专利摘要

本发明涉及医药技术领域。本发明提供了从采自南海的三种珊瑚(Muriceopsis flavida，Sarcophyton sp.，Anthogorgia sp.)中分离得到的具有抗菌、抗微藻活性的一类多羟基甾体类化合物具有如下化学结构通式。本发明的化合物Muristeroids A～G，Sarcsteroids A～F，Anthsteroids A～B，胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯，胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇，(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇，24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇，经体外抗菌试验表明，对于真菌、细菌和藻类均具有明显的抑制效果，可用于制备抗菌及抗微藻药物。本发明对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及从海洋无脊椎动物-珊瑚(Muriceopsis flavida，Sarcophyton sp.，Anthogorgia sp.)中分离得到的15个新的具有抗菌、抗微藻活性的多羟基甾体类化合物Muristeroids A～G，Sarcsteroids A～F，AnthsteroidsA～B和6个已知的具有抗菌、抗微藻活性的多羟基甾体类化合物：胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯，胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇，(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇，24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇的新用途。

背景技术

中国南海地处亚热带区域，珊瑚资源尤为丰富，是世界上珊瑚最集中分布的海域之一，目前全世界发现的6100多种珊瑚中，中国海域就有719种。珊瑚是无脊椎低等动物，为众多的生物提供栖息地，如多毛科，双壳科，腹足科，鱼类等。珊瑚虽然自身缺乏有效的物理防御能力，却能分泌一些化学防御物质，抵御病原虫和其他生物的侵扰，这一现象是国际上研究珊瑚体内次级代谢产物的理论基础。珊瑚依据消化腔的分支数目可以分为八放珊瑚和六放珊瑚两个亚纲，八放珊瑚亚纲中的软珊瑚和柳珊瑚因含有结构新颖、生物活性良好的次级代谢产物而成为海洋天然产物研究的热点。

紫柳珊瑚(Muriceopsis flavida)属腔肠动物门(Coelenterata)珊瑚虫纲(Anthoaoa)八放珊瑚亚纲(Octocorallia)柳珊瑚目(Gorgonacea)丛柳珊瑚科(Pexuridae)Muriceopsis属动物。紫柳珊瑚主要分布于太平洋东部，加利福尼亚海岸以及加勒比海海区。目前，国内外有关该属珊瑚化学成分研究的报道只有一篇，从中得到了5个四位甲基化甾醇[Kokke WCMC，Bihlin L，Fenical W，Djerassi C.Novel dinoflagaellate 4α-methylated sterols from four Caribbean gorgonians[J].Phytochemistry，1982，21(4)：881-887]，并未见其活性报道的相关文献。

肉芝软珊瑚(Sarcophyton sp.)属于软珊瑚目(Alcyonacea)软珊瑚科(Alcyonacea)肉芝软珊瑚属(Sarcophyton)动物。该属软珊瑚种类多样，分布广。高度氧化的稀松烷二萜和甾醇是该属软珊瑚的主要代谢产物，除了稀松烷二萜和甾醇外，还从中发现了结构非常奇特的二聚稀松烷型的四萜。迄今已从该属珊瑚中发现了180多个新的化合物。印度学者Anjaneyulu曾对肉芝软珊瑚的化学成分研究状况做了详尽的综述[Anjaneuyulu A.S.R.，Rao G.V.J.Ind.Chem.Soc.，1997，74，272.]。

块花柳珊瑚(Anthogorgia sp.)属于柳珊瑚目(Gorginacea)棘柳珊瑚科(Acanthogorgiidae)动物。文献检索未发现有关块花柳珊瑚化学成分研究的相关报道。

发明内容

本发明提供从三种南海珊瑚(Muriceopsis flavida，Sarcophyton sp.，Anthogorgia sp.)中提取分离得到的21个多羟基甾体类化合物，分别命名为Muristeroids A～G，Sarcsteroid A～F，Anthsteroids A～B，胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯，胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇，(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇，24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇。其中化合物Muristeroids A～G和胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯，胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇，(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇，24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇是从紫柳珊瑚中分离得到的，化合物Sarcsteroids A～F是从肉芝软珊瑚中分离得到的，化合物Anthsteroids A～B是从块花柳珊瑚中分离得到的，它们的化学结构通式如下：

