专利摘要
本发明属于生物农药技术领域，具体公开了一种D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，包括用甲基纤维素溶液、羧甲基纤维素钠溶液、含蔗糖的明胶溶液的混合物对D型肉毒毒素蛋白进行保护，得到的D型肉毒毒素核液经海藻酸钙保护壳膜包被，最后经精蛋白/氧化硅杂化壳壁包被，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒。本发明公开的方法首次将仿生矿化技术应用于D型肉毒毒素的加工，明显提高了D型肉毒毒素对温度的耐受性，降低了D型肉毒毒素储藏要求，极大的降低了毒素的冷链保护条件要求。
权利要求
1.一种D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将2g/100ml的甲基纤维素溶液、2g/100ml的羧甲基纤维素钠溶液、2g/100ml的含有蔗糖的明胶溶液混合均匀，得到生物基保护液；
S2，将所述生物基保护液与1g/100ml的CaCl
S3，将D型肉毒毒素按照1:3的体积比例加至所述D型肉毒毒素保护液中，得到毒素混合液；向所述毒素混合液中加入食用色素，得到D型肉毒毒素核液；
S4，D型肉毒毒素仿生微囊颗粒的壳膜包被
将所述D型肉毒毒素核液注射入1g/100ml的海藻酸钠溶液中，加入无菌水，搅拌交联，过滤，清洗，过滤，然后将洗净的颗粒转入1g/100ml的CaCl
S5，精蛋白/氧化硅杂化壳壁的包被
将D型肉毒毒素仿生微囊颗粒置于30mmol/l的鱼精蛋白溶液中，搅拌，过滤，过滤后的颗粒再置于30mmol/l的硅酸钠溶液中，搅拌，过滤，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒；
S6，将麸皮、次粉、玉米粉按比例配制混匀后得到外层包裹物，将所述仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒置于外层包裹物中，震荡混匀包裹，室温放置8-12h后装袋，密封，得到精制的D型肉毒毒素颗粒。
2.根据权利要求1所述的D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，其特征在于，S1中，2g/100ml的甲基纤维素溶液、2g/100ml的羧甲基纤维素钠溶液、2g/100ml的明胶溶液的体积比例为1:3:1，其中每100ml的明胶溶液中添加10g蔗糖。
3.根据权利要求1所述的D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，其特征在于，S3中，食用色素为胭脂红或者含有胭脂红的红色复合色素，并且按照100ml:0.1g的比例向所述毒素混合液中加入食用色素。
4.根据权利要求3所述的D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，其特征在于，S3中，D型肉毒毒素的毒价为2000万MLD/ml。
5.根据权利要求1所述的D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，其特征在于，S4的具体步骤如下：
S41，用无菌注射器吸取配制好的D型肉毒毒素核液，采用12号针头匀速滴加至配备好的1g/100ml的海藻酸钠溶液中，针头距离液面高度15-20cm，滴加后静置5-10s，先以40r/min搅拌交联10min，再以80r/min搅拌交联10min，得到交联溶液；
S42，在上述交联溶液中加入相当于交联溶液体积1/3的无菌水，以80r/min搅拌交联5min，过滤，收集交联的颗粒；
S43，将交联的颗粒收集到干净烧杯中，加入pH 7.0的Tris-Hcl溶液，清洗30s，过滤，收集洗净的颗粒；
S44，将洗净的颗粒转入至1g/100ml的CaCl
6.根据权利要求1所述的D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，其特征在于，S5的具体步骤为：
将D型肉毒毒素仿生微囊颗粒置于配制好的30mmol/l的鱼精蛋白溶液中，以80r/min的速度搅拌20min，使每个颗粒表面形成一层透明的囊膜，过滤，过滤后的颗粒再置于30mmol/l的硅酸钠溶液中，以80r/min的速度搅拌10min，每个颗粒表面将包被形成精蛋白/氧化硅杂化壳壁，过滤，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒。
