专利摘要

本发明公开了一种新的对映贝壳杉烯二萜化合物及其衍生物、其合成方法及其应用。本发明对映贝壳杉烯二萜化合物有如下结构：其通过如下方法制备：将冬凌草地上部分用有机溶剂浸泡，于40－60℃下，浸泡3小时－3天，然后浓缩除去大部分溶剂，浓缩液经大孔吸附树脂和硅胶反复层析分离即得济源冬凌草素A。该对映贝壳杉烯二萜可作为不对称有机化合物和药物合成的理想中间体，还可作为抗肿瘤、抗炎、免疫等药物使用。将其与羟基化合物缩合得到各种缩醛衍生物；将其与胺基化合物反应得到各种氨基衍生物；将其与酰卤、酸酐反应得到各种酰基化衍生物。

权利要求

1、新对映贝壳杉烯二萜化合物，其特征在于，其有如下结构式：

2、如权利要求1所述的新对映贝壳杉烯二萜化合物的衍生物，其特征在于，其有如下结构通式：

R＝CnH_2n+1(n＝1-12)，CH₂CH₂OH，CH₂CH₂Cl，

CH₂CH(OH)CH₂OH，CH₂CH₂CH₂OH，

CH₂CH(OH)CH₃，CH₂COOH

葡萄糖基，半乳糖基，木糖基，甘露糖基

通式1。

3、如权利要求1所述的新对映贝壳杉烯二萜化合物的衍生物，其特征在于，其有如下结构通式：

R₁＝H，CnH_2n+1(n＝1-12)，CH₂CH₂OH，CH₂CH₂Cl

CH₂CH(OH)CH₂OH，CH₂CH₂CH₂OH，

CH₂CH(OH)CH₃，CH₂COOH

葡萄糖基，半乳糖基，木糖基，甘露糖基

R₂＝CnH_2n+1(n＝1-12)，o，m，p-Cl-C₆H₅，

o，m，p-Br-C₆H₅，o，m，p-F-C₆H₅，C₆H₅

通式2。

4、如权利要求1所述的新对映贝壳杉烯二萜化合物的衍生物，其特征在于，其有如下结构通式：

R₁＝H，C_nH_2n+1(n＝1-12)，CH₂CH₂OH，CH₂CH₂Cl

  CH₂CH(OH)CH₂OH，CH₂CH₂CH₂OH，

  CH₂CH(OH)CH₃，CH₂COOH

葡萄糖基，半乳糖基，木糖基，甘露糖基

R₂，R₃＝H或C₁-C₁₂的酰基

通式3。

5、如权利要求1所述的新对映贝壳杉烯二萜化合物的提取分离方法，其特征在于，将冬凌草地上部分用有机溶剂浸泡，其中所用提取溶剂为乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚中的一种；于40-60℃下，浸泡3小时-3天，然后浓缩除去85％-90％溶剂，浓缩液经LDA-10型大孔吸附树脂和硅胶反复层析分离，经重结晶，其中重结晶所用溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、异丙醇中的一种，即得到对映贝壳杉烯二萜。

6、如权利要求2所述的新对映贝壳杉烯二萜化合物的衍生物的合成方法：其特征在于，将本发明分离得到的对映贝壳杉烯二萜溶于有机溶剂中，其中所用有机溶剂为硝基甲烷、乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇、1，2-二氯乙烷、三氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、二氧六环、四氢呋喃中的一种，在酸性催化剂存在下，于0-100℃条件下与羟基化合物进行缩合反应，反应物的摩尔比例为1∶1-100或以羟基化合物同时做反应溶剂；反应时间为1-72小时，反应结束后蒸干溶剂，重结晶，其中重结晶所用溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、乙酸乙酯中的一种，即得通式1所示化合物。

7、如权利要求3所述的新对映贝壳杉烯二萜化合物的衍生物的合成方法，其特征在于，将本发明制得的对映贝壳杉烯二萜或其如通式1所示衍生物溶于有机溶剂中，其中所用溶剂为硝基甲烷、乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇、1，2-二氯乙烷、三氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环中的一种，在酸性催化剂存在下与胺基化合物反应，反应物摩尔比例为1∶1-20；反应温度控制在10-90℃；反应时间为2-72小时，经薄层层析法监测至原料消失结束反应，蒸干溶剂，重结晶或柱层析分离得通式2所示化合物，其中重结晶所用溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、乙酸乙酯中的一种。

