专利摘要

本发明公开了一种利用旋转生物膜反应器贴壁培养雨生红球藻生产虾青素的方法，包括以下步骤：1、种子液制备；2、贴壁培养；3、生物量积累：达到稳态之后，将旋转生物膜反应器的培养液更换为含2.1g/L硝酸钠的BG11培养液，进行分批或补料‑分批培养；4、虾青素诱导：采用缺氮胁迫或/和高光强胁的方式诱导雨生红球藻积累虾青素，即将上述培养液更换为不含硝酸钠的BG11培养液或/和将光照强度提高至4500~10500lx；5、虾青素提取。本方法充分发挥了旋转生物膜反应器中雨生红球藻快速贴壁生长的优势，可以收获较高浓度的生物质，提高了虾青素的生产效率，降低采收成本。

权利要求

1.一种利用旋转生物膜反应器贴壁培养雨生红球藻生产虾青素的方法，包括以下步骤：

1）种子液制备：将雨生红球藻藻种接种至含BG11培养液的三角瓶中，在光照强度1000-4000 lx、室温下，培养5-7 d，制备种子液；

2）贴壁培养：取步骤1）中的种子液，转移到含BG11培养液的旋转生物膜反应器中，光照强度1000-4000 lx、室温下，进行贴壁培养，直至培养达到稳态；

3）生物量积累：达到稳态之后，将旋转生物膜反应器的BG11培养液更换为含2.1 g/L硝酸钠的BG11培养液，进行分批或补料-分批培养；

4）虾青素诱导：6-14天后，采用缺氮胁迫和高光强胁的方式诱导雨生红球藻积累虾青素，所述的缺氮胁迫是将上述培养液更换为不含硝酸钠的BG11培养液，所述的高光强胁迫是将光照强度提高至7500lx；

5）虾青素提取：1-10天后，收获膜布上的雨生红球藻的生物质，冷冻干燥，获得藻粉，向藻粉中加入含有5%KOH和30%甲醇的混合液破坏叶绿素，离心，收集沉淀，将沉淀物研磨破壁，加入乙醇：乙酸乙酯（v:v）=3:1的混合试剂，振荡，离心收集上清液，上清液经真空旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即获得虾青素。

2.根据权利要求1所述的利用旋转生物膜反应器贴壁培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于：采用高光胁迫及缺氮胁迫4天后收获雨生红球藻的生物质。

3.根据权利要求1或2所述的利用旋转生物膜反应器贴壁培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于：步骤 3）中采用补料-分批的培养方式时，每天从反应器中取出5%-25%（v/v）的藻液，并加入等体积的含2.1 g/L硝酸钠的新型BG11培养液。

说明书

技术领域

本发明属于微藻应用领域，具体涉及一种利用旋转生物膜反应器贴壁培养雨生红球藻生产虾青素的方法。

背景技术

虾青素是一种类胡萝卜素，具有强烈的抗氧化作用，它淬灭单线态氧和捕捉自由基的能力比β-胡萝卜素高10余倍，比维生素E强100多倍(详见参考文献1：Capelli B,Bagchi D,Cysewski G.Synthetic astaxanthin is significantly inferiorto algal-based astaxanthin as an antioxidant and maynot be suitable as a human nutraceutical supplement.Nutrafoods,2013,12:145-152)，且可以增强免疫反应、提高抗癌活性。虾青素常作为食品添加剂广泛应用于食品、保健品行业。虾青素可由藻类合成，目前国内外报道最多的生产藻是雨生红球藻。雨生红球藻生产虾青素的优点是：单细胞生物繁殖快、培养简单、易于提取，且藻粉可直接应用于食品及饲料工业，雨生红球藻已成为国际上天然虾青素生产的研究热点。