其中Muristeroids A～G、Sarcsteroids A～F、Anthsteroids A～B为新化合物。

Muristeroid A为白色粉末，系统命名为(22E)-22-烯-24-降胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 469.3294[M+Na]⁺，及碳谱氢谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₈H₄₆O₄，分子量为446； IR(film)v_max：3454，2953，2941，2867，1716，1599，1496，1452，1382，1367，1281，1161，1037，968，699；UV(CHCl₃)λ_maxnm(Abs)：257(0.3642)；¹H和¹³C核磁共振数据见表1。

Muristeroid B为白色粉末，系统命名为(22E)-22-烯-胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z483.2188[M+Na]⁺，及碳谱氢谱解析，给出该化合物的分子式C₂₉H₄₈O₄，分子量460； 红外光谱IR(film)v_max：3369，2956，2927，1736，1664，1599，1458，1378，1260，1043，968，699；UV(CHCl₃)λ_max nm(Abs)：240(0.8793)；¹H和¹³C核磁共振数据见表2。

Muristeroid C为白色粉末，系统命名为(22E)-22-烯-5α-甲氧基-胆甾-3β，6β-二醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z455.3498[M+Na]⁺，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₈H₄₈O₃，分子量432； 红外光谱IR(film)v_max：3374，3026，2929，2867，1600，1496，1454，1379，1262，1078，1032，754，699；UV(CHCl₃)λ_max nm(Abs)：337(0.4653)；¹H和¹³C核磁共振数据见表3。

Muristeroid D为白色粉末，系统命名为(22E)-22-烯-24-降胆甾-3β，5α，6β-二醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z427.6338[M+Na]⁺，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₆H₄₄O₃，分子量404； 红外光谱IR(film)v_max：3373，3026，2959，2928，2854，1600，1496，1453，1379，1302，1260，1040，966，749，699；UV(CHCl₃)λ_max nm(Abs)：278(0.4411)；¹H和¹³C核磁共振数据见表4。

Muristeroid E为白色粉末，系统命名为24(25)-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 441.6371[M+Na]⁺，结合氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₇H₄₆O₃，分子量418；、¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、¹H-¹HCOSY、NOESY、HMBC、HMQC确定化合物结构，¹H和¹³C核磁共振数据见表5。

Muristeroid F为白色粉末，系统命名为(22E)-22-烯-24-降胆甾1β，3β，5α，6β-四醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z443.2857[M+Na]⁺，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₆H₄₄O₄，分子量420； 红外光谱IR(film)v_max：3316，2953，2926，2851，1600，1496，1455，1379，1212，1098，1040，1009，960；UV(CHCl₃)λ_max nm(Abs)：278(0.1204)；¹H和¹³C核磁共振数据见表6。

Muristeroid G为白色粉末，系统命名为(22E)-22-烯-胆甾1β，3β，5α，6β-四醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 457.3291[M+Na]⁺，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₆H₄₄O₄，分子量434； 红外光谱IR(film)v_max：3337，2951，2927，2867，1604，1459，1371，1042，1007，964；¹H和¹³C核磁共振数据见表7。

胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯：为白色粉末，由ESI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT及结合文献确定化合物结构[Joao FS Carvalho，M Manuel Cruz Silva，MLuisa Sa Emelo.Efficient trans-diaxial hydroxylation of △⁵ steroids[J].Tetrahedron，2010，66；2455-2462]。

胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇：为白色粉末。由ESI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT及结合文献确定化合物结构[Blunt J W，Fischer A，Hartshorn M P，Jones FW，Kirk D N，Yoong S W.Acid catalyzed reactions of 5α-hydroxy steroids.III.Westphalen rearrangement[J].Tetrahedron，1965，21(6)；1567-1580]。

(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇：白色粉末，由ESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR并结合文献确定化合物结构[Giacino Notaro，Bincenzo Piccialli，Donato Sica.3β，5α，6β-trihydrolylated sterols with a saturated mucleus from two populations of the marine sponge Cliona copiosa[J].Journal of natural products，1991，54(6)；1570-1575]。

24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇：白色粉末，由ESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR并结合文献确定化合物结构[Kobasyashi，Masaru，Madala M Krishna，et al.Isolation of 23-Demethylgorgost-7-ene-3β，5α，6β-triol and(24)-Ergostane-3β，5α，6β，7β，15β-pentol from soft corals of the Andaman and Micobar coasts[J].Chemical & Phamaceutical Bulletin，1993，41(1)；87-89]。