8、如权利要求4所述的新对映贝壳杉烯二萜化合物的衍生物的合成方法，其特征在于，将本发明制得的对映贝壳杉烯二萜或其如通式1所示衍生物溶于有机溶剂中，其中所用有机溶剂为硝基甲烷、乙腈、1，2-二氯乙烷、三氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、吡啶、三乙胺中的一种，在碱性催化剂存在下与酸酐或酰卤反应，反应物摩尔比例为1∶1-20；反应温度控制在0-90℃；反应时间为1-72小时，经薄层层析法监测至原料消失结束反应，蒸干溶剂，重结晶或柱层析分离得通式3所示化合物，其中重结晶所用溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、乙酸乙酯中的一种。

9、如权利要求6或7或8所述的对映贝壳杉烯二萜衍生物的合成方法，其特征在于，所用酸性催化剂为盐酸、氯化铵、硫酸、硫酸铵、对甲基苯磺酸中的一种；所用碱性催化剂为甲醇钠、乙醇钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氟化钾、吡啶、二乙胺、三乙胺、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶中的一种。

10、如权利要求1所述的新对映贝壳杉烯二萜化合物以及权利要求2、权利要求3和权利要求4所述的新对映贝壳杉烯二萜化合物的衍生物的应用，其特征在于，作为抗炎药、抗肿瘤药和免疫调节剂使用；作为糖苷酶抑制剂使用。

说明书

技术领域

本发明涉及系列有机化合物及其制备方法，尤其涉及对映贝壳杉烯类二萜化合物及其衍生物和其提取、制备方法及用途。

背景技术

系唇形科香茶菜属植物的冬凌草中含有丰富的二萜成分，迄今为止从该属植物中已经分离鉴定出500余个二萜，其中许多具有对映-贝壳杉烯型结构的二萜被发现具有抗菌活性、细胞毒活性、抗肿瘤活性、抑制线粒体的氧化磷酸化作用、昆虫据食活性、植物生长调节剂活性、抗炎以及心血管系统等方面的活性。(a、S Ttanaba and H Nishikawa，Jpn J Bact，1954，(9)，475；b、M Yamaguchi，M Taniguchi，I Kubo and T Kubota，Agr Biol Chem，1977，41，2475；c、T Arai，Y Koyama，T Suenaga and T Morita，Chemotherapy，1962，10，197；d、M Taniguchi，M Yamaguchi，I Kubo and T Kubota，Agr BioiChem，1979，43，71；e、李琦，陈正，刘洁，孙汉董，林中文，中国药理学通报，1992，8(1)，3；f、李惠兰，王懋德，张肇玖，中药通报，1988，18(10)，46)因此研究开发该属植物，特别是具有良好抗肿瘤活性的对映贝壳杉烯类二萜具有重要的理论和实用价值。

含有α-环外亚甲基环戊酮单元的对映-贝壳杉烯型二萜结构如下：

其中，α-环外亚甲基环戊酮单元经研究被确定为抗肿瘤的活性中心(a、STtanaba and H Nishikawa，Jpn J Bact，1954，(9)，475；b、T Arai，Y Koyama，TSuenaga and T Morita，J Antibiotics Ser，1963，A16，132；c、I Kubo，MTaniguchi，Y Satomura and T Kubota，Agr Biol Chem，1974，38，1261；d、T Arai，Y Koyama，T Morita and H Kaji，Chemotherapy，1961，9，403；f、I Kubo，MTaniguchi and T Kubota，Rev Latinoamer Quim，1978，(9)，157)。冬凌草甲素是这类结构的代表，目前以对冬凌草甲素的研究较为活跃，河南医科大学的张覃沐研究小组，日本的Fujita研究小组等都对其做了大量的药理实验工作，证明冬凌草甲素具有确切的体外、体内抗肿瘤活性，其抗瘤谱也较广，对人体鼻咽癌细胞、人体肝癌细胞、人体子宫颈癌细胞、食管癌细胞等均有明显的杀伤作用。但是由于冬凌草甲素的稳定性不好，水溶性较差，而冬凌草甲素提取液不易进行质量控制，使冬凌草的开发受到一定的限制。我们在以前研究工作的基础上利用冬凌草含量较高的抗肿瘤活性好的二萜成分，开发出新的药物化合物，对开发我国中草药冬凌草具有很高的应用价值及现实意义。并且在不破坏其活性中心的基础上合成和发现更多的抗肿瘤活性更高、毒性更低、性质更优越的衍生物。

