专利摘要
本发明公开了一种离子液体调控含硫杂环化合物生物脱硫的方法，包括：(1)将脱硫菌经过活化和种子培养后得到种子培养液，经后处理得到脱硫菌细胞或脱硫菌休止细胞；(2)将脱硫菌细胞或脱硫菌休止细胞悬浮于磷酸缓冲液中，制成水相；(3)将上述水相与正十六烷混合构成反应体系，加入含硫杂环化合物和离子液体，在28℃～33℃反应1h～3h，即可；其中，离子液体与正十六烷的体积比为0.01～0.1∶1。该方法以脱硫菌为催化剂，采用生物脱硫技术，在离子液体的调控下降解燃料油中的含硫杂环化合物，生物脱硫量明显增加，具有工业应用前景。
说明书
技术领域技术领域
本发明涉及生物脱硫领域，具体涉及一种离子液体调控含硫杂环化合物生物脱硫的方法。
技术背景背景技术
化石燃料是当今世界最主要的能源物质，硫几乎是普遍存在于其中的有害物质，这些存在的含硫化合物在燃烧过程中会生成大量的二氧化硫，而二氧化硫又是形成酸雨的最主要因素，因此，化石燃料中含硫化合物越多对环境的危害越大。为减少对环境的危害，世界各国都对燃料油的含硫量作出了严格的规定。
当前石油及其产品中的脱硫普遍采用的方法为加氢脱硫(HDS)。HDS是在高温(＞300℃)、高压(＞10MPa)、加氢和金属催化剂的条件下进行的脱硫反应。该法可有效地脱除无机硫和简单的有机硫化合物，而对于杂环类含硫化合物，如二苯并噻吩(DBT)，特别是烷基取代的DBT衍生物，很难通过HDS脱除。近年来，生物脱硫技术(BDS)得到了极大地发展。生物脱硫技术是一种在常温常压下利用需氧、厌氧菌去除杂环化合物中结合的有机硫的一种新技术，该方法能有效脱除DBT等含硫杂环化合物，而且反应条件温和，投资和操作费用低，但普遍存在着脱硫效率低等问题。
申请号为200710068080.4的中国专利申请中公开了一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的细菌菌株，该菌株经鉴定命名为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19，保藏号为：CGMCC NO.1817；其还公开了该菌株在对含硫杂环化合物的燃料油中进行专一性脱硫的用途，以此菌株为催化剂，采用生物脱硫技术降解燃料油中的含硫杂环化合物，对二苯并噻吩及其衍生物4，6-二甲基二苯并噻吩的降解过程遵循独特的“扩展4S途径”，能将传统“4S途径”的产物2-羟基联苯及3，3’-二甲基-2-羟基联苯进一步甲氧基化，生成最终产物2-甲氧基联苯及3，3’-二甲基-2-甲氧基联苯，有效地减弱了产物抑制。在此专利中，脱硫反应体系为单一的水溶液反应体系，这点不太适用真实油品脱硫中油水混合的反应体系。本专利模拟燃料油油水混合的脱硫反应体系，更贴近真实油品脱硫。
离子液体(IL)是21世纪新兴的绿色溶剂，具有极性强、溶解性好、低蒸汽压、结构可设计等独特的性质。据报道，离子液体能很好地溶解含硫化合物，尤其是结构复杂的噻吩类硫化物，且不溶于燃料油，不存在油品的交叉污染问题。例如：申请号为200610066595.6的中国专利申请中公开了一种柴油耦合脱硫的方法，采用离子液体萃取柴油中的噻吩类硫化物，在所述离子液体相中进行噻吩聚合反应，并分离出生成的聚噻吩。该发明方法解决了现有技术不能有效脱除柴油中噻吩类硫化物以及脱除的噻吩类硫化物不能再利用的问题。该专利只涉及了噻吩类硫化物的脱除，而没有涉及在燃料油中含量较高且较难被现行脱硫方法脱除的二苯并噻吩类硫化物。而且在该专利中，萃取相中噻吩的萃取回收率为75％左右，有一定比例的噻吩损失，会造成燃料油燃烧热值的损失。
发明内容发明内容
本发明提供了一种离子液体调控含硫杂环化合物生物脱硫的方法，利用离子液体增加杂环含硫化合物在水中的溶解度，提高杂环含硫化合物的生物可利用率，进而促进微生物对杂环含硫化合物的生物脱硫。
一种离子液体调控含硫杂环化合物生物脱硫的方法，包括步骤：
(1)将脱硫菌经过活化和种子培养后得到种子培养液，经后处理得到脱硫菌细胞或脱硫菌休止细胞；
(2)将脱硫菌细胞或脱硫菌休止细胞悬浮于磷酸缓冲液中，制成水相；
(3)将上述水相与正十六烷混合构成反应体系，加入含硫杂环化合物和离子液体，在28℃～33℃(优选30℃)反应1h～3h(优选2h)，即可；
其中，离子液体与正十六烷的体积比为0.01～0.1∶1，优选为0.01～0.048∶1。
所述的脱硫菌可选用现有的所有用于生物脱硫的菌株，例如分枝杆菌ZD-19等。本发明所使用的分枝杆菌ZD-19属于分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)，其保藏编号为：CGMCC NO.1817，其获取、培养方法和形态在申请号为200710068080.4的中国发明专利申请中有详细描述。
作为优选：