胆甾-3β，5c，6β-三醇：白色粉末，由ESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR并结合文献确定化合物结构[Giacomo Notaro，Vincenzo Piccialli，Donato Sica.3β，5α，6β-trihydrolylated sterols with a saturated nucleus from two populations of the marine sponge Cliona copiosa[J].Journal of natural products.1991，54(6)；1570-1575]。

胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇；白色粉末，由ESIMS、¹H-NMR、¹³C-NMR并结合文献确定化合物结构[Kobayashi Masaru，Hayashi Takaaki，Nakajima Fumie，Mitsuhashi Hiroshi.Marine steroids.IX.Occurrence of 24ε-methylcholastane-1β，3β，5α，6β，25-pentol-25-monoacetate in the soft coral Sarcophyton glaucum[J].Steroids，1979，34(3)；285-293]。

Sarcsteroid A为白色粉末，系统命名为11α-乙酰氧基-24-甲基-22(23)，25(27)-二烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 511.2634[M+Na]⁺，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₃₀H₄₈O₅，分子量488；通过¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT，及全套二维核磁共振确定化合物结构；¹H和¹³C核磁共振数据见表8。

Sarcsteroid B为白色无定形粉末，系统命名为11α-乙酰氧基-24(25)-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 499.4274[M+Na]⁺，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₉H₄₈O₅，分子量476；通过¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT，及全套二维核磁共振确定化合物结构；¹H和¹³C核磁共振数据见表9。

Sarcsteroid C为白色粉末状固体，系统命名为23，24-二甲基-22(23)-二烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 485.3532[M+Na]⁺，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₉H₅₀O₅，分子量478；通过¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT，及全套二维核磁共振确定化合物结构；¹H和¹³C核磁共振数据见表10。

Sarcsteroid D为白色粉末状固体，系统命名为23，24-二甲基-22(23)-二烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 485.3532[M+Na]⁺，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₉H₅₀O₅，分子量478；通过¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT，及全套二维核磁共振确定化合物结构；¹H和¹³C核磁共振数据见表11。

Sarcsteroid E为白色粉末状固体，系统命名为11α-乙酰氧基-gorgostane-3β，5α，6β，12α-四醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 557.5432[M+Na]⁺，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₃₂H₅₄O₆，分子量534；通过¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT，及全套二维核磁共振确定化合物结构；¹H和¹³C核磁共振数据见表12。

Sarcsteroid F为白色粉末状固体，系统命名为(24S)-24-甲基-胆甾-1α，3β，5α，6β，11α-五醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 489.4582[M+Na]⁺，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₈H₅₀O₅，分子量466；通过¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT，及全套二维核磁共振确定化合物结构；¹H和¹³C核磁共振数据见表13。

AnthsteroidA为白色粉末状固体，系统命名为胆甾-3β，5α，6β，11α-四醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 435.3476[M-H]^-，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₇H₄₈O₄，分子量436；通过¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT，及全套二维核磁共振确定化合物结构；¹H和¹³C核磁共振数据见表14。

Anthsteroid B为白色粉末状固体，系统命名为22(23)-烯-胆甾-3β，5α，6β，11α-四醇。由高分辨质谱(HR-ESI-MS)中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 457.3295[M+Na]⁺，及氢谱碳谱解析，给出该化合物的分子式为C₂₇H₄₆O₄，分子量434；通过¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT，及全套二维核磁共振确定化合物结构；¹H和¹³C核磁共振数据见表15。

表1.Muristeroid A的¹H和¹³C核磁共振数据(CDCl₃，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表2.Muristeroid B的¹H和¹³C核磁共振数据(CDCl₃，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表3.Muristeroid C的¹H和¹³C核磁共振数据(CDCl₃，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表4.Muristeroid D的¹H和¹³C核磁共振数据(CD₃0D，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表5.Muristeroid E的¹H和¹³C核磁共振数据(CDCl₃，500MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表6.Muristeroid F的¹H和¹³C核磁共振数据(CD₃OD，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表7.Muristeroid G的¹H和¹³C核磁共振数据(CD₃OD，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表8.Sarcsteroid A的¹H和¹³C核磁共振数据(CDCl₃，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表9.Sarcsteroid B的¹H和¹³C核磁共振数据(CDCl₃，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表10.Sarcsteroid C的¹H和¹³C核磁共振数据(CDCl₃，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表11.Sarcsteroid D的¹H和¹³C核磁共振数据(CDCl₃，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表12.Sarcsteroid E的¹H和¹³C核磁共振数据(CDCl₃，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表13.Sarcsteroid F的¹H和¹³C核磁共振数据(CDCl₃，500MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表14.Anthsteroid A的¹H和¹³C核磁共振数据(CD₃OD，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

