专利摘要

本发明提供了一种如式(I)所示的环阿屯型三萜28,29‑降甲基‑3β,4β‑二羟基‑9,19‑环阿屯烷‑26‑酸，该化合物以古羊藤的藤茎为原料，经甲醇浸提、乙酸乙酯萃取、大孔树脂层析、一次柱层析、二次柱层析、洗涤除杂六步制备得到；本发明所述的环阿屯型三萜28,29‑降甲基‑3β,4β‑二羟基‑9,19‑环阿屯烷‑26‑酸的提取、分离、纯化方法简单，抑制肿瘤细胞活性明确，具有潜在的开发为抗肿瘤药物的价值；

权利要求

1.如式(I)所示的环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸：

2.如权利要求1所述式(I)所示环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法按如下步骤进行：

(1)甲醇浸提：将古羊藤的藤茎粉碎干燥，加入甲醇浸提提取，之后滤除不溶物，滤液减压蒸干得到甲醇浸膏；

(2)乙酸乙酯萃取：将步骤(1)所得甲醇浸膏分散于水中，再用乙酸乙酯萃取，萃取后的水相减压蒸干，得到水相浸膏；

(3)大孔树脂层析：用D-101型大孔树脂对步骤(2)所得水相浸膏进行柱层析分离，分别以纯水，体积分数30％、60％、90％的乙醇水溶液为洗脱剂，进行梯度洗脱，收集体积分数60％的乙醇水溶液的洗脱液，减压蒸除溶剂得大孔树脂层析产品；

(4)一次柱层析：对步骤(3)所得大孔树脂层析产品进行柱层析分离，以200～300目硅胶为柱填料，二氯甲烷/甲醇/水体积比12～1：1：0.01的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得一次柱层析产品；

(5)二次柱层析：对步骤(4)所得一次柱层析产品再次进行柱层析分离，以200～300目硅胶为柱填料，二氯甲烷/甲醇体积比18：1～4：1的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到二次柱层析产品；

(6)洗涤除杂：将步骤(5)所得二次柱层析产品用甲醇、二氯甲烷进行洗涤除杂，最后干燥得到式(I)所示的环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)甲醇浸提的操作方法为：将粉碎干燥后的古羊藤藤茎与甲醇以料液质量体积比1：3～5混合，常温浸提5～10天，过滤得到甲醇提取液，滤渣重复浸提2～4次，合并每次所得甲醇提取液，减压蒸干，得到甲醇浸膏。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)乙酸乙酯萃取的操作方法为：将步骤(1)所得甲醇浸膏分散于5～10倍质量的水中，得到悬浮液，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，取萃取后的水相减压蒸干，得到水相浸膏。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述梯度洗脱的操作方法为：以纯水，体积分数30％、60％、90％的乙醇水溶液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为15～20mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为500～600min，收集体积分数60％的乙醇水溶液的洗脱液，减压蒸除溶剂得大孔树脂层析产品。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述梯度洗脱的操作方法为：以二氯甲烷/甲醇/水体积比12：1：0.01、6：1：0.01、3：1：0.01、1：1：0.01的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为2～3mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为400～500min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到一次柱层析产品。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述梯度洗脱的操作方法为：以二氯甲烷/甲醇体积比分别为18：1、14：1、10：1、4：1的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为1～2mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为300～400min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到二次柱层析产品。

8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)洗涤除杂的操作方法为：将所述二次柱层析产品和甲醇按料液质量体积比1：1.5～2加入离心管中，40KHz超声10s，再向离心管中加入溶剂甲醇1～3倍体积量的溶剂二氯甲烷，震荡摇晃，静止分层后去除有色的上层液体，将下层液体干燥得到产物。

9.如权利要求1所述式(I)所示环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸在制备抗肿瘤活性药物中的应用。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸及其制备方法和应用。

(二)背景技术

萝藦科植物中的杠柳属(Periploca L.)、马利筋属(Asclepias curassavica L.)、牛角瓜属(Calotropis R.Br.)、鹅绒藤属(Cynanchum L.)、牛皮消属(Cynanchum L.)、牛奶菜属(Marsdenia R.Br.)、黑鳗藤属(Stephanotis Thou.)等的某些植物在我国作为药用植物和民间药用植物。传统中医认为其具有清热、祛风、除湿、活血、解毒、消肿的功效，常用于治疗如癌症、风湿关节炎、淋巴结核、痈肿疔毒、小儿疳积、哮喘、治蛇咬伤、跌打、肿瘤、疮毒等，此外还可作杀虫剂用于农业病虫害防。现代药理研究表明本科植物具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、免疫抑制等活性。