发明内容

本发明目的在于提供一种从冬凌草中提取出的新对映贝壳杉烯类二萜化合物及其系列衍生物；本发明另一目的在于提供该二萜化合物的提取方法、其衍生物的合成方法和应用。

为实现本发明目的，本发明技术方案如下：

本发明以冬凌草为原料，在一定提取分离条件下，得到对映贝壳杉烯类二萜，它是一个新的未见报导的天然二萜。

该对映贝壳杉烯类二萜结构式如下所示：

其通过如下方法提取分离提纯：将冬凌草地上部分用有机溶剂浸泡，于40-60℃下，浸泡3小时-3天，然后浓缩除去85％-90％溶剂，浓缩液经LDA-10型大孔吸附树脂和硅胶反复柱层析分离即得到该对映贝壳杉烯类二萜，经重结晶得到其纯品。

其中，所用提取溶剂为乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚中的一种；重结晶所用溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、异丙醇中的一种。

将上述所得的对映贝壳杉烯类二萜与羟基化合物反应得到如通式1所示的化合物。

R＝CnH_2n+1(n＝1-12)，CH₂CH₂OH，CH₂CH₂Cl，

CH₂CH(OH)CH₂OH，CH₂CH₂CH₂OH，

CH₂CH(OH)CH₃，CH₂COOH

葡萄糖基，半乳糖基，木糖基，甘露糖基等

通式1

通式1所示化合物具体通过如下方法制备：将本发明分离得到的对映贝壳杉烯类二萜溶于有机溶剂中，在酸催化剂存在下，于0-100℃条件下与羟基化合物进行缩合反应，反应1-72小时。反应结束后蒸干溶剂，重结晶得通式1所示化合物。

其中，所用有机溶剂为硝基甲烷、乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇、1，2-二氯乙烷、三氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、二氧六环、四氢呋喃中的一种；缩合反应所用催化剂为盐酸、氯化铵、硫酸、硫酸铵、对甲基苯磺酸中的一种；重结晶所用溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、乙酸乙酯中的一种。

将如上所得的对映贝壳杉烯类二萜或如通式1所示其衍生物与胺基化合物反应得到如通式2所示化合物。

R₁＝H，CnH_2n+1(n＝1-12)，CH₂CH₂OH，CH₂CH₂Cl

    CH₂CH(OH)CH₂OH，CH₂CH₂CH₂OH，

    CH₂CH(OH)CH₃，CH₂COOH

葡葡糖基，半乳糖基，木糖基，甘露糖基等

R₂＝CnH_2n+1(n＝1-12)，o，m，p-Cl-C₆H₅，

    o，m，p-Br-C₆H₅，o，m，p-F-C₆H₅，C₆H₅

通式2

通式2所示化合物通过如下方法制备：将本发明制得的对映贝壳杉烯类二萜或如通式1所示其衍生物溶于有机溶剂中，在酸催化剂存在下与胺基化合物反应，反应温度控制在10-90℃；反应时间为2-72小时，经薄层层析法监测至原料消失结束反应。蒸干溶剂，重结晶或柱层析分离得产物。

其中，所用溶剂为硝基甲烷、乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇、1，2-二氯乙烷、三氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环中的一种；加成反应所用催化剂为盐酸、氯化铵、硫酸、硫酸铵、对甲基苯磺酸中的一种；重结晶所用溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、乙酸乙酯中的一种。