7.根据权利要求1所述的D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，其特征在于，麸皮、次粉、玉米粉的质量比例为1:3:1。
8.根据权利要求1所述的D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法在产毒素蛋白毒理研究或者加工中的应用。
说明书
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法及应用。
背景技术
D型肉毒毒素是一种大分子毒素蛋白，在诸多环境因子的作用下，如较高的温度、紫外线照射及动物胃肠道环境等容易发生蛋白变性，其有效成分发生降解，因此，毒素在存放、运输以及使用过程需要投入大量的人力、物力及财力保证D型肉毒毒素的冷链保护条件，才能保证相应的保存期和使用效果。这就大大提高了D型肉毒毒素的生产使用成本，限制了毒素的适用范围。
另外现已报到的D型肉毒毒素灭鼠剂主要有水剂、冻干剂和微粒剂，其中水剂需要常年在-16℃的低温冷库中保存，冻干剂虽然具有常温保存的特点，但是其制作过程相当繁琐，且需要具备大型的冻干设备才能完成，耗时耗力。微粒剂本身在加工制作工程中就存在大量的D型肉毒毒素由于产热而损失的弊端，其投入产出比为10:1，因此三种剂型都存在一定的弊端。
因此，有必要采用最新的研究手段对毒素进行相应的加工处理，降低D型肉毒毒素保存的冷链要求，避免使用大型冻干设备，扩大D型肉毒毒素的适用范围，使之能够具有更广泛的应用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供的一种D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，降低了D型肉毒毒素保存的冷链要求，避免使用大型冻干设备，提高投入产出比较高，扩大毒素的适用范围。
本发明的第一个目的是提供一种D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，包括以下步骤：
S1，将2g/100ml的甲基纤维素溶液、2g/100ml的羧甲基纤维素钠溶液、2g/100ml的含有蔗糖的明胶溶液混合均匀，得到生物基保护液；
S2，将所述生物基保护液与1g/100ml的CaCl2溶液按2:1的体积比例混合均匀，得到D型肉毒毒素保护液；
S3，将D型肉毒毒素按照1:3的体积比例为加至所述D型肉毒毒素保护液中，得到毒素混合液；向所述毒素混合液中加入食用色素，得到D型肉毒毒素核液；
S4，D型肉毒毒素仿生微囊颗粒的壳膜包被
将所述D型肉毒毒素核液注射入1g/100ml的海藻酸钠溶液中，加入无菌水，搅拌交联，过滤，清洗，过滤，然后将洗净的颗粒转入1g/100ml的CaCl2溶液中，搅拌钙化，得到海藻酸钙保护壳膜包被的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒；
S5，精蛋白/氧化硅杂化壳壁的包被
将D型肉毒毒素仿生微囊颗粒置于30mmol/l的鱼精蛋白溶液中，搅拌，过滤，过滤后的颗粒再置于30mmol/l的硅酸钠溶液中，搅拌，过滤，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒。
优选的，上述D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，S1中，2g/100ml的甲基纤维素溶液、2g/100ml的羧甲基纤维素钠溶液、2g/100ml的明胶溶液的体积比例为1:3:1，其中每100ml的明胶溶液中添加10g蔗糖。
优选的，上述D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，S3中，食用色素为胭脂红或者含有胭脂红的红色复合色素，并且按照100ml：0.1g的比例向所述毒素混合液中加入食用色素。
优选的，上述D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，S3中，D型肉毒毒素的毒价为2000万MLD/ml。
优选的，上述D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，S4的具体步骤如下：