因此对该类植物进行系统、科学的研究，探明其有效成分及作用机理，发现一些结构新颖的活性成分，对更深层开发利用萝藦科药用植物的食疗保健产品、开发治疗药物及临床应用具有重要意义。

古羊藤为萝藦科(Asclepiadaceae)马莲鞍属(Streptocaulon Wight et Arn.)木质藤本植物马莲鞍(Streptocaulon griffithii)的根，又名马莲鞍、南苦参、老鸦嘴、滕苦参等，多生于20～1500m的山野坡地、山谷疏林或路旁灌木丛中，产于我国广西、贵州和云南等省区。

本发明以古羊藤的藤茎为研究对象，进行提取、分离、纯化、结构鉴定得到环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸，属于环阿屯型三萜化合物，该化合物具有一定程度的抗肿瘤活性。

(三)发明内容

本发明旨在提供一种环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸及其制备方法和应用。

本发明的技术方案如下：

如式(I)所示的环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸：

本发明还提供了式(I)所示环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸的制备方法，所述制备方法按如下步骤进行：

(1)甲醇浸提：将古羊藤的藤茎粉碎干燥，加入甲醇浸提提取，之后滤除不溶物，滤液减压蒸干得到甲醇浸膏；

所述古羊藤的藤茎可通过常规途径商购获得；

具体的，所述甲醇浸提的操作方法为：将粉碎干燥后的古羊藤藤茎与甲醇以料液质量体积比1：3～5(g：mL)混合，常温(20～30℃，下同)浸提5～10天，过滤得到甲醇提取液，滤渣重复浸提2～4次，合并每次所得甲醇提取液，减压蒸干，得到甲醇浸膏；

(2)乙酸乙酯萃取：将步骤(1)所得甲醇浸膏分散于水中，再用乙酸乙酯萃取，萃取后的水相减压蒸干，得到水相浸膏；

具体的，所述乙酸乙酯萃取的操作方法为：将步骤(1)所得甲醇浸膏分散于5～10倍质量的水中，得到悬浮液，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，取萃取后的水相减压蒸干，得到水相浸膏；

(3)大孔树脂层析：用D-101型大孔树脂对步骤(2)所得水相浸膏进行柱层析分离，分别以纯水，体积分数30％、60％、90％的乙醇水溶液为洗脱剂，进行梯度洗脱，收集体积分数60％的乙醇水溶液的洗脱液，减压蒸除溶剂得大孔树脂层析产品；

具体的，所述梯度洗脱的操作方法为：以纯水，体积分数30％、60％、90％的乙醇水溶液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为15～20mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为500～600min，收集体积分数60％的乙醇水溶液的洗脱液，减压蒸除溶剂得大孔树脂层析产品；

(4)一次柱层析：对步骤(3)所得大孔树脂层析产品进行柱层析分离，以200～300目硅胶为柱填料，二氯甲烷/甲醇/水体积比12～1：1：0.01的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得一次柱层析产品；

具体的，所述梯度洗脱的操作方法为：以二氯甲烷/甲醇/水体积比12：1：0.01、6：1：0.01、3：1：0.01、1：1：0.01的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为2～3mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为400～500min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到一次柱层析产品；

(5)二次柱层析：对步骤(4)所得一次柱层析产品再次进行柱层析分离，以200～300目硅胶为柱填料，二氯甲烷/甲醇体积比18：1～4：1的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到二次柱层析产品；

具体的，所述梯度洗脱的操作方法为：以二氯甲烷/甲醇体积比分别为18：1、14：1、10：1、4：1的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为1～2mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为300～400min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到二次柱层析产品；

(6)洗涤除杂：将步骤(5)所得二次柱层析产品用甲醇、二氯甲烷进行洗涤除杂，最后干燥得到式(I)所示的环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸；