将如上所得的对映贝壳杉烯类二萜或如通式1所示其衍生物与酸酐或酰卤反应得到如通式3所示化合物。

R₁＝H，C_nH_2n+1(n＝1-12)，CH₂CH₂OH，CH₂CH₂Cl

    CH₂CH(OH)CH₂OH，CH₂CH₂CH₂OH，

    CH₂CH(OH)CH₃，CH₂COOH

葡萄糖基，半乳糖基，木糖基，甘露糖基等

R₂，R₃＝H或C₁-C₁₂的酰基

通式3

通式3所示化合物通过如下方法制备：将本发明制得的对映贝壳杉烯类二萜或如通式1所示其衍生物溶于有机溶剂中，在碱催化剂存在下与酸酐或酰卤反应，反应温度控制在0-90℃；反应时间为1-72小时，经薄层层析法监测至原料消失结束反应。蒸干溶剂，重结晶或柱层析分离得产物。

其中，所用溶剂为硝基甲烷、乙腈、1，2-二氯乙烷、三氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、吡啶、三乙胺中的一种；酰化反应所用催化剂为甲醇钠、乙醇钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氟化钾、吡啶、二乙胺、三乙胺、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶中的一种或两种；重结晶所用溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、乙酸乙酯中的一种。

对映贝壳杉烯类二萜和其衍生物有如下用途：作为抗炎药、抗肿瘤药和免疫调节剂使用；作为糖苷酶抑制剂使用；作为抗其它疾病的药物使用；作为各种医药品的中间体使用；作为手性合成和有机合成的中间体使用。

本发明的优点在于：该合成方法简单易行，条件温和，所得产物收率较高。用该方法所提取的对映贝壳杉烯类二萜具有经研究确证有各种活性的α-环外亚甲基环戊酮单元，并有7，20位半缩醛结构，20位半缩醛羟基很活泼，11β-OH和14β-OH也有可能作为与肿瘤细胞中特殊酶的结合位点而起增强抗癌活性的作用。经初步生物活性筛选发现对映贝壳杉烯类二萜及以其为底物合成的衍生物均有较高的抗炎、抗肿瘤和免疫调节活性，本发明为抗肿瘤药物提供了更多的备选化合物，同时也为我国中草药冬凌草的开发提供了更多的途径，相信随着生物医药科学的发展，本发明将具较好的应用前景。

具体实施方式

为对本发明进行更好地说明，特举实施例如下：

实施例1  提取分离对映贝壳杉烯类二萜(济源冬凌草素A)

将济源冬凌草干燥的地上部分(3kg)置于浸泡釜中，于50℃下，加入70％的丙酮40L，提取3小时。提取结束后，浓缩提取液至约3L，将此浓缩液于LDA-10型大孔树脂柱上粗分，30％丙酮洗脱部分浓缩后再反复经柱层析，然后重结晶即得对映贝壳杉烯类二萜，称其为济源冬凌草素A，实验数据如下：

Amorphous powder；Mp 211-212℃；[α]_D²⁵-80.3°(MeOH，c 0.22)；λ_max^MeOH nm(logε)：233(3.96)；IRν_max^KBr cm^-1：3590，3394，2932，1722，1646，1334，1254，1096，1032 and 990；HR-ESIMS m/z：371.1829[M+Na]⁺forC₂₀H₂₈O₅(cacld.371.1834)；¹H-NMR spectral data(400MHz，DMSO-d₆)：2.02(1H，d，J＝12.0Hz，H-1α)，1.29(1H，m，H-1β)，1.36(2H，br s，H-2)，1.06(1H，m，H-3α)，1.42(1H，d，J＝13.4，H-3β)，1.15(1H，overlap，H-5β)，1.52(1H，m，H-6α)，2.63(1H，t，J＝12.0Hz，H-6β)，3.94(1H，d，J＝2.9Hz，H-7β)，1.14(1H，d，J＝8.4Hz，H-9β)，4.60(1H，q，J＝8.4Hz，H-11α)，2.56(1H，m，H-12α)，1.25(1H，m，H-12β)，2.78(1H，d，J＝9.1Hz，H-13α)，4.74(1H，s，H-14α)，5.77(1H，s，H-17a)，5.35(1H，s，H-17b)，0.82(3H，s，H-18)，0.90(3H，s，H-19)，5.69(1H，s，H-20)；¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ206.2，152.9，115.9，92.5，69.6，64.9，63.4，57.7，56.4，48.5，42.8，42.1，40.7，39.6，33.9，33.0，30.7，24.7，21.0，18.0。

