专利摘要

本公开属于微生物促生技术领域，具体涉及一种绿色木霉菌、菌剂、生物肥及应用。生物有机肥以工业废弃物为原料，通过功能微生物，有效解决环境污染问题的同时，具有减轻农作物病害、提高产量等效果。木霉菌生物有机肥具有促生、增产、防病等多重作用，有良好的开发意义。本公开提供了一株绿色木霉菌(Trichodermaviride)Tv‑1511，该菌株具有良好的促进种子萌发及幼苗生长的作用，其接种于蘑菇渣中获得的固体发酵物可以作为良好的生物有机肥，使用方便，促生增产效果显著，具有良好的开发前景。

权利要求

1.一株绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511,该菌株已于2018年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其生物保藏号为：CGMCC NO.16800。

2.如权利要求1所述的绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511，其特征在于，所述菌株的rDNA-ITS序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511，其特征在于，所述培养基的配方为：马铃薯浸粉6g/L，葡萄糖20g/L，pH值5.6±0.2。

4.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂为权利要求1-3所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)Tv-1511和/或所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511的培养物。

5.权利要求1-3所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511或权利要求4所述菌剂作为农作物促生制剂的应用；优选的，所述农作物促生剂用于提高种子萌发率或促进种胚生长；或所述农作物促生剂用于促进幼苗生长。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述农作物包括但不限于小麦和黄瓜；进一步的，所述小麦为济麦22，所述黄瓜为津研四号。

7.一种生物有机肥，其特征在于，所述生物有机肥为权利要求1-3所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511的固体发酵物。

8.如权利要求7所述的生物有机肥，其特征在于，所述生物有机肥的制备方法如下:将绿色木霉菌Tv-1511接种于装有蘑菇渣的培养基中，置于20～30℃培养15～25天，制成木霉固体发酵物；优选的，所述固体发酵物的添加量为生物有机肥干重的5％。

9.权利要求7或8所述生物有机肥在促进农作物增产方面的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生物有机肥的使用方法如下：将生物有机肥代替30％的化肥进行施用。

说明书

技术领域

本公开属于微生物促生技术领域，具体涉及一种具有促生效果的绿色木霉(Trichoderma viride)Tv-1511菌株，相应的菌剂及其制备的多功能生物有机肥和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

肥料作为一种重要的农业生产资料，在粮食生产中发挥着至关重要的作用。我国是一个农业大国，也是化肥生产和消费大国。目前，我国化肥单季化肥利用率仅为30％-35％，化肥利用率低，还会对环境造成严重的污染。生物有机肥在这种情况下应运而生，这种肥料将有机肥和微生物肥料有机结合于一体，是一种含有确定功能微生物菌种的特殊肥料。施用生物有机肥不仅可以提高土壤中植物营养元素的供应水平，还可以通过其所含特定功能微生物的生命活动来促进植物对营养元素的吸收利用，减轻病虫害，从而提高农作物产量和品质。此外，生物有机肥是以工农业废弃物为原料，不仅实现了工农业废弃物的资源化利用，还可以有效解决环境污染问题，是对人、畜、环境安全无毒的环保型肥料。生物有机肥发挥作用的核心是具有特定功能的微生物，因此微生物菌种的筛选和使用是生物有机肥料生产中的关键。

木霉(Trichoderma spp.)在分类地位上为半知菌类丛梗孢目真菌，广泛分布于自然界中，是组成土壤微生物群落的重要部分。常见木霉有绿色木霉(T.viride)、李氏木霉(T.reesei)、哈茨木霉(T.harzianum)、长枝木霉(T.longibrachiatum)等。木霉产生的次级代谢产物种类丰富，生物活性多样，功能各异，在农业生产领域具有广泛的应用。其中，木霉菌生物有机肥是一种在合理配比的有机肥中加入优良木霉菌株分生孢子制备而成的新型肥料。该肥料中的有机物既是肥力的基础，又是木霉的培养基质，木霉能够以有机肥为载体，快速生长繁殖，占据优势生态位，增加植物根际有益微生物的数量。因此，木霉菌生物有机肥具有促生、增产、防病等多重作用，具有良好的开发应用前景。