具体的，所述洗涤除杂的操作方法为：将所述二次柱层析产品和甲醇按料液质量体积比1：1.5～2(g：mL)加入离心管中，40KHz超声10s，再向离心管中加入溶剂甲醇1～3倍体积量的溶剂二氯甲烷，震荡摇晃，静止分层后去除有色的上层液体，将下层液体干燥得到产物。

本发明所述步骤(4)、(5)的柱层析过程中，可通过薄层层析(TLC)检测收集含目标化合物(环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸)的洗脱液；所述的目标化合物用TLC检测时，以二氯甲烷：甲醇体积比＝5：1为展开剂，其R_f值为0.4。

经实验证明，本发明所述的环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸在制备抗肿瘤活性药物中具有应用前景。

本发明的有益效果在于：本发明所述的环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸的提取、分离、纯化方法简单，抑制肿瘤细胞活性明确，具有潜在的开发为抗肿瘤药物的价值。

(四)附图说明

图1：实施例5中顺铂(DDP)、环阿屯型三萜化合物(I)对四种癌细胞的半致死浓度(IC₅₀)。

(五)具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

以下实施例中用到的古羊藤的藤茎购自广西玉林中药材市场。

实施例1：环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸的制备

(1)甲醇浸提：将粉碎干燥后的古羊藤藤茎600g与甲醇2500mL混合，常温浸提7天，过滤得到甲醇提取液，滤渣重复浸提3次，合并每次所得甲醇提取液，减压蒸干，得到甲醇浸膏50g。

(2)乙酸乙酯萃取：将步骤(1)所得甲醇浸膏50g分散于水400mL中，得到悬浮液，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯萃取完的水相，减压浓缩，得到水相浸膏35g。

(3)大孔树脂层析：用D-101型大孔树脂对步骤(2)所得水相浸膏进行柱层析分离，分别以纯水，乙醇体积含量30％、60％、90％的水溶液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为20mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为500min，收集体积分数60％的乙醇水溶液的洗脱液，减压蒸除溶剂得大孔树脂层析产品6g；

(4)一次柱层析：用200～300目柱层析硅胶500g对步骤(3)所得大孔树脂层析产品6g进行柱层析分离，以二氯甲烷/甲醇/水体积比12:1:0.01、6:1:0.01、3:1:0.01、1:1:0.01的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为3mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为400min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得一次柱层析产品2.5g；

(5)二次柱层析：用300～400目柱层析硅胶300g继续对步骤(4)所得一次柱层析产品2.5g进行柱层析分离，以二氯甲烷/甲醇体积比分别为18:1、14:1、10:1、4:1的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为2mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为300min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到二次柱层析产品0.3g；

(6)洗涤除杂：在离心管中加入步骤(5)所得二次柱层析产品0.3g，再加入甲醇0.5mL，40KHz超声10s，溶解固体物质后，再向离心管中加入1mL的二氯甲烷，震荡摇晃，静止分层后去除有色的上层液体，最后将下层液体干燥得到产物环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸0.2g。

实施例2：环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸的制备：

(1)甲醇浸提：将粉碎干燥后的古羊藤藤茎1000g与甲醇4000mL混合，常温浸提5天，过滤得到甲醇提取液，滤渣重复浸提4次，合并每次所得甲醇提取液，减压蒸干，得到甲醇浸膏100g。

(2)乙酸乙酯萃取：将步骤(1)所得甲醇浸膏100g分散于水800mL中，得到悬浮液，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯萃取完的水相，减压浓缩，得到水相浸膏65g。

(3)大孔树脂层析：用D-101型大孔树脂对步骤(2)所得水相浸膏进行柱层析分离，分别以纯水，乙醇体积含量30％、60％、90％的水溶液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为20mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为600min，收集体积分数60％的乙醇水溶液的洗脱液，减压蒸除溶剂得大孔树脂层析产品11g；

(4)一次柱层析：用200～300目柱层析硅胶1000g对步骤(3)所得大孔树脂层析产品11g进行柱层析分离，以二氯甲烷/甲醇/水体积比12:1:0.01、6:1:0.01、3:1:0.01、1:1:0.01的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为3mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为500min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得一次柱层析产品4.5g；

(5)二次柱层析：用300～400目柱层析硅胶500g继续对步骤(4)所得一次柱层析产品4.5g进行柱层析分离，以二氯甲烷/甲醇体积比分别为18:1、14:1、10:1、4:1的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为2mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为400min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到二次柱层析产品0.5g；

