，0.1％微量元素。
7.一种改良的土霉素生产菌株，所述的土霉素生产菌株是龟裂链霉菌，其特征在于，所述的菌株的基因组中lsigB基因被阻断或被敲除。
8.如权利要求7所述的菌株，其特征在于，以lsigB基因的部分序列片段作为同源臂，在土霉素生产菌株中lsigB基因位置插入外源基因，从而获得lsigB基因被阻断或被敲除的菌株。
9.lsigB基因的用途，其特征在于，用于作为改良土霉素生产菌株、提高土霉素产量的靶点；其中，所述的土霉素生产菌株是龟裂链霉菌。
说明书
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法。
背景技术
链霉菌的生命周期很复杂，能够产生多种次级代谢产物。这些天然产物为新药的发现提供了丰富的前体物资源。至1995年为止，由链霉菌中得到的具有抗生素活性的次级代谢产物约有7000种。链霉菌产生的抗生素在医药和生命科学研究中得到广泛应用。链霉菌以其特有的发育分化特征和强大的次级代谢能力，在基础研究与工业应用方面均具有重要地位。抗生素的合成与大量调控因子相关，这些调控因子通过调控抗生素合成途径中的相关基因的表达量，调控了抗生素的产量。这为进一步利用这些调控因子作为靶点进行基因改造，获得抗生素高产突变菌株，从而实现抗生素产量的提高提供了肯能。
龟裂链霉菌(Streptomyce rimosus)是土霉素(oxytetracycline，OTC)的商业化生产菌株。土霉素属于四环素类广谱抗生素，能够抑制对革兰阳性菌、阴性菌、支原体、衣原体、立克次体等引起的感染，同时也可用于治疗梨形虫病、附红细胞体病。其作用机理是土霉素能够可逆性地与30S核糖体亚基结合，从而抑制氨酰tRNA核糖体复合体的形成，这样抑制了细菌的繁殖。因此研究人员不断应用分子技术对S.rimosus进行研究，利用重组技术改造菌株性能、提高抗生素产量，或者以此为骨架合成生产非天然新抗生素。然而，为了提高土霉素的产量，本领域还有必要进一步研究提高土霉素产量的方法。
链霉菌的次级代谢产物的生物合成基因常位于同一基因簇中，在基因簇中常包含一个或多个途径特异性调控基因，它们一般调控一种抗生素或几种具有某些共同生物合成途径的抗生素的生物合成。抗生素生物合成基因簇的调控是受位于基因簇的转录调控子(CSR)在转录水平上进行调控的，通常有单转录调控子调控和多转录调控子调控。
但是，鉴于链霉菌的次级代谢调控网络十分复杂，定位到对于土霉素产量确实有调控作用的基因、且调节该基因的表达对于链霉菌自身生长不造成重大影响的基因仍然是困难的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法。
在本发明的第一方面，提供一种生产土霉素的方法，所述方法包括：
(1)在土霉素生产菌株中，下调lsigB基因(类sigB基因，like-sigB)的表达；
(2)培养步骤(1)制备的菌株，从而生产土霉素。
在一个优选例中，通过阻断(较佳地为插入阻断)或敲除lsigB基因，从而下调土霉素生产菌株中lsigB基因的表达。
在另一优选例中，在土霉素生产菌株中lsigB基因位置插入外源基因，从而阻断lsigB基因(较佳地，在该基因中第181-680位区间内插入外源基因)。
在另一优选例中，所述的外源基因包括pKC1139质粒中的部分元件，例如ori T、Ori pSG5、Apr。
在另一优选例中，所述的阻断lsigB基因方法包括：提供表达载体，所述表达载体中包含lsigB基因的部分序列(较佳地为第181-680位序列)，将表达载体转化龟裂链霉菌，选择基因组中整合有外源基因序列片段的重组龟裂链霉菌。
在另一优选例中，所述的土霉素生产菌株是链霉菌。
在另一优选例中，步骤(2)的培养方法包括：培养链霉菌孢子以形成菌丝细球，之后接种至发酵培养基中，30±2℃(较佳地30±1℃)，220±50rpm(较佳地220±20rpm)发酵。
在另一优选例中，所述的发酵培养基包括按照重量体积比：3％葡萄糖，1％蛋白胨，0.07％ MOPS，0.02％氯化钙，0.02％硝酸钠，0.1％微量元素；其中，各组分的百分含量可上下浮动10％；较佳地浮动5％。
在本发明的另一方面，提供一种改良的土霉素生产菌株，所述的菌株的基因组中lsigB基因被阻断或被敲除。