发明内容

针对上述研究背景，发明人认为目前公开应用于生物有机肥生产的木霉菌种类有限，进一步开发、挖掘具有促生作用的木霉菌对于生物肥产业的发展具有重要意义。

本公开从烟草根际分离到一株绿色木霉，该菌株具有生长速度快、产孢量大、适应性强以及快速大量定殖的特点，应用于农业生产，对于粮食产量具有提升作用，应用于生物肥生产可有效降低成本，提高经济效益。

为了实现上述技术目的，本公开提供以下技术方案：

本公开第一方面，提供一株绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511,该菌株已于2018年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其生物保藏号为：CGMCCNO.16800。

第一方面所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511的rDNA-ITS序列如SEQID NO:1所示。

该菌株从山东省潍坊市烟草田土中分离获得，其rDNA-ITS序列长度为576bp，通过在NCBI数据库中进行同源性比对，发现该菌株与登录号为JX993849.1的Trichodermavirens序列同源性最高，达到99％。运用Mega6.0软件以Neighbor Joining法建立系统发育树发现，Tv-1511与Trichoderma virens同属一个遗传分枝，亲缘关系最近。结合以上形态学分类和分子生物学鉴定结果，将本公开菌株鉴定为绿色木霉菌(Trichoderma viride)的一个新品种，命名为绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511。

所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511的形态学特征如下：

菌体特征：分生孢子梗由菌丝直立生出，对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，整体像树枝；分枝角度为锐角或近于直角，末端形成瓶型小梗，瓶梗基部缢缩，中部较宽，从中部以上变窄形成长颈；分生孢子无色，多为球形，表面有刺，簇生于小梗顶端。

菌落特征：Tv-1511在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长迅速，菌落初期呈白色绒状，后期出现同心轮纹状的产孢区，颜色为绿色至深绿色；菌落周围有菌丝生长带，菌丝透明，有隔分枝；分生孢子梗由菌丝直立生出，对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，整体像树枝；分枝角度为锐角或近于直角，末端形成瓶型小梗，瓶梗基部缢缩，中部较宽，从中部以上变窄形成长颈；分生孢子无色，多为球形，表面有刺，簇生于小梗顶端。

优选的，所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511采用马铃薯葡萄糖(PDA)培养基。

优选的，所述培养基的配方为：马铃薯浸粉6g/L，葡萄糖20g/L，pH值5.6±0.2。

本公开第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂为第一方面所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511和/或所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511的培养物。

本公开第三方面，提供第一方面所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511或第二方面所述菌剂作为农作物促生制剂的应用。

优选的，所述农作物促生剂用于提高种子萌发率或促进种胚生长。

优选的，所述农作物促生剂用于促进幼苗生长。

优选的，所述农作物包括但不限于小麦和黄瓜；进一步的，所述小麦为济麦22，所述黄瓜为津研四号。

本公开第四方面，提供一种生物有机肥，所述生物有机肥包括第一方面所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511的固体发酵物。

优选的，所述固体发酵物的制备方法如下:将绿色木霉菌Tv-1511接种于装有蘑菇渣的培养基中，置于20～30℃培养15～25天，制成木霉固体发酵物。

进一步优选的，所述固体发酵物的添加量为生物有机肥干重的5％。

在一些具体的实施例中，所述生物有机肥中还包括全元有机肥；更为具体的，所述全元有机肥由金星(日照)农业科技有限公司提供，含水量≤30％，有机质≥45％、全氮4％、全磷(P₂O₅)4％、全钾(K₂O)2％、硫酸锌(ZnSO₄)0.05％、游离氨基酸(Amino Acid)1％。