(6)洗涤除杂：在离心管中加入步骤(5)所得二次柱层析产品0.5g，再加入甲醇0.8mL，40KHz超声10s，溶解固体物质后，再向离心管中加入2mL的二氯甲烷，震荡摇晃，静止分层后去除有色的上层液体，最后将下层液干燥得到产物环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸0.2g。

实施例3：环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸的制备：

(1)甲醇浸提：将粉碎干燥后的古羊藤藤茎600g与甲醇3000mL混合，常温浸提10天，过滤得到甲醇提取液，滤渣重复浸提2次，合并每次所得甲醇提取液，减压蒸干，得到甲醇浸膏56g。

(2)乙酸乙酯萃取：将步骤(1)所得甲醇浸膏56g分散于水500mL中，得到悬浮液，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯萃取完的水相，减压浓缩，得到水相浸膏38g。

(3)大孔树脂层析：用D-101型大孔树脂对步骤(2)所得水相浸膏进行柱层析分离，分别以纯水，乙醇体积含量30％、60％、90％的水溶液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为18mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为600min，收集体积分数60％的乙醇水溶液的洗脱液，减压蒸除溶剂得大孔树脂层析产品6.2g；

(4)一次柱层析：用200～300目柱层析硅胶500g对步骤(3)所得大孔树脂层析产品6.2g进行柱层析分离，以二氯甲烷/甲醇/水体积比12:1:0.01、6:1:0.01、3:1:0.01、1:1:0.01的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为3mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为500min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得一次柱层析产品2.6g；

(5)二次柱层析：用300～400目柱层析硅胶300g继续对步骤(4)所得一次柱层析产品2.6g进行柱层析分离，以二氯甲烷/甲醇体积比分别为18:1、14:1、10:1、4:1的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为2mL/min，每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为400min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到二次柱层析产品0.36g；

(6)洗涤除杂：在离心管中加入步骤(5)所得二次柱层析产品0.36g，再加入甲醇0.6mL，40KHz超声10s，溶解固体物质后，再向离心管中加入1mL的二氯甲烷，震荡摇晃，静止分层后去除有色的上层液体，最后将下层液干燥得到产物环阿屯型三萜28,29-降甲基-3β,4β-二羟基-9,19-环阿屯烷-26-酸0.25g。

实施例4：化合物测试

表1：实验所用仪器

试剂：核磁共振使用氘代CD₃OD(甲醇)试剂，质谱使用德国默克(Merck)色谱纯试剂。

对实施例1、实施例2或实施例3制得的环阿屯型三萜化合物(I)进行理化性质和波谱学分析，m.p.256-258℃，ESI-MS测定值m/z:447[M+H]⁺，结合NMR数据确定其分子式为C₂₉H₄₈O₄，分子量为446，不饱和度为6。

表2：所得环阿屯型三萜化合物(I)的NMR数据

实施例5：抗肿瘤活性测试

对上述实施例制得的环阿屯型三萜化合物(I)进行了体外抗肿瘤活性测试。

方法：取对数生长期肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度，每孔100μL细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，接种24h后给药(100μL/孔)，分别设细胞对照组以及4个浓度受试药物组。继续培养72h后每孔加入100μL MTT(1mg/mL，以DMEM培养液溶解)，37℃孵育2h，弃去各孔内液体后加入150μL酸化异丙醇(含0.04mol/L HCl)，避光放置30min，DG3022A型酶联免疫检测仪测定570nm处吸光度，计算各受试药物对肿瘤细胞的增殖抑制率，以孙瑞元教授编写的NDST计算机程序计算各受试药物的半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果：上述实施例所制得的环阿屯型三萜化合物(I)与DDP对照组相比较，高浓度时对人原髓细胞白血病HL-60细胞，人乳腺癌Bcap37细胞，人肝癌SMMC7721细胞及小鼠白血病P388细胞具有显著的体外增殖抑制作用，其中对人原髓细胞白血病HL-60细胞的抑制作用强于对其他三种肿瘤细胞。这提示该化合物是潜在的抗肿瘤活性的药物(表3)。

表3.环阿屯型三萜化合物(I)对四种肿瘤细胞的抑制活性(72h，μg/mL)

一种环阿屯型三萜化合物及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。