表15.Anthsteroid B的¹H和¹³C核磁共振数据(CD₃OD，400MHz/100MHz)

J值：偶合常数

本发明Muristeroids A～G，胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯，胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇，(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇，24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇，Sarcsteroids A～F，AnthsteroidsA～B的制备方法如下：

1.Muristeroids A～G及6个已知化合物的制备

取新鲜紫柳珊瑚洗净剪碎，用重量比为5～10倍的丙酮(丙酮中加入少量水)超声提取至提取液无色，减压回收丙酮至无丙酮味，用等体积水分散，乙醚萃取数次，合并萃取液，减压回收乙醚至干，得总浸膏。将总浸膏用正相硅胶色谱(200～300目)分离，用石油醚/丙酮系统梯度洗脱，通过薄层板监测，根据馏分极性大小收集，将总浸膏合并成16个部分。

Fr.6部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动相：石油醚∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.6-1～Fr.6-6。Fr.6-5部分再经过正相硅胶色谱(400-600目)分离，石油醚∶丙酮4∶1洗脱，薄层板监测，将组分分成4个部分(Fr.6-5-1～Fr.6-5-4)。Fr.6-5-2通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇∶水的体积比为90∶10的混合溶剂进行洗脱，示差检测器监测，收集含Muristeroid C和胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇的流份，减压回收至干，得化合物Muristeroid C和胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇。Fr.6-5-3通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇∶水的体积比为95∶5的混合溶剂进行洗脱，示差检测器监测，收集含Muristeroid A、B和胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯的流份，减压回收至干，得化合物MuristeroidA、Muristeroid B和胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯。

Fr.12部分中加入适量CHCl₃，过滤，得滤渣，将滤渣用CH₃OH∶CHCl₃1∶1的混合溶剂溶解，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离(流动相CH₃OH∶CHCl₃＝1∶1)，薄层板检测，收集合并得Fr.12-1～Fr.12-4，Fr.12-3用半制备型RP-HPLC纯化(流动相，85％的甲醇-水)，视差检测器检测，收集含MuristeroidsD、Muristeroids E、(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇、24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇、胆甾-3β，5α，6β-三醇的流份，减压回收至干，得化合物Muristeroids D、Muristeroids E、(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇、24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇、胆甾-3β，5αt，6β-三醇。

Fr.13部分经正相硅胶柱色谱分离，由氯仿/甲醇梯度洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.13-1～Fr.13-4。Fr.13-3中加入适量氯仿，过滤，得滤渣。将滤渣用1∶1的氯仿/甲醇溶解，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离(流动相，CH₃OH∶CHCl₃＝1∶1)。薄层板检测，收集合并得Fr.13-3-1～Fr.13-3-3。Fr.13-3-2用半制备型RP-HPLC纯化(流动相，85％的甲醇-水)，视差检测器检测，收集含Muristeroids F～G、胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇的流份，减压回收至干，得化合物Muristeroid F、Muristeroid G和胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇。

2.Sarcsteroids A～F的制备

取新鲜肉芝软珊瑚洗净剪碎，用重量比为5～10倍的丙酮(丙酮中加入少量水)超声提取至提取液无色，减压回收丙酮至无丙酮味，用等体积水分散，乙醚萃取数次，合并萃取液，减压回收乙醚至干，得总浸膏。将总浸膏用正相硅胶色谱(200～300目)分离，用正己烷/丙酮系统梯度洗脱，通过薄层板监测，根据馏分极性大小收集，将总浸膏合并成23个部分。

Fr.20部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动相：正己烷∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.20-1～Fr.20-7。Fr.20-3部分再经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动相：正己烷∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.20-3-1～Fr.20-3-4。Fr.20-3-3通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇∶水的体积比为96∶4的混合溶剂进行洗脱，示差检测器监测，收集含Sarcsteroid A、Sarcsteroid B、Sarcsteroid D的流份，减压回收至干，得化合物Sacrsteroid A、Sacrsteroid B、Sacrsteroid D。