传统方法多通过液体悬浮培养体系培养雨生红球藻生产虾青素，这种培养方法存在雨生红球藻生长速度慢，生物质浓度低，占地面积大，资源利用率低，采收困难等问题。旋转生物膜反应器可贴壁培养藻类，可缓解传统液体悬浮培养中资源利用率低、采收成本较高等问题(详见参考文献2：Gross M,Henry W,Michael C,Wen Z.Development of a rotating algal biofilm growth system for attached microalgae growth with in situ biomass harvest.Bioresource Technology.2013,150,195-201)。藻细胞固定在材料表面形成生物膜，完全暴露在空气中，可以直接从大气中获得二氧化碳，避免了传统悬浮液体培养中气液交换的限制，大大地提高了藻细胞的光合效率，可以提高藻生物量，获得较高浓度的生物质；反应器可向高空发展，占地面积小，采收容易。然而，旋转生物膜反应器还未用于培养雨生红球藻生产虾青素。本发明利用旋转生物膜反应器贴壁培养雨生红球藻生产虾青素，有望解决雨生红球藻生长缓慢、虾青素产率低的难题，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用旋转生物膜反应器贴壁培养雨生红球藻生产虾青素的方法，以加快雨生红球藻生长，获得较高浓度的生物质和虾青素，提高虾青素产率，并降低收获成本。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用旋转生物膜反应器贴壁培养雨生红球藻生产虾青素的方法，包括以下步骤：

1)种子液制备：将雨生红球藻藻种接种至含BG11培养液的三角瓶中，在光照强度1000～4000lx、室温下，培养5-7d，制备种子液；其中BG11培养液组成为：硝酸钠1500mg/L，磷酸氢二钾40mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，乙二胺四乙酸二钠1mg/L，碳酸钠20mg/L，硼酸2.86mg/L，四水氯化锰1.86mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，二水钼酸钠0.39mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，六水硝酸钴0.05mg/L；

2)贴壁培养：取步骤1)中的种子液，转移到含BG11培养液的旋转生物膜反应器中，光照强度1000～4000lx、室温下，进行贴壁培养，直至培养达到稳态；

3)生物量积累：达到稳态之后，将旋转生物膜反应器的BG11培养液更换为含2.1g/L硝酸钠的BG11培养液，进行分批或补料-分批培养；

4)虾青素诱导：6-14天后，采用缺氮胁迫或/和高光强胁的方式诱导雨生红球藻积累虾青素，所述的缺氮胁迫是将上述培养液更换为不含硝酸钠的BG11培养液，所述的高光强胁迫是将光照强度提高至4500～10500lx；

5)虾青素提取：1～10天后，收获膜布上的雨生红球藻的生物质，冷冻干燥，获得藻粉，向藻粉中加入含有5％KOH和30％甲醇的混合液破坏叶绿素，离心，收集沉淀，将沉淀物研磨破壁，加入乙醇：乙酸乙酯(v:v)＝3:1的混合试剂，振荡，离心收集上清液，上清液经真空旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即获得虾青素。

优选地，上述步骤4)中采用光照强度7500lx的高光胁迫及缺氮胁迫，4天后收获雨生红球藻的生物质。

优选地，步骤3)中采用补料-分批的培养方式时，每天从反应器中取出5％～25％(v/v)的藻液，并加入等体积的含2.1g/L硝酸钠的新型BG11培养液。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)利用旋转生物膜反应器培养雨生红球藻可以提高藻生物量，收获较高浓度的生物质，虾青素含量最高达1.8％，提高了虾青素产率。

(2)雨生红球藻在贴壁生长中，可直接从大气中获得二氧化碳，避免了传统悬浮液体培养中气液交换的限制，生长速度快。

(3)通过刮铲可直接获得高浓度的藻生物质，生物质采收简单、便捷。

(4)旋转生物膜反应器占地面积小，且可以向高空发展。

附图说明

图1为旋转生物膜反应器结构示意图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细说明，但所有实施例并不对本发明构成任何限制。

实施例1分批培养方式下缺氮胁迫不同时间对虾青素积累的影响

1)种子液制备：将雨生红球藻藻种接种至含BG11培养液(硝酸钠1500mg/L，磷酸氢二钾40mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，乙二胺四乙酸二钠1mg/L，碳酸钠20mg/L，硼酸2.86mg/L，四水氯化锰1.86mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，二水钼酸钠0.39mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，六水硝酸钴0.05mg/L)的三角瓶中，在光强1000-4000lx、室温(20-30℃，以下相同)下，培养5-7d，获得较高密度的藻液作为种子液；