本公开第五方面，提供第四方面所述生物有机肥在促进农作物增产方面的应用。

优选的，所述农作物为玉米，进一步的，为华农138。

优选的，所述生物有机肥的使用方法如下：将生物有机肥代替30％的化肥进行施用。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

1.本公开提供了一株绿色木霉Tv-1511，该菌株具有良好的促生效果，可以显著提高种子萌发率，促进种子胚的生长；显著促进幼苗的生长，增加幼苗生物量。

2.该绿色木霉Tv-1511菌株分生孢子可以制成新型肥料—木霉型多功能生物有机肥。该肥料中的有机物既是肥力的基础，又是木霉的培养基质，因此木霉型多功能生物有机肥在为作物提供营养元素的同时，又能发挥其促生的功能，显著增加作物产量。木霉型多功能生物有机肥不仅可以提高肥料利用率，减少部分化肥的投入，还可以有效改良土壤微生态环境，具有良好的经济效益和生态效益。专利产品应用后，使用方便，促生增产效果好，适合种植区域大面积使用，具有良好的开发应用前景。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，生物有机肥以功能微生物为核心，通过特定功能微生物的生命活动改善植物生长状况，提高农作物品质，还能够实现对废弃物的回收利用，具有良好的经济效益。木霉的次级代谢物生物活性多样，在农业生产领域有广泛的应用。本公开提供了一种绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511，该菌株生长速度快，具有快速定殖的特点，其固体培养物制备的生物肥应用于粮食产量提升具有重要的意义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

1.1功能菌株的分离与纯化：

(1)样品的采集：采集样品为烟草田土，地点为山东省潍坊市。去掉表层浮土，直至露出有植物根系的土层，将土壤连同根系一起铲出，用塑料袋装好封口，带回实验室。

(2)菌株的分离：将土样碾碎呈细微粉末状，置于灭菌三角瓶中，加入灭菌水，振荡制成土壤悬浊液；用无菌生理盐水作梯度稀释，并分别取100μL滴入PDA平板上，采用平板稀释法均匀涂布，置于28℃培养箱中培养2-4天；挑选单菌落转接到PDA平板上培养长出菌落，采用单孢分离法进行分离纯化，保存备用。其中PDA培养基配方为：马铃薯浸粉6g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，PH值5.6±0.2。

1.2功能菌株的鉴定

(1)形态学鉴定：

该菌株在PDA培养基上生长迅速，菌落初期呈白色绒状，致密，圆形；后期菌落开始产分生孢子，出现同心轮纹状的产孢区，颜色为绿色至深绿色；菌落周围有菌丝生长带，菌丝透明，有隔分枝，细胞壁光滑；分生孢子梗是菌丝的短侧枝，由菌丝直立生出，对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，整体像树枝；分枝角度为锐角或近于直角，末端形成瓶型小梗，瓶梗基部缢缩，中部较宽，从中部以上变窄形成长颈；分生孢子无色，多为球形，表面有刺，簇生于小梗顶端。

(2)分子生物学特性：

用CATB法提取该菌株的DNA，然后通过采用通用引物ITS1/ITS2进行PCR扩增，将扩增片段进行测序。获得的测序序列在NCBI数据库中进行同源性比对，结果表明该菌株与登录号为JX993849.1的Trichoderma virens核糖体DNA ITS序列相似率达99.65％。根据Mega6.0软件中的Neighbor Joining法构建系统发育树发现，Tv-1511与绿木霉(Trichoderma virens)同属一个遗传分枝，亲缘关系十分最近。结合形态学分类和分子生物学鉴定结果，可以确定本发明菌株为绿色木霉菌(Trichoderma viride)的一个新品种，命名为绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv-1511，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16800。