实施例2  制备通式1所示的衍生物

将上述制得的对映贝壳杉烯类二萜(174ng，0.5mmol)溶于乙醇(20mL)中，加入催化量的对甲基苯磺酸，25℃反应3小时。反应结束后浓缩反应液，甲醇重结晶，得到通式1所示的衍生物190g，收率95％。实验数据如下：

Prismatic crystal；Mp 183.2-185.8℃；[α]_D²⁵ -42.0°(c MeOH，0.22)；λ_max^MeOH nm(logε)：233(3.99)；IRν_max^KBr cm^-1：3347，2958，2933，1724，1645，1361，1263，1099，1025，994 and 935；HR-ESIMS m/z：399.2145[M+Na]⁺forC₂₂H₃₂O₅(cacld.399.2147)；¹H-NMR spectral data(400MHz，CDCl₃)：2.03(1H，d，J＝11.2Hz，H-1α)，1.37(1H，overlap，H-1β)，1.51(2H，br s，H-2)，1.13(1H，m，H-3α)，1.48(1H，d，J＝13.2，H-3β)，1.34(1H，overlap，H-5β)，1.69(1H，m，H-6α)，2.79(1H，overlap，H-6β)，4.07(1H，d，J＝4.0Hz，H-7β)，1.41(1H，d，J＝9.6Hz，H-9β)，4.41(1H，q，J＝8.8Hz，H-11α)，2.58(1H，overlap，H-12α)，1.25(1H，overlap，H-12β)，2.97(1H，d，J＝9.4Hz，H-13α)，4.85(1H，s，H-14α)，6.03(1H，s，H-17a)，5.41(1H，s，H-17b)，0.86(3H，s，H-18)，0.96(3H，s，H-19)，5.21(1H，s，H-20)，3.84(1H，m，H-21a)，3.42(1H，m，H-21b)，1.23(3H，s，H-22)；¹³C-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ205.3，150.8，117.5，99.8，71.5，66.3，65.2，63.9，58.1，56.8，48.4，42.0，41.4，40.5，39.8，34.0，32.8，30.5，24.6，20.9，18.2，15.4。

实施例3  制备通式2所示的衍生物

将实施例2制备所得的对映贝壳杉烯类二萜衍生物(200mg，0.5mmol)溶于四氢呋喃(15mL)中，加入苯胺56mg(0.6mmol)，再加入催化剂对甲基苯磺酸(2mg)，于50℃下搅拌24小时。反应结束后浓缩反应液，甲醇结晶，得到通式2所示的衍生物210mg，收率89％。实验数据如下：

Prismatic crystal；Mp 183.2-185.8℃；[α]_D²⁵ -72.3°(c MeOH，0.22)；λ_max^MeOH nm(logε)：230(3.95)；IRν_max^KBr cm^-1：3595，3452，2955，1747，1589，1512，1453，1376，1273，702；HR-ESIMS m/z：492.2730[M+Na]⁺forC₂₈H₃₉NO₅(cacld.492.2726)；¹H-NMR spectral data(400MHz，DMSO-d₆)：2.03(1H，d，J＝12.0Hz，H-1α)，1.27(1H，m，H-1β)，1.36(2H，overlap，H-2)，1.07(1H，m，H-3α)，1.45(1H，d，J＝13.4，H-3β)，1.15(1H，d，J＝12Hz，H-5β)，1.54(1H，m，H-6α)，2.65(1H，overlap，H-6β)，3.98(1H，m，H-7β)，1.10(1H，s，H-9β)，4.57(1H，q，J＝8.4Hz，H-11α)，2.44(1H，m，H-12α)，1.23(1H，m，H-12β)，2.89(1H，m，J＝9.1Hz，H-13α)，4.64(1H，s，H-14α)，3.56(1H，m，H-16)，4.00(1H，m，H-17a)，3.49(1H，m，H-17b)，0.83(3H，s，H-18)，0.90(3H，s，H-19)，5.63(1H，s，H-20)，3.81，3.37(each 1H，m，H-21)，1.20(3H，s，H-22)，6.56(2H，d，J＝8.0Hz，H-2’)，7.06(2H，t，J＝8.0Hz，H-3’)，6.50(1H，t，J＝7.2Hz，H-4’)；¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ206.2，149.0，129.1，115.5，112.1，98.6，67.3，65.6，64.2，63.1，57.8，55.6，49.0，43.2，40.1，39.8，38.5，37.8，34.0，33.3，30.8，28.7，24.9，21.3，18.2，16.2。