S41，用无菌注射器吸取配制好的D型肉毒毒素核液，采用12号针头匀速滴加至配备好的1g/100ml的海藻酸钠溶液中，针头距离液面高度15-20cm，滴加后静置5-10s，先以40r/min搅拌交联10min，再以80r/min搅拌交联10min，得到交联溶液；
S42，在上述交联溶液中加入相当于交联溶液体积1/3的无菌水，以80r/min搅拌交联5min，过滤，收集交联的颗粒；
S43，将交联的颗粒收集到干净烧杯中，加入pH 7.0的Tris-Hcl溶液，清洗30s，过滤，收集洗净的颗粒；
S44，将洗净的颗粒转入至1g/100ml的CaCl2溶液中，以80r/min搅拌钙化20min，得到海藻酸钙保护壳膜包被的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒。
优选的，上述D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，S5的具体步骤为：
将D型肉毒毒素仿生微囊颗粒置于配制好的30mmol/l的鱼精蛋白溶液中，以80r/min的速度搅拌20min，使每个颗粒表面形成一层透明的囊膜，过滤，过滤后的颗粒再置于30mmol/l的硅酸钠溶液中，以80r/min的速度搅拌10min，每个颗粒表面将包被形成精蛋白/氧化硅杂化壳壁，过滤，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒。
优选的，上述D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，还包括以下步骤：
将麸皮、次粉、玉米粉按比例配制混匀后得到外层包裹物，将所述仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒置于外层包裹物中，震荡混匀包裹，室温放置8-12h后装袋，密封，得到精制的D型肉毒毒素颗粒。
优选的，上述D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，麸皮、次粉、玉米粉的质量比例为1:3:1。
本发明的第二个目的是提供一种D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法在产毒素蛋白毒理研究或者加工中的应用。
与现有技术相比，本发明的D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，具有以下有益效果：
(1)本发明首次将仿生矿化技术应用于D型肉毒毒素的加工，明显提高了D型肉毒毒素对温度的耐受性，降低了D型肉毒毒素储藏要求，极大的降低了毒素的冷链保护条件要求。
(2)本发明通过矿化包裹，使毒素在较高温度下(55℃)能够保证有效成分不损失，而这项技术将在很大程度上扩大毒素的适用范围，使毒素的应用从以往的北方寒冷地区扩展至南方温度较高区域的使用。
(3)本发明的仿生矿化技术，其制作工艺相比较低温冷冻干燥技术，制作工艺相对简便，且不需要具备大型的冻干设备，省时省力。与传统的颗粒加工技术相比较，不仅极大地降低了加工过程中毒素的损失，毒素的投入和产出比≤4:1，且毒素在室温下的保存期有了明显的延长。
(4)可通过本发明的仿生矿化技术对D型肉毒毒素的保护性研究，为其他毒素蛋白的保护利用、毒理研究或者加工提供了新的思路。
附图说明
图1是海藻酸钙保护壳膜包被的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒的外观图；
图2是表面形成透明囊膜的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒的外观图；
图3是仿生矿化加工的钙化壳膜的D型肉毒毒素颗粒的外观图；
图4是精制的D型肉毒毒素颗粒的外观图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下面实例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行。
根据D型肉毒毒素蛋白的生物学活性以及现用相关仿生矿化生物基材料，与D型肉毒毒素不同比例混合后进行对比分析，选择对毒素蛋白无降解作用并能与毒素完全互溶，且对温度不敏感的材料作为核液，然后，模仿细胞膜的结构和功能构建仿生微囊的壳膜，保证底物和产物自由扩散的同时，有效防止酶的泄漏；模仿硅藻细胞壁的形成过程和功能，利用精蛋白调控微囊表面的仿生硅化，形成规整的精蛋白/氧化硅杂化壳壁。其具体技术方案的实施例如下。
实施例1