实施例2：绿色木霉菌Tv-1511的纯培及无菌孢子的收集

(1)将绿色木霉菌Tv-1511接种到装有蘑菇渣的培养瓶中，置于培养箱26℃培养20天；

(2)加入无菌水悬浮孢子，倒入纱布封口的三角瓶中，除去杂质及菌丝，收集孢子液；

(3)将孢子液配平后进行离心，10000rpm，20℃离心5min，取上清，加入灭菌水重悬孢子，充分摇匀后再次离心；

(4)用30％的甘油悬浮，充分混匀，分装到1.5mL/2mL离心管中，标记好名称和时间；

(5)取一管孢子液进行活菌计数，孢子液浓度为10.8×10⁸cfu/mL。

实施例3：绿色木霉菌Tv-1511孢子液促进种子萌发效果试验

3.1.供试材料

供试微生物：绿色木霉Tv-1511孢子液(实施例2中制备)；

供试植物：小麦(济麦22)和黄瓜(津研四号)。

3.2.实验设计

发芽试验在山东省科学院生物所工业微生物实验室里进行。挑选健康饱满的种子先用75％酒精消毒30s，再用2％的NaClO表面消毒3min，无菌水冲洗4-5次，于超净工作台中风干至种子表面无水。选用直径为13cm的培养皿，3层灭菌滤纸，每皿20粒种子，10mL相应发芽溶液。以无菌水为发芽溶液的为对照组(CK)，以加入木霉孢子液(终浓度为10⁵cfu/mL)为处理组(T)，每个处理设置4个重复。统计种子的发芽率和侧根数，并对胚根长、胚芽长等指标进行测定。

3.3.实验结果

绿色木霉菌Tv-151对种子萌发的影响如表1(小麦)和表2(黄瓜)。绿色木霉菌Tv-151处理后，小麦和黄瓜种子的发芽率以及胚生长的相关指标均达到了显著差异水平(P＜0.05)。与对照组相比，处理组小麦的胚根长、胚芽长、侧根数目和发芽率分别增加了23.86％、22.29％、20.00％和16.67％；黄瓜分别增加了23.71％、21.90％、20.47％和11.83％。以上结果表明，绿色木霉菌Tv-151可以显著提高种子萌发率，促进种子胚的生长。

表1绿色木霉Tv-1511对小麦种子萌发的影响

表2绿色木霉Tv-1511对黄瓜种子萌发的影响

实施例4：绿色木霉菌Tv-1511孢子液促进幼苗生长效果试验

4.1.供试材料

供试微生物：绿色木霉Tv-1511孢子液(实施例2中制备)；

供试植物：小麦(济麦22)和黄瓜(津研四号)。

4.2.实验设计

本实施例在山东省科学院生物所工业微生物实验室里进行。挑选饱满一致的种子进行消毒处理，于25℃培养箱中遮光催芽至露白，然后进行16h光照/8h黑暗，培育一定时间后，挑选长势一致的幼苗移至水培装置，进行处理。以1/2 Hoagland营养液为水培溶液的为对照组(CK)，以加入木霉孢子液(终浓度为10⁵cfu/mL)为处理组(T)，每个处理设置4个重复，处理7d后进行主根长、株高、叶宽、叶长、鲜重、干重等指标的测定。

4.3.实验结果

绿色木霉菌Tv-151对幼苗生长的影响如表3(小麦)和表4(黄瓜)。绿色木霉菌Tv-151处理后，小麦和黄瓜的生长指标(主根长、株高、叶宽、叶长)和生物量(干重、鲜重)均达到了显著差异水平(P＜0.05)。与对照组相比，处理组小麦的主根长、株高、叶宽、叶长分别增加了26.92％、24.79％、26.42％、25.69％、46.15％和46.30％；黄瓜分别增加了26.32％、28.94％、16.41％、14.63％、44.44％和48.55％。以上结果表明，绿色木霉菌Tv-151可以显著促进幼苗的生长，增加幼苗生物量。