2)贴壁培养：取步骤1)中的种子液，转移到含BG11培养液的旋转生物膜反应器中，室温，光强1000-4000Lx下，进行贴壁培养，直至培养达到稳态(以14天为一个培养周期，一般贴壁培养2-3个周期，即达到稳态，以下相同)；

3)生物量积累：达到稳态之后，将平稳态的旋转生物膜反应器的BG11培养液更换为含2.1g/L硝酸钠的BG11培养液，进行培养，每天在相对应的水槽中补充蒸馏水至刻度；生长14d后，藻生物量达到9.35g/m²；

4)虾青素诱导：将上述反应器中培养液更换为缺氮BG11培养液(不含硝酸钠)，胁迫不同时间(1d、4d、7d、10d)后收获；

5)虾青素提取：收获膜布上的藻生物质，冷冻干燥，获得藻粉，向藻粉中加入甲醇/KOH混合液(含有5％KOH和30％甲醇)破坏叶绿素，离心，收集沉淀，将沉淀物研磨破壁，加入乙醇、乙酸乙酯混合试剂(乙醇：乙酸乙酯的体积比为3：1)，振荡30s，4000rpm离心5min，上清液经真空旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即获得虾青素。

结果表明，未经缺氮胁迫的雨生红球藻虾青素含量为2.19mg/g，缺氮胁迫1d、4d、7d天后，虾青素含量分别达到6.06mg/g、11.40mg/g和9.46mg/g，胁迫10d与胁迫7d没有显著性变化。即在旋转生物膜反应器分批培养条件下，为提高虾青素的含量可进行1-10天的缺氮胁迫处理，其中缺氮胁迫4天最适合于雨生红球藻虾青素积累。

实施例2分批培养方式下不同光强胁迫对虾青素积累的影响

1)种子液制备：将雨生红球藻藻种接种至含BG11培养液(硝酸钠1500mg/L，磷酸氢二钾40mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，乙二胺四乙酸二钠1mg/L，碳酸钠20mg/L，硼酸2.86mg/L，四水氯化锰1.86mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，二水钼酸钠0.39mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，六水硝酸钴0.05mg/L)的三角瓶中，在光强1000-4000lx、室温下，培养5-7d，获得较高密度的藻液作为种子液；

2)贴壁培养：取步骤1)中的种子液，转移到含BG11培养液的旋转生物膜反应器中，室温，光强1000-4000lx下，进行贴壁培养，直至培养达到稳态；

3)生物量积累：达到稳态之后，将平稳态的旋转生物膜反应器的BG11培养液更换为含2.1g/L硝酸钠的BG11培养液，进行培养，每天在相对应的水槽中补充蒸馏水至刻度；生长14d后，藻生物量达到9.35g/m²；

4)虾青素诱导：将上述反应器光强度调整为4500lx、6000lx、7500lx、9000lx、10500lx，进行高光强胁迫，胁迫4天后收获；

5)虾青素提取：收获膜布上的藻生物质，冷冻干燥，获得藻粉，向藻粉中加入甲醇/KOH混合液(含有5％KOH和30％甲醇)破坏叶绿素，离心，收集沉淀，将沉淀物研磨破壁，加入乙醇、乙酸乙酯混合试剂(乙醇：乙酸乙酯的体积比为3：1)，振荡30s，4000rpm离心5min，上清液经真空旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即获得虾青素。

结果表明，在光强为4500lx、6000lx、7500lx、9000lx、10500lx，雨生红球藻虾青素的含量分别达到4.87、9.75、13.04、11.97、10.73mg/g，即在旋转生物膜反应器分批培养条件下，为提高虾青素的积累可将光照强度提高至4500-10500lx，7500lx光照强度最适合于雨生红球藻虾青素积累。