一种D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，包括以下步骤：
S1，将2g/100ml的甲基纤维素溶液、2g/100ml的羧甲基纤维素钠溶液、2g/100ml的明胶溶液按照1:3:1的体积比例混合均匀，得到生物基保护液，其中每100ml的明胶溶液中添加10g蔗糖；
S2，将所述生物基保护液与1g/100ml的CaCl2溶液按2:1的体积比例混合均匀，得到D型肉毒毒素保护液；
S3，将D型肉毒毒素徐徐加至所述D型肉毒毒素保护液中，得到毒素混合液，其中，D型肉毒毒素与D型肉毒毒素保护液的体积比例为1:3；然后向所述毒素混合液中加入食用色素胭脂红，其中毒素混合液与食用色素的比例为100ml:0.1g，得到D型肉毒毒素核液，4℃保存备用；其中，D型肉毒毒素的毒价为2000万MLD/ml；
S4，D型肉毒毒素仿生微囊颗粒的壳膜包被
将所述D型肉毒毒素核液注射入1g/100ml的海藻酸钠溶液中，然后加入无菌水，搅拌交联，过滤，清洗，过滤，然后将洗净的颗粒转入1g/100ml的CaCl2溶液中，搅拌钙化，得到海藻酸钙保护壳膜包被的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒；具体操作如下：
S41，用无菌注射器吸取配制好的D型肉毒毒素核液，采用12号针头匀速滴加至配备好的30ml的1g/100ml的海藻酸钠溶液中，针头距离液面高度15cm，滴加后静置5s，先以40r/min搅拌交联10min，再以80r/min搅拌交联10min，得到交联溶液；
S42，在上述交联溶液中加入相当于交联溶液体积1/3的无菌水，以80r/min搅拌交联5min，过滤，收集交联的颗粒；
S43，将交联的颗粒收集到干净烧杯中，加入20ml pH 7.0的Tris-Hcl溶液，清洗30s，过滤，收集洗净的颗粒；
S44，将洗净的颗粒转入至1g/100ml的CaCl2溶液中，以80r/min搅拌钙化20min，得到海藻酸钙保护壳膜包被的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒，其外观形态如图1所示。
S5，精蛋白/氧化硅杂化壳壁的包被
将D型肉毒毒素仿生微囊颗粒置于30mmol/l的鱼精蛋白溶液中，搅拌，过滤，过滤后的颗粒再置于30mmol/l的硅酸钠溶液中，搅拌，过滤，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒，具体操作为：
将D型肉毒毒素仿生微囊颗粒置于配制好的30mmol/l的鱼精蛋白溶液中，以80r/min的速度搅拌20min，使每个颗粒表面形成一层透明的囊膜，表面形成透明囊膜的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒外观如图2所示，过滤，过滤后的颗粒再置于30mmol/l的硅酸钠溶液中，以80r/min的速度搅拌10min，每个颗粒表面将包被形成精蛋白/氧化硅杂化壳壁，过滤，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒，外观如图3所示。
S6，外层包覆：为了增加D型肉毒毒素颗粒的可塑性以及可食性，我们选用麸皮(200目)、次粉、玉米粉按1:3:1的质量比例配制混匀后得到外层包裹物，将仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒置于其中，震荡混匀包裹，室温放置8-12h后装袋，密封，得到精制的D型肉毒毒素颗粒，外观图4所示。
实施例2
一种D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，包括以下步骤：
S1，将2g/100ml的甲基纤维素溶液、2g/100ml的羧甲基纤维素钠溶液、2g/100ml的明胶溶液按照1:3:0.9的体积比例混合均匀，得到生物基保护溶液，其中每100ml的明胶溶液中添加10g蔗糖；
S2，将所述生物基保护溶液与1g/100ml的CaCl2溶液按2:1的体积比例混合均匀，得到D型肉毒毒素保护液；
S3，将D型肉毒毒素徐徐加至所述D型肉毒毒素保护液中，得到毒素混合液，其中，D型肉毒毒素与D型肉毒毒素保护液的体积比例为1:3；然后向所述毒素混合液中加入由胭脂红和诱惑红复合而成的食用色素，其中毒素混合液与食用色素的比例为100ml:0.1g，得到D型肉毒毒素核液，4℃保存备用；其中，D型肉毒毒素的毒价为2000万MLD/ml；