在一个优选例中，以lsigB基因的部分序列片段作为同源臂，在土霉素生产菌株中lsigB基因位置插入外源基因，从而获得lsigB基因被阻断或被敲除的菌株。
在另一优选例中，所述的改良的土霉素生产菌株以链霉菌为出发菌株进行改良。
在本发明的另一方面，提供lsigB基因的用途，用于作为改良土霉素生产菌株、提高土霉素产量的靶点。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、土霉素的出峰时间。
图2、M4018::lsigB突变株构建过程。
图3、扩增获得lsigB部分片段及lsigB阻断突变株M4018::lsigB的验证。
(A)PCR获得lsigB的部分片段，Lane1、2均为得到的部分lsigB片段。
(B)pKB质粒鉴定，Lane1：Xba I、BamH I双酶切pKC1139质粒，Lane2-4：双酶切验证pKB质粒。
(C)M4018::lsigB突变株PCR鉴定，其中，Lane 1：以M4018基因组为模板，Lane 2：pKC1139质粒作为模板，Lane 3-7：以转化子基因组为模板。
图4、单位菌体的土霉素产量柱状图。其中，纵坐标单位：OTC/DCW(mg/g)。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示在土霉素生产菌株中，下调(包括阻断或敲除)lsigB基因后，能够显著地提高土霉素生产菌株的土霉素产量。单位菌体的土霉素合成量可提高20％以上。本发明为土霉素生产菌株改造提供了一个新途径。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
NCBI已公开了lsigB基因序列及其编码的蛋白序列，其氨基酸序列可参见GenBank登录号：ELQ80095.1(SEQ ID NO:2)(Sig B/F/G subfamily RNA polymerase sigma-28subunit)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。因此，本领域人员易于获得所述基因。
在土霉素生产菌株中下调lsigB基因可以采用多种本领域已知的方法，包括基因沉默、基因阻断、基因敲除、基因抑制等。这些方法均被包含在本发明中。
例如，可以通过基于同源重组的基因插入阻断技术来改造基因组中的lsigB基因，从而使得lsigB基因被阻断；也可以针对lsigB基因设计干扰性RNA或反义核苷酸来使lsigB基因表达抑制或沉默。
一种下调lsigB基因的方法是基因阻断技术，在本发明的优选实施方式中，体外构建lsigB基因阻断质粒，通过同源重组的方法，在土霉素生产菌株染色体lsigB基因中插入其他无关元件，从而使得染色体上的lsigB基因不再能够编码活性的蛋白质。当进行基因阻断时，无关元件的选择是本领域技术人员易于选择到的，例如应用一些抗性基因。一种基因阻断(敲除)的方法例如可参见Genetic Manipulation of Streptomyces:a LaboratoryManual中所记载的。较佳地，本发明实施例中，所述的无关元件包括pKC1139质粒中的部分元件，例如ori T、Ori pSG5、Apr。此外，将lsigB基因进行缺失敲除，使之缺少发挥功能的关键区域也是一种可行的下调基因的策略。
在设计用于进行基因阻断或敲除的构建物时，同时包含抗性筛选基因是优选的，从而有利于后续筛选出发生基因被阻断或敲除的菌株。
基于本发明的新发现，本发明还提供了采用基因插入阻断方法阻断lsigB基因后获得的土霉素生产菌，该菌株不表达lsigB基因或表达量显著性降低。本发明还涉及所述菌株的用途，用于高产土霉素。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
I.材料与方法
1、质粒、菌株和培养基
本发明中，所应用的质粒如表1所示。
表1、质粒汇总
注：Amp
表2、菌种汇总
pMD19-lsigB质粒的建立：以K-lsigBF、K-lsigBR为引物，以M4018基因组为模板扩增lsigB扩增得到lsigB的部分片段，并引入BamHI和Xba I酶切位点，插入到pMD19(大连宝生生物有限公司)的BamHI和Xba I位点内，获得pMD19-lsigB质粒。