实施例3分批培养方式下同时对雨生红球藻进行缺氮胁迫和高光强胁迫诱导虾青素积累

1)种子液制备：将雨生红球藻藻种接种至含BG11培养液(硝酸钠1500mg/L，磷酸氢二钾40mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，乙二胺四乙酸二钠1mg/L，碳酸钠20mg/L，硼酸2.86mg/L，四水氯化锰1.86mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，二水钼酸钠0.39mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，六水硝酸钴0.05mg/L)的三角瓶中，在光强1000-4000lx、室温下，培养5-7d，获得较高密度的藻液作为种子液；

2)贴壁培养：取步骤1)中的种子液，转移到含BG11培养液的旋转生物膜反应器中，室温，光强1000-4000lx下，进行贴壁培养，直至培养达到稳态；

3)生物量积累：达到稳态之后，将平稳态的旋转生物膜反应器的BG11培养液更换为含2.1g/L硝酸钠的BG11培养液，进行培养，每天在相对应的水槽中补充蒸馏水至刻度；生长14d后，藻生物量达到9.35g/m²；

4)虾青素诱导：将上述反应器中培养液更换为缺氮BG11培养液(不含硝酸钠)，并将光强提高至7500lx，胁迫4天后收获；

5)虾青素提取：收获膜布上的藻生物质，冷冻干燥，获得藻粉，向藻粉中加入甲醇/KOH混合液(含有5％KOH和30％甲醇)破坏叶绿素，离心，收集沉淀，将沉淀物研磨破壁，加入乙醇、乙酸乙酯混合试剂(体积比为3：1)，振荡30s，4000rpm离心5min，上清液经真空旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即获得虾青素。

结果表明，在旋转生物膜反应器分批培养条件下，缺氮及7500lx强光胁迫4天后的雨生红球藻虾青素的含量为18.01mg/g，高于缺氮或强光因子单独胁迫时所获得的虾青素含量。

实施例4培养液不同更换量对虾青素积累的影响

1)种子液制备：将雨生红球藻藻种接种至含BG11培养液(硝酸钠1500mg/L，磷酸氢二钾40mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，乙二胺四乙酸二钠1mg/L，碳酸钠20mg/L，硼酸2.86mg/L，四水氯化锰1.86mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，二水钼酸钠0.39mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，六水硝酸钴0.05mg/L)的三角瓶中，在光强1000-4000lx、室温下，培养5-7d，获得较高密度的藻液作为种子液；

2)贴壁培养：取步骤1)中的种子液，转移到含BG11培养液的旋转生物膜反应器中，室温，光强1000-4000lx下，进行贴壁培养，直至培养达到稳态；

3)生物量积累：达到稳态之后，将平稳态的旋转生物膜反应器的BG11培养液更换为含2.1g/L硝酸钠的BG11培养液，进行培养，每天补充蒸馏水至1L刻度，并从相对应的水槽中取出25％、12.5％、8.33％、6.25％、5％体积的藻液，并加入与取出液同样体积的新鲜BG11培养液(含2.1g/L硝酸钠)，继续培养14d，测定生物质浓度；

4)虾青素诱导：将上述反应器中培养液更换为缺氮BG11培养液(不含硝酸钠)并将光强提高至7500lx，胁迫4天后收获；

5)虾青素提取：收获膜布上的藻生物质，冷冻干燥，获得藻粉，向藻粉中加入甲醇/KOH混合液(含有5％KOH和30％甲醇)破坏叶绿素，离心，收集沉淀，将沉淀物研磨破壁，加入乙醇、乙酸乙酯混合试剂(体积比为3：1)，振荡30s，4000rpm离心5min，上清液经真空旋转蒸发浓缩，冷冻干燥即获得虾青素。

结果表明，在不同培养液更换量(25％、12.5％、8.33％、6.25％、5％)条件下，藻生物量分别为19.62g/m²、15.58g/m²、13.67g/m²、12.93g/m²、12.66g/m²，虾青素含量分别达到了10.96mg/g、11.93mg/g、12.63mg/g、14.79mg/g、15.23mg/g。综合考虑虾青素提取的便利性、耗水量等因素，在旋转生物膜反应器补料-分批培养条件下，以培养液更换量5％为最优，其生物量及虾青素含量分别为12.66g/m²、15.23mg/g。

一种利用旋转生物膜反应器贴壁培养雨生红球藻生产虾青素的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。