所述的离子液体选用阳离子为咪唑类，阴离子为氟硼酸类、氟磷酸类、酸酯类和Lewis酸类的离子液体，可选用1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM][BF4])、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM][BF4])、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM][PF6])、1-丁基-3-甲基咪唑磷酸二丁酯([BMIM][DBP])、1-丁基-3-甲基咪唑氯化物-三氯化铝([BMIM]Cl-2AlCl3)中的一种。
为了进一步提高微生物的脱硫活性，所述的水相与正十六烷的体积比为0.25～2∶1，进一步优选为1∶1。
所述的含硫杂环化合物选自二苯并噻吩(DBT)、二苯并噻吩衍生物(如二苯并噻吩的烷基取代衍生物)、4-甲基-二苯并噻吩(4-MDBT)中的一种或多种。
菌液浓度过低或过高都对生物脱硫的效果有影响，前期实验结果表明当菌液浓度为10g/L～20g/L时，最有利于生物脱硫。因此，步骤(2)中，所述的水相中脱硫菌细胞或脱硫菌休止细胞的浓度为10g/L～20g/L。
研究表明，反应体系中含硫杂环化合物的初始加入浓度小于2mmol/L时，浓度越高，生物脱硫的效率也越高。但当初始浓度大于2mmol/L时，该含硫杂环化合物底物会对生物脱硫产生一定的抑制作用，浓度越高，抑制作用越大。为了保持较好的生物脱硫效率，反应体系中含硫杂环化合物较适宜的浓度为0.8mmol/L～2mmol/L。
步骤(1)中，所述的后处理采用本领域常规的处理方法即可，包括：将种子培养液离心分离制得分枝杆菌ZD-19细胞或者将种子培养液离心分离后用质量百分浓度为0.85％的生理盐水洗涤两次，悬浮于磷酸缓冲液中，制得休止细胞。
对本发明离子液体的特性、离子液体对脱硫菌(以分枝杆菌ZD-19为例)生长的影响进行实验分析：
一、菌种的类型及培养：
脱硫微生物为分枝杆菌ZD-19(Mycobacterium sp.ZD-19)，保藏编号CGMCC NO.1817。
该菌株的液体培养基组成为：以1000mL液体培养基计，K2HPO4·3H2O5.0g，NaH2PO4·2H2O 2.0g，MgCl2·6H2O 0.2g，NH4Cl 2.0g，甘油2g，微量元素1mL，硫源为0.2～0.5mmol/L DBT。其中微量元素组成为(每100mL蒸馏水中)：CuCl2·2H2O 0.011mg，CoCl2·6H2O 0.04mg，ZnCl2 0.02mg，CaCl2 0.4mg，H3BO3 0.005mg，NaMoO4·2H2O 0.02mg，FeCl3·7H2O 0.4mg，AlCl3·6H2O 0.01mg，MnCl2·4H2O 0.08mg。
培养条件：适宜生长pH范围为6.5～9.5，适宜生长温度为20℃～40℃；以氯化铵为氮源，适宜浓度为0.5g/L～2.0g/L；以甘油为碳源，适宜浓度为1.0g/L～4.0g/L；以DBT为硫源，浓度为0.1mmol/L～0.5mmol/L。
二、离子液体的特性
1、离子液体为[EMIM][BF4]。
2、离子液体对DBT在水中的增溶作用：取若干个25ml的锥形瓶，分别加入5ml去离子水，过量DBT粉末以及离子液体，离子液体与去离子水的体积比为0.01～0.2，置于转速180r/min，温度30℃的摇床中，溶解72小时后取出，过滤去除未溶解的DBT粉末，将DBT水溶液用等量乙酸乙酯萃取，4800×g离心分离10分钟，萃取相用GC分析。
3、离子液体对DBT在水中的增溶作用分析和比较：如图1所示，离子液体对DBT在水中有明显的增溶效应。而且，随着离子液体加入量的增加，DBT的溶解度也相应增加。假设Sw*为DBT在相应离子液体加入量下的溶解度，Sw为DBT在纯水中的固有溶解度，则Sw*/Sw为增溶比。由于DBT在纯水中的Sw为0.0057mmol/L(mM)，当离子液体与水的体积比为0.2时，其相应的溶解度为0.427mmol/L，增溶比为75，可见，离子液体对DBT在水中的增溶效应明显。
三、离子液体对脱硫菌生长的影响
1、离子液体不同添加量对脱硫菌的生长情况：在液体培养基中加入0.2mmol/L DBT作为唯一硫源，接入1g/L分枝杆菌ZD-19细胞菌液，再分别加入不同量的离子液体[EMIM][BF4]，[EMIM][BF4]与培养基的体积比为0～0.048∶1，置于转速180r/min、温度30℃的摇床中培养，间隔时间取样。
2、离子液体不同添加量对脱硫菌的生长情况结果分析：如图2所示，低浓度的离子液体对脱硫菌的生长没有太大的影响，而当离子液体加入量逐步增加时，离子液体表现出对菌体生长的抑制作用，当离子液体加入量增加到与培养基的体积比为0.032和0.048时，菌体生长几乎被完全抑制。
本发明具有如下优点：