2、培养基配方
LB培养基(w/V)：氯化钠10％，蛋白胨10％，酵母粉5％，去离子水定容至1L后调节pH至7.0。固体培养基中加入2％琼脂，121℃灭菌20min。
麸皮培养基(w/V)：麸皮6％，琼脂2％。
TSB(Tryptone Soya Broth)培养基(w/V)：3％ Tryptone Broth。
MS固体培养基(w/V)：2％黄豆饼粉，2％甘露醇，2％琼脂。
Emerson培养基(w/V)：0.4％蛋白胨，0.4％ Beef，0.1％酵母粉，1％葡萄糖，0.25％ NaCl，2％琼脂。
种子培养基(w/V)：1％葡萄糖，1.5％胰蛋白胨，0.05％酵母粉，0.28％蔗糖，0.01％碳酸钙。
天然发酵培养基(w/V)：3％葡萄糖，1％蛋白胨，0.07％ MOPS，0.02％氯化钙，0.02％硝酸钠，0.1％微量元素。其中微量元素(g/L)：氯化锌0.04，六水合氯化铁0.2，二水合氯化铜0.01，四水合氯化锰0.01，十水合硼酸钠0.01，四水合钼酸铵((NH4)6·Mo7O4)0.0124。
3、试剂盒及工具酶
分子克隆所用限制性内切酶均购自Takara生物技术(大连)有限公司。质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、片段纯化试剂盒均购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。所用引物见表3。
表3、引物
4、培养方法
(1)龟裂链霉菌M4018孢子悬浮液的制备
用无菌棉签蘸取活化后的孢子涂布于MS平板，30℃培养5-7天。待形成大量的灰白色孢子时，收集孢子至无菌水中，过滤并稀释到合适的倍数，涂布在Emerson’s平板上计数。这样即得到了孢子数目已知的孢子悬浮液。
(2)天然发酵培养基发酵
二级发酵如下：首先以1×10
5、检测分析方法
(1)龟裂链霉菌菌体干重的测定
在发酵过程中，定时取一定体积的发酵液，而后6000rpm离心15min，将上清液置于-20℃保存，以用于后续实验的测定。95℃烘箱中，烘干沉淀部分至恒重后，称重。
(2)发酵过程中土霉素浓度的HPLC测定方法
此测量采用Kromasil C18色谱柱(4.6×200mm，5μm)，柱温35℃，检测波长350nm，时间10min，进液量为10μL。
(3)流动相的配制
其中0.2M磷酸缓冲液需将磷酸溶于超纯水中混匀，并采用真空抽滤泵抽滤。
(4)标品的配制
配制10000U标品溶液，用0.01M盐酸稀释至1000U，-20℃保存，绘制标准曲线的各个标品浓度分别为0U、20U、40U、60U、80U、100U。经检测土霉素的出峰时间为3.7min(图1)，采用本方法测定土霉素的含量时，线性范围为0～100mg/L，且相关性R
(5)样品的酸化处理
土霉素形成盐类附在菌丝体，酸化后释放。取发酵液1mL，添加30μL左右的9M盐酸进行酸化，调节pH至1.5～1.7，振荡混匀，放置5min后，12000rpm离心5min，取上清液，将上清转移至另一个EP管中，-20℃保存。测定时，发酵液一般需要稀释，样品中的OTC浓度应不超过100U，用0.22μm滤膜过滤样品，HPLC测定。
实施例
实施例1、重组质粒pKCΔsig的构建
1、包含有龟裂链霉菌基因组DNA的提取：首先，将龟裂链霉菌(StreptomycesrimosusSRI05)接种至胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)中，30℃220rpm培养30h。其次，离心收集菌丝体，用无菌水洗涤菌丝体。然后采用溶菌酶破碎细胞壁，用酚-氯仿抽提去除蛋白质等杂质。最后用异丙醇沉淀获得基因组DNA。
2、以M4018基因组为模板使用下列引物进行PCR反应，扩增得到lsigB的部分片段，命名为KB片段，具体为lsigB基因内部第181bp到680bp，共500bp的DNA片段：
K-lsig BF：CGC
K-lsig BR：CTAG