实施例4  制备通式3所示的衍生物

将对映贝壳杉烯类二萜(174g，0.5mmol)溶于吡啶(20mL)中，加入乙酸酐2ml(21mmol)，于80℃搅拌反应10小时；冰水浴降温至20℃，加入饱和NaHCO₃水溶液搅拌，直至无气泡放出为止；用乙酸乙酯萃取3次，将有机层用水反复洗涤，再用无水Na₂SO₄干燥；减压蒸干溶剂，用乙醇∶水(3∶1)重结晶，得白色固体183mg，产率81％。实验数据如下：

Prismatic crystal；Mp 163.5-166℃；[α]_D²⁵ -68.5°(c MeOH，0.25)；λ_max^MeOH nm(logε)：235(4.02)；IRν_max^KBr cm^-1：3592，3352，2964，2938，1738，1734，1724，1648，1361，1284，1247，1157，1118，1081，1040 and 1007；HR-ESIMS m/z：45 5.2049[M+Na]⁺for C₂₄H₃₂O₇(cacld.455.2046)；1H-NMRspectral data(400MHz，CDCl₃)：2.01(1H，d，J＝11.2Hz，H-1α)，1.38(1H，overlap，H-1β)，1.53(2H，br s，H-2)，1.09(1H，m，H-3α)，1.51(1H，d，J＝13.2，H-3β)，1.35(1H，overlap，H-5β)，1.69(1H，m，H-6α)，2.75(1H，overlap，H-6β)，4.09(1H，d，J＝4.0Hz，H-7β)，1.40(1H，d，J＝9.6Hz，H-9β)，4.56(1H，q，J＝8.8Hz，H-11α)，2.61(1H，overlap，H-12α)，1.25(1H，overlap，H-12β)，3.01(1H，d，J＝9.4Hz，H-13α)，4.93(1H，s，H-14α)，6.05(1H，s，H-17a)，5.45(1H，s，H-17b)，0.86(3H，s，H-18)，0.96(3H，s，H-19)，5.67(1H，s，H-20)，2.15(3H，s，H-22)，2.08(3H，s，H-24)；13C-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ 205.8，170.5，169.3，148.5，114.9，93.2，68.5，64.1，62.5，58.2，56.2，47.8，42.5，41.6，41.2，39.9，33.3，33.0，30.7，24.7，21.0，20.5，19.9，18.3。

上述化合物抗食管癌Ea109细胞活性数据如下：

活性测试方法如下：以人食管癌Ea109细胞(河南省医学科学研究所)为靶细胞，用含10％胎牛血清(TBD)的RPMI 1640培养基(GIBCO)在37度，5％CO₂下培养。取对数生长期的细胞于96孔板的每个孔中接种6×10³个细胞，培养24h后，向相应孔内加入不同浓度的化合物济源冬凌草素A，衍生物1[通式1(R＝CH₃)]和衍生物2[通式1(R＝CH₂CH₃)]样品，继续培养48h，小心吸去药液，用不含血清的RPMI 1640培养液洗3遍。每孔加入含0.2mg/mL MTT的培养基200μL，37℃孵育4h，吸去上清液，加入200μLDMSO，振荡10min，在ELISA酶标仪上比色测定对照组和各加样组的OD值，测定波长为570nm，参考波长为450nm。计算各加药浓度处理的药物对细胞的抑制率，据细胞抑制曲线计算药物的半抑制浓度IC₅₀(μg/mL)。

对映贝壳杉烯类二萜化合物及其衍生物、其制备方法和用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。