Fr.21部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动相：正己烷∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.21-1～Fr.21-7。Fr.21-5部分再经过正相硅胶柱色谱(流动相：甲醇∶氯仿＝1∶50)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.21-5-1～Fr.21-5-5。Fr.21-5-5通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇∶水的体积比为95∶5的混合溶剂进行洗脱，示差检测器监测，收集含Sarcsteroid E、Sarcsteroid F的流份，减压回收至干，得化合物SarcsteroidE、Sarcsteroid F。

Fr.22部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动相：正己烷∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.22-1～Fr.22-6。Fr.22-3部分再经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动相：正己烷∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.22-3-1～Fr.22-3-6。Fr.22-3-5通过正相硅胶柱色谱(流动相：氯仿/甲醇＝40∶1)洗脱，再经过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇∶水的体积比为94∶6的混合溶剂进行洗脱，示差检测器监测，收集含Sarcsteroid C的流份，减压回收至干，得化合物Sarcsteroid C。

3.Anthsteroids A～B的制备

取新鲜块花柳珊瑚洗净剪碎，用重量比为5～10倍的丙酮(丙酮中加入少量水)超声提取至提取液无色，减压回收丙酮至无丙酮味，用等体积水分散，乙醚萃取数次，合并萃取液，减压回收乙醚至干，得总浸膏。将总浸膏用正相硅胶色谱(200～300目)分离，用石油醚/丙酮系统梯度洗脱，通过薄层板监测，根据馏分极性大小收集，将总浸膏合并成32个部分。

Fr.21部分经过反相硅胶柱色谱(流动相：甲醇∶水＝50％，70％，80％，90％)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.21-1～Fr.21-6。Fr.21-5通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇∶水的体积比为75∶25的混合溶剂进行洗脱，示差检测器监测，收集含Anthsteroid A和Anthsteroid B的流份，减压回收至干，得化合物Anthsteroid A和Anthsteroid B。

文献检索表明，化合物Muristeroids A～G，胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯，胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇，(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇，24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇，Sarcsteroids A～F，Anthsteroids A～B均没有抗菌及微藻活性的研究报道。

本发明对上述21个化合物进行的体外抗菌及抗微藻试验表明，它们对于试验用真菌、细菌和藻类具有明显的抑制效果，因此，本发明提供了上述多羟基甾体类化合物在制备抗菌、抗微藻药物中的应用。

具体实施方式

现结合实施例对本发明作详细描述。

实施例1.制备Muristeroids A～G及6个已知化合物。

取中国海南三亚附近海域的紫柳珊瑚(Muriceopsis flavida)1500g，洗净，剪碎，用5倍重量的丙酮超声提取，减压回收丙酮至无丙酮味，用等体积水分散，乙醚萃取6次，每次1000ml，合并萃取液，回收乙醚并浓缩至干，得总浸膏12.5g。将总浸膏经正相硅胶色谱(200～300目)分离，以体积比为80∶1、40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶5、1∶15的石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，根据薄层板监测，各流分按极性大小收集，共收集得16个部分Fr.1～Fr.16。

Fr.6部分用Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动性石油醚∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)分离，根据薄层板监测，收集合并流份，得六个部分Fr.6-1～Fr.6-6。Fr.6-5部分再经过正相硅胶色谱(400-600目)分离纯化(石油醚/丙酮4∶1洗脱)，薄层板监测，将组分分成4个部分(Fr.6-5-1～Fr.6-5-4)。Fr.6-5-2通过半制备RP-HPLC纯化，以甲醇∶水的体积比为90∶10的混合溶剂为流动相，示差检测器监测，控制流速1.5ml/min，恒定柱温温度30℃，收集保留时间为30min时的流份，减压回收至干，得化合物Muristeroid C(1.3mg)，收集保留时间为45min时的流份，减压回收至干，得化合物胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇(1.6mg)。Fr.6-5-3通过半制备型RP-HPLC纯化，以甲醇∶水的体积比为95∶5的混合溶剂为流动相，示差检测器监测，控制流速1.5ml/min，恒定柱温温度30℃，收集保留时间为30min时的流份，减压回收至干，得化合物MuristeroidA(8mg)，收集保留时间为42min时的流份，减压回收至干，得化合物Muristeroid B(5mg)，收集保留时间为55min时的流份，减压回收至干，得化合物胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯(3mg)。