S4，D型肉毒毒素仿生微囊颗粒的壳膜包被
将所述D型肉毒毒素核液注射入1g/100ml的海藻酸钠溶液中，然后加入无菌水，搅拌交联，过滤，清洗，然后将洗净的颗粒转入1g/100ml的CaCl2溶液中，搅拌钙化，得到海藻酸钙保护壳膜包被的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒；具体操作如下：
S41，用无菌注射器吸取配制好的D型肉毒毒素核液，采用12号针头匀速滴加至配备好的30ml的1g/100ml的海藻酸钠溶液中，针头距离液面高度20cm，滴加后静置10s，先以40r/min搅拌交联10min，再以80r/min搅拌交联10min，得到交联溶液；
S42，在上述交联溶液中加入相当于交联溶液体积1/3的无菌水，以80r/min搅拌交联5min，过滤，收集交联的颗粒；
S43，将交联的颗粒收集到干净烧杯中，加入20ml pH 7.0的Tris-Hcl溶液，清洗30s，过滤，收集洗净的颗粒；
S44，将洗净的颗粒转入至1g/100ml的CaCl2溶液中，以80r/min搅拌钙化20min，得到海藻酸钙保护壳膜包被的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒。
S5，精蛋白/氧化硅杂化壳壁的包被
将D型肉毒毒素仿生微囊颗粒置于30mmol/l的鱼精蛋白溶液中，搅拌，过滤，过滤后的颗粒再置于30mmol/l的硅酸钠溶液中，搅拌，过滤，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒，具体操作为：
将D型肉毒毒素仿生微囊颗粒置于配制好的30mmol/l的鱼精蛋白溶液中，以80r/min的速度搅拌20min，使每个颗粒表面形成一层透明的薄膜，过滤，过滤后的颗粒再置于30mmol/l的硅酸钠溶液中，以80r/min的速度搅拌10min，每个颗粒表面将包被形成精蛋白/氧化硅杂化壳壁，过滤，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒。
经过上述实施例1方法制备而成的仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒或者精制的明显提高了D型肉毒毒素对温度的耐受性，降低了D型肉毒毒素储藏要求，极大的降低了毒素的冷链保护条件要求，包括：
(1)经仿生矿化后的D型肉毒毒素矿化颗粒在室温下放置的保护性能3个月毒力不变，半衰期为5-6个月，而未经仿生矿化加工的D型肉毒原毒素室温放置2周后，毒素毒力由原来的500万MLD/ml降低到300万MLD/ml。
(2)经仿生矿化后的D型肉毒毒素矿化颗粒在37℃下放置14d毒力不变，半衰期为3个月，而未经仿生矿化加工的D型肉毒原毒素37℃下放置7d后，毒素毒力由原来的500万MLD/ml降低到100万MLD/ml。
(3)经仿生矿化后的D型肉毒毒素矿化颗粒在55℃下放置7d毒力由原来的500万MLD/ml降低到300万MLD/ml，14d时毒力为250万MLD/ml；而未经仿生矿化加工的D型肉毒原毒素55℃下放置7d后，毒素毒力由原来的500万MLD/ml降低到100万MLD/ml，14d时毒力几乎完全降解为0。
上述实验说明本发明仿生矿化加工方法对毒素的毒力保护效果明显，可以明显提高了D型肉毒毒素对温度的耐受性。这将在很大程度上扩大毒素的适用范围，使毒素的应用从以往的北方寒冷地区扩展至南方温度较高区域的使用。
本发明使用的仿生矿化加工方法其制作工艺相比较低温冷冻干燥技术，制作工艺相对简便，且不需要具备大型的冻干设备，省时省力。与传统的颗粒加工技术相比较，不仅极大地降低了加工过程中毒素的损失，且毒素在室温下的保存期有了明显的延长。通过仿生矿化技术对D型肉毒毒素的保护性研究，为其他毒素蛋白的保护利用提供了新的思路。
需要说明的是，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例1-2，尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
一种D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法及应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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