3、重组质粒和菌株构建：将PCR扩增获得的KB片段连接到pMD-19商业质粒后用于测序，经公司测序结果为分析为与设计的KB片段一致。将得到的KB片段经BamHI和Xba I双酶切后纯化，将pKC1139质粒(获自University of Strathclyde，Glasgow，UK)，同样BamHI和Xba I双酶切后纯化，将二者连接，构建约为7kb的重组质粒pKC1139-lsigB(pKCΔsig)。
然后将重组质粒pKC1139-lsigB(pKCΔsig)转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布含有阿普拉霉素50μg/mL的LB平板，37℃静置培养12h，挑取平板上生长的单菌落至含阿普拉霉素50μg/mL的LB液体培养基中，37℃220rpm培养12h，提取质粒，采用限制性内切酶酶切后，上样0.8％琼脂糖凝胶电泳，筛选酶切片段大小正确的质粒即为重组载体pKCΔsig。
重组载体pKCΔsig的去甲基化：将保种的大肠杆菌ET12567/pUZ8002活化至含有34μg/ml氯霉素(chloroamphenicol)，25μg/ml卡那霉素(kanamycin)的LB平板上，37℃培养12h，而后挑取但菌落至3ml液体LB培养基(抗生素含量同上)中，37℃，220rpm培养12h，并制备ET12567感受态细胞。
将重组质粒pKCΔsig转化到ET12567/pUZ8002感受态细胞中，涂布的LB平板中需含有34μg/mL氯霉素(Chloroamphenicol)，25μg/mL卡那霉素(Kanamycin)以及25μg/mL阿普拉霉素(Apramycin)，挑取但菌落后，接入液体LB培养基中，37℃，220rpm培养12h。提取质粒，进行双酶切验证，从而得到去甲基化的重组质粒pKCΔsig。
实施例2、突变株的筛选及鉴定
当pKCΔsig质粒进入胞内后，只有当重组质粒上同源臂与基因组发生交换，使重组质粒整合到基因组上以后，抗性基因才可以表达出Apr抗性。同时pKC1139为温敏性质粒，温度较高时该质粒无法复制，游离的质粒会发生丢失，质粒上的序列通过同源交换能够使质粒整合于染色体上，从而抗性基因得到表达。所以，在37℃培养条件下筛选转化子，这时能够在抗性平板上生长的即为发生重组交换(pKCΔsig)的重组菌，通过PCR进一步鉴定重组菌。具体过程如下：
龟裂链霉菌的结合转移：将大肠杆菌ET12567-pKCΔsig接种至3mL液体LB(含50μg/mL阿普拉霉素，25μg/mL氯霉素，25μg/mL卡那霉素)培养基，37℃，220rpm，振荡培养过夜。将过夜菌液按1％的接种量接种到30mL液体LB(抗生素含量同上)培养基，37℃，220rpm，培养到OD600在0.3-0.5左右。6000rpm，4℃离心10min，收集菌体，用30mL新鲜的不含抗生素的液体LB洗涤后，倒去液体，2-3次。把菌体悬浮在2.5mL不含抗生素的液体LB中，作为结合转移中的供体。制备浓度已知的龟裂链霉菌孢子悬浮液(悬浮于无菌水中)。40℃培养孢子悬浮液10min，冷却至室温后加入0.5mL的TSB，250rpm，37℃，培养2-3h，该孢子悬浮液即为结合转移中的受体。各取受体和供体按菌量10
PCR验证时采用的引物如下：
上游引物AprF：TGCAATACGAATGGCGAAAAG(SEQ ID NO:9)；
下游引物AprR：TCGGCCCAGTTGACCCAGGG(SEQ ID NO:10)；
将上述获得的重组菌株即M4018::lsigB缺失突变株和对照菌株M4018接种至摇瓶，发酵，通过高效液相-质谱联用测定土霉素发酵液生物效价。
实施例3、发酵过程中菌体生长及土霉素发酵情况
在龟裂链霉菌M4018的发酵过程中，每12h取样6ml发酵液，其中5ml用于测量菌体干重，1ml用于HPLC测定土霉素产量，观察菌体生长状况以及生产土霉素的状况。
比较单位菌体的土霉素产量可见(图4)，相较于对照菌株M4018，ΔlsigB单位菌体的土霉素合成量提高了约23.2％。
综上，阻断lsigB对土霉素的合成具有显著的正调控作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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