Fr.12部分中加入适量氯仿，过滤，取滤渣，用氯仿∶甲醇1∶1的混合溶剂溶解，用Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动性甲醇∶氯仿＝1∶1)分离，根据薄层板监测，收集合并流份，得四个部分Fr.12-1～Fr.12-4。Fr.12-3部分再经过半制备RP-HPLC纯化(流动相85％的甲醇-水；流速：1.5ml/min；柱温：30℃)，示差检测器监测，收集保留时间为52min时的流份，减压回收至干，得化合物Muristeroid D(2mg)，收集保留时间为68min时的流份，减压回收至干，得化合物Muristeroid E(2mg)；收集保留时间为75min时的流份，减压回收至干，得化合物(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇(5.5mg)；收集保留时间为90min时的流份，减压回收至干，得化合物24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇(3.5mg)；收集保留时间为119min时的流份，减压回收至干，得化合物胆甾-3β，5α，6β-三醇(11.0mg)。

Fr.13部分经正相硅胶柱色谱分离，由氯仿∶甲醇40∶1，30∶1，20∶1，15∶1，10∶1为洗脱剂做梯度洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并流份，得四个部分Fr.13-1～Fr.13-4。Fr.13-3中加入适量氯仿，过滤，取滤渣，将滤渣用1∶1的氯仿∶甲醇溶解，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离(流动相CH₃OH∶CHCl₃＝1∶1)。薄层板检测监测，收集合并流份，得三个部分Fr.13-3-1～Fr.13-3-3。Fr.13-3-2用半制备型RP-HPLC纯化(流动相85％的甲醇-水；流速：1.5ml/min；柱温：30℃)，视差检测器监测，收集含保留时间66min时的流份，减压回收至干，得化合物Muristeroid F(2.5mg)；收集保留时间78min时的流份，减压回收至干，得化合物Muristeroid G(5.0mg)；收集保留时间85min时的流份，减压回收至干，得化合物胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇(8.0mg)。

实施例2.制备Sarcsteroids A～F

取中国广西北海附近海域的肉芝软珊瑚(Sarcophytum sp)1642g，洗净，剪碎，用5倍重量的丙酮超声提取，减压回收丙酮至无丙酮味，用等体积水分散，乙醚萃取6次，每次1000ml，合并萃取液，回收乙醚并浓缩至干，得总浸膏21.6g。将总浸膏经正相硅胶色谱(200～300目)分离，以体积比为99∶1、79∶1、69∶1、59∶1、49∶1、39∶1、29∶1、25∶1、22∶1、17∶1、15∶1、12∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、100％乙酸乙酯的石油醚/乙酸乙酯做梯度洗脱，根据薄层板监测，各流分按极性大小从小到大共收集合并为23个部分Fr.1～Fr.23。

Fr.20(210mg)部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动相：正己烷∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.20-1～Fr.20-7。Fr.20-3(72mg)部分再经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动相正己烷∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.20-3-1～Fr.20-3-4。Fr.20-3-3通过半制备型RP-HPLC纯化(流动相96％的甲醇-水；流速1.5ml/min；柱温30℃)，示差检测器监测，收集含保留时间为19min时的流份，减压回收至干，得Sarcsteroid A(2.3mg)、收集保留时间为26min时的流份，减压回收至干，得Sarcsteroid B(3.3mg)、收集保留时间为54min时的流份，减压回收至干，得Sarcsteroid D(5.4mg)。

Fr.21部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动相正己烷∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.21-1～Fr.21-7。Fr.21-5部分再经过正相硅胶柱色谱(流动相 甲醇∶氯仿＝1∶50)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.21～5-1～Fr.21-5-5。Fr.21-5-5通过半制备型RP-HPLC纯化(流动相95％甲醇-水；流速1.5ml/min；柱温30℃)，示差检测器监测，收集含保留时间为30min时的流份，减压回收至干，得Sarcsteroid E(3.4mg)、收集保留时间为38min时的流份，减压回收至干，得Sarcsteroid F(3.4mg)。

Fr.22部分经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动相正己烷∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.22-1～Fr.22-6。Fr.22-3部分再经过Sephandex LH-20凝胶柱色谱(流动相正己烷∶甲醇∶氯仿＝2∶1∶1)洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.22-3-1～Fr.22-3-6。Fr.22-3-5通过正相硅胶柱色谱(流动相 氯仿∶甲醇＝40∶1)洗脱，再经过半制备型RP-HPLC纯化(流动相94％甲醇-水；流速1.5ml/min；柱温30℃)，示差检测器监测，收集含保留时间为23min时的流份，减压回收至干，得SarcsteroidC(1.4mg)。