本发明采用生物脱硫技术，以脱硫菌如分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)ZD-19菌株为生物催化剂，在常温常压条件下，利用适量的离子液体来调控降解燃料中的含硫化合物如二苯并噻吩及其衍生物、4-甲基二苯并噻吩等，离子液体能促进DBT在水中的溶解度，并极大的提高含硫化合物的生物脱硫率，有利于超低硫油品的生产，具有较好的燃料油生物脱硫工业应用前景。
本发明的生物脱硫方法不仅可以有效的脱除噻吩及其二苯并噻吩类硫化物，还可以很好的保持燃料油的热值。利用离子液体调控生物脱硫可以极大的提高生物脱硫的效率，有助于真实油品的深度脱硫。
附图说明附图说明
图1为本发明离子液体对DBT在水中的增溶作用；
图2为本发明离子液体不同添加量对脱硫菌生长的影响；
图3为本发明实施例1中离子液体不同添加量对DBT生物脱硫的影响；
图4为本发明实施例2中离子液体不同添加量对4-MDBT生物脱硫的影响。
具体实施方式具体实施方式
实施例1
离子液体对燃料油中的多种含硫杂环化合物的降解
DBT是燃料油生物脱硫公认的模型化合物，但是除DBT外，油中的含硫杂环化合物还有很多，如4-MDBT等。
1、休止细胞的制备：将4℃冰箱保存的分枝杆菌ZD-19菌种接种于斜面培养基，30℃下培养96小时进行活化。再将经活化的菌种接入灭菌后的以DBT为唯一硫源的液体培养基，置于30℃摇床，180r/min培养至对数期后期停止培养，将菌悬液离心分离，用0.85％的生理盐水洗涤两次，下层菌相浓缩悬浮于pH 7.0的0.1mol/L的磷酸缓冲液中，制备得到休止细胞，用于含硫杂环化合物的脱硫。
2、离子液体存在时休止细胞降解DBT的反应：在多个25ml锥形瓶中分别加入3ml正十六烷，0.8mmol/LDBT，以及3ml含分枝杆菌ZD-19休止细胞的磷酸缓冲液(其中，休止细胞的浓度为11g/L)，再加入不同浓度的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，使1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐与正十六烷的体积比为0.01～0.091，然后置于转速180r/min、温度30℃的摇床中反应2小时后取样，4800×g离心分离10分钟，油相用GC分析。
3、对照组：除了不添加离子液体，其它操作与离子液体存在时休止细胞降解DBT的反应相同，油相用GC分析。
4、离子液体存在时休止细胞降解DBT结果比较和分析：如图3所示，适量低浓度离子液体的加入可以大大促进DBT的生物脱硫，而相对高浓度的离子液体会抑制DBT的生物脱硫。经过2小时反应后，没有添加离子液体的对照组的脱硫量(即油相中DBT减少的浓度)为0.39mM，随着离子液体加入量的增加，生物的脱硫量也随之增加，当离子液体与正十六烷的体积比为0.02时，脱硫量达到0.64mM，与对照组相比，促进率为64％。而当离子液体的加入量再次增加时，生物脱硫量反而下降，当离子液体与正十六烷的体积比为0.091时，生物脱硫几乎被完全抑制，这可能是由于高浓度的离子液体会对生物(即分枝杆菌ZD-19)产生抑制作用。
实施例2
1、休止细胞的制备同实施例1。
2、离子液体存在时休止细胞降解4-MDBT的反应：在多个25ml锥形瓶中分别加入3ml正十六烷，0.8mmol/L 4-MDBT，以及3ml含分枝杆菌ZD-19休止细胞的磷酸缓冲液(其中，休止细胞的浓度为11g/L)，再加入不同浓度的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，使1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐与正十六烷的体积比为0.01～0.091，然后置于转速180r/min、温度30℃的摇床中反应2小时后取样，4800×g离心分离10分钟，油相用GC分析。
3、对照组：除了不添加离子液体，其它操作与离子液体存在时休止细胞降解4-MDBT的反应相同，油相用GC分析。
4、离子液体存在时休止细胞降解4-MDBT结果比较和分析：如图4所示，相对低浓度的离子液体对休止细胞降解4-MDBT有比较好的促进作用，而高浓度的离子液体则有抑制作用。经过2小时反应后，没有离子液体加入的对照组的脱硫量(即油相中4-MDBT减少的浓度)为0.26mM，而当离子加入量逐渐增加时，生物脱硫量也相应增加，当离子液体与正十六烷的体积比为0.033时，生物脱硫量达到最大为0.42mM，与对照组相比促进率为62％。而当离子液体加入量与正十六烷的体积比为0.1时，生物脱硫受到抑制，脱硫量仅为0.11mM。
一种离子液体调控含硫杂环化合物生物脱硫的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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