表3绿色木霉Tv-1511对小麦幼苗生长的影响

表4绿色木霉Tv-1511对黄瓜幼苗生长的影响

实施例5：绿色木霉菌Tv-1511制备的多功能生物有机肥田间示范

5.1.供试材料

供试微生物：绿色木霉菌Tv-1511。

供试作物：玉米(华农138)，购自北京华农伟业种子科技有限公司。

供试全元有机肥：由金星(日照)农业科技有限公司提供，含水量≤30％，有机质≥45％、全氮4％、全磷(P₂O₅)4％、全钾(K₂O)2％、硫酸锌(ZnSO₄)0.05％、游离氨基酸(AminoAcid)1％。

供试多功能生物有机肥：由金星(日照)农业科技有限公司提供，含水量≤30％，有机质≥45％、全氮4％、全磷(P₂O₅)4％、全钾(K₂O)2％、硫酸锌(ZnSO₄)0.05％、游离氨基酸(Amino Acid)1％，按有机肥干重的5％添加木霉固体发酵物制成生物有机肥。

5.2.实验设计

田间示范试验在山东省日照岚山区金星农田中进行。土壤基本性质如下：有机质含量21.4g·kg^-1，全氮含量2.2g·kg^-1，铵态氮含量19.5mg·kg^-1，硝态氮含量39.2mg·kg^-1，速效磷含量39.6mg·kg^-1，速效钾含量65.0mg·kg^-1。以农户常规施肥的为对照组(CK)；施用多功能生物有机肥替代15％化肥为处理1(T1)；施用多功能生物有机肥替代30％化肥为处理2(T2)；施用多功能生物有机肥替代100％化肥为处理3(T3)。每个处理3个重复，小区长33.3m，宽20m，面积666m²，所有处理按当地的施肥方式所需养分(每亩N:P:K＝12kg:6kg:4kg，追N24kg)统一施肥，常规管理，玉米成熟后采收果实称重计产。

5.3.实验结果

由绿色木霉菌Tv-151制成的多功能生物有机肥对玉米产量的影响如表5。与CK(常规施肥)相比，施用多功能生物有机肥对玉米的百粒重和产量的影响均达到了显著差异水平(P＜0.05)。其中T1(多功能微生物肥替代15％化肥)、T2(多功能微生物肥替代30％化肥)和T3(多功能微生物肥替代100％化肥)处理后玉米的百粒重分别是CK的1.05、1.07和1.05倍；产量分别增加了14.69％、19.26％和10.48％。以上结果表明，由绿色木霉菌Tv-151制成的多功能生物有机肥可以显著增加植物的产量，且以多功能微生物肥替代30％化肥处理的增产效果最为显著。

表5木霉多功能生物有机肥对玉米百粒重和产量的影响

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省科学院生物研究所

<120> 一种绿色木霉菌、菌剂、生物肥及应用

<130> 2010

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 576

<212> DNA

<213> 绿色木霉菌Tv-1511 rDNA-ITS

<400> 1

ggggatcgga ggtcactccc aacccaatgt gaacgttacc aaactgttgc ctcggcggga 60

tctctgcccc gggtgcgtcg cagccccgga ccaaggcgcc cgccggagga ccaaccaaaa 120

ctcttattgt ataccccctc gcgggttttt tactatctga gccatctcgg cgcccctcgt 180

gggcgtttcg aaaatgaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg 240

aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc 300

tttgaacgca cattgcgccc gccagtattc tggcgggcat gcctgtccga gcgtcatttc 360

aaccctcgaa cccctccggg gggtcggcgt tggggatcgg ccctttacgg ggccggcccc 420

gaaatacagt ggcggtctcg ccgcagcctc tcctgcgcag tagtttgcac actcgcatcg 480

ggagcgcggc gcgtccacag ccgttaaaca ccccaaactt ctgaaatgtt gacctcggat 540

caggtaggaa tacccgctga acttaagcat atcaaa 576

一种绿色木霉菌、菌剂、生物肥及应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。