实施例3.制备Anthsteroids A～B

取中国广西北海附近海域的块花柳珊瑚(Anthogorgia sp)2167g，洗净，剪碎，用5倍重量的丙酮超声提取，减压回收丙酮至无丙酮味，用等体积水分散，乙醚萃取6次，每次2000ml，合并萃取液，回收乙醚并浓缩至干。将总浸膏用2000ml的水混悬，依次用乙醚和正丁醇分别萃取6次，合并并减压回收乙醚，得乙醚层浸膏28g，合并正丁醇并减压回收正丁醇得正丁醇层浸膏5g。乙醚层浸膏(28g)经正相硅胶柱色谱(200～300目)分离，以体积比为99∶1、49∶1、34∶1、29∶1、24∶1、19∶1、14∶1、11∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、100％丙酮的石油醚/丙酮梯度洗脱，根据薄层板监测，各流分按极性大小从小到大共收集为32个部分Fr.1～Fr.32。

Fr.21部分经过反相硅胶柱色谱(流动相 甲醇∶水＝50％，70％，80％，90％)做梯度洗脱，根据薄层板检测监测，收集合并得Fr.21-1～Fr.21-6。Fr.21-5通过半制备型RP-HPLC纯化(流动相75％甲醇-水；柱温30℃；流速1.5ml/min)，示差检测器监测，收集保留时间为165min时的流份，减压回收至干，得Anthsteroid A(1.2mg)、收集保留时间为86min时的流份，减压回收至干，得Anthsteroid B(2.1mg)。

实施例4：体外抗菌试验

一、试验用真菌、细菌和藻类

1.试验用真菌：花药黑粉菌(Microbotryum violaceum)、和壳针孢叶枯病菌(Septoria tritici)。

2.试验用细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

3.试验用藻类：小球藻(Chlorella fusca)。

二、实验用药

1.阳性对照药：青霉素(Penicillin)、链霉素(Streptomycin)、酮康唑。

2.阴性对照品：丙酮(Acetone)。

3.Muristeroids A～G，胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯，胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇，(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇，24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇，Sarcsteroids A～F，Anthsteroids A～B，由实施例1制备

三、实验方法

1.配制药物溶液：将青霉素、链霉素、酮康唑、Muristeroids A～G，胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯，胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇，(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇，24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇，Sarcsteroids A～F，Anthsteroids A～B分别用丙酮配制成浓度为2mg/ml的溶液，单次测试用量25μl。

2.将上述2种真菌、2种细菌和1种藻类按无菌操作的要求分别用7ml灭菌水配制成菌液，各用喷雾器取4ml菌液，分别均匀喷洒于各自培养皿的培养基表面，再在每个培养皿内分别放置直径约1cm灭菌滤纸两块，覆盖于培养基表面，然后分别取上述配制的药液50μl滴于滤纸上，盖上培养基盖子进行培养。各培养皿盖子上均注明相应培养基种类、菌种、化合物名称、接种时间。花药黑粉菌20℃培养4天，壳针孢叶枯病菌20℃培养4天，大肠杆菌37℃培养24小时，巨大芽孢杆菌37℃培养24小时，小球藻20℃培养5天。按时观察结果，测量抑菌圈的大小(半径)，平行试验3次，取平均值，结果见表16。

表16.琼脂扩散实验活性筛选(mm)

由表16可见，本发明的Muristeroids A～G，Sarcsteroids A～F，AnthsteroidsA～B，胆甾-5α，6β-二醇-3β-乙酸酯，胆甾-5α-甲氧基-3β，6β-二醇，(22E)-22-烯-胆甾-3β，5α，6β-三醇，24(28)-烯-麦角甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-3β，5α，6β-三醇，胆甾-1β，3β，5α，6β-四醇对花药黑粉菌、壳针孢叶枯病菌、革兰氏阴性菌-大肠杆菌、革兰氏阳性菌-巨大芽孢杆菌和小球藻均具有显著的抑制作用，因此可用于制备抗菌药物。

本发明为研制新的抗菌药物提供了新的先导化合物，对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。

一类多羟基甾体化合物及其用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。