专利摘要
本发明涉及一种具有降糖活性的苦瓜皂苷和多糖双水相一步提取方法，包括：将干燥苦瓜粉与异丙醇/(NH4)2SO4双水相体系混匀，采用超声‑微波协同萃取进行提取后，分离上下相。上相为苦瓜皂苷粗提液，经旋转蒸发至无醇味，制得苦瓜皂苷提取液，用AB‑8型大孔树脂静态吸附纯化得苦瓜皂苷精提液，冷冻干燥制得苦瓜皂苷成品。下相为苦瓜多糖粗提液，经无水乙醇沉淀、丙酮洗涤、透析，得苦瓜多糖精提液，冷冻干燥制得苦瓜多糖成品。本发明采用超声‑微波辅助双水相体系的提取方法，一步制备苦瓜皂苷和苦瓜多糖粗提液，提取工艺简单、成本低，可有效缩短提取时间、提高萃取纯度和减少提取步骤，对α‑葡萄糖苷酶和α‑淀粉酶有较强抑制作用。
权利要求
1.一种苦瓜皂苷和苦瓜多糖双水相一步提取方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)制备苦瓜皂苷和苦瓜多糖粗提液：取干燥的苦瓜粉于异丙醇/(NH
(2)制备苦瓜皂苷提取液：将苦瓜皂苷粗提液经旋转蒸发至无醇味，制得苦瓜皂苷提取液；
(3)制备苦瓜皂苷精提液：将苦瓜皂苷提取液进一步通过AB-8型大孔树脂静态吸附纯化，制得苦瓜皂苷精提液；
(4)制备苦瓜多糖精提液：将苦瓜多糖粗提液经无水乙醇醇沉、丙酮洗涤、透析除盐，制得苦瓜多糖精提液；
(5)冷冻干燥制备苦瓜皂苷和苦瓜多糖成品。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)异丙醇/(NH
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)超声-微波协同萃取/反应仪为CW-2000型，超声波功率为50W，微波功率为800W。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中苦瓜粉与异丙醇/(NH
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中大孔树脂纯化苦瓜皂苷的具体步骤如下：
静态吸附：取5-8g预处理好的大孔树脂，将其倒入装有100-150mL苦瓜皂苷提取液的锥形瓶中，于25℃恒温振荡器中以160r/min震荡8h；
静态解吸：用双蒸水冲洗大孔树脂，待洗至用苯酚-硫酸法检测不显红色为止，抽滤至干，将大孔树脂倒入装有100-150mL无水乙醇的锥形瓶中，于25℃恒温振荡器中以160r/min震荡1h；过滤后将醇溶液旋转蒸发至无醇味，即制得苦瓜皂苷精提液。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述无水乙醇醇沉主要为：向苦瓜多糖粗提液中加入4倍体积无水乙醇醇沉，静置12h或过夜。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述透析除盐的步骤为：将丙酮洗涤后的多糖沉淀复溶于双蒸水，倒入3500Da的透析袋中进行透析30-40h。
说明书
技术领域
本发明涉及天然产物深加工技术领域，具体涉及一种苦瓜皂苷和苦瓜多糖双水相一步提取法及体外降糖活性考察。
背景技术
苦瓜，又名凉瓜，是葫芦科苦瓜属的一种攀缘植物，广泛种植于热带和亚热带地区，是人们生活中的一种常见蔬菜，在医药上有明目、助消化、清凉解毒、利尿和治疗糖尿病等功效，因此素有“药用蔬菜”之称。现代研究表明苦瓜中皂苷和多糖是其发挥降糖作用的主要活性成分，因此，建立苦瓜中皂苷和多糖的提取工艺技术，对指导苦瓜的精深加工及其功能食品研制具有重要意义。目前，对苦瓜皂苷和苦瓜多糖的提取工艺多是分别单独提取，尚未见苦瓜皂苷和多糖的同时提取工艺报道，且其通常采用普通有机溶剂热水浴或热醇浴提取、超声波或微波提取、大孔吸附树脂提取、酶提取等方法，多为单独或两两结合使用这些方法进行提取，但其仍存在能耗高、提取时间长、提取纯度低、操作繁琐、有机溶剂残留等问题。目前，尚未见采用超声-微波辅助双水相体系一步萃取工艺报道。此外，对苦瓜降血糖作用研究前人报道较多，但多为通过造大小鼠的Ⅰ/Ⅱ型糖尿病动物模型对苦瓜皂苷和多糖的体内降糖作用及机理进行研究，而苦瓜皂苷和多糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的体外降糖研究较少，尤其是对苦瓜皂苷和多糖抑制α-葡萄糖糖苷酶的活性比较研究较少。此外，苦瓜皂苷和多糖抑制α-淀粉酶的活性研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够同时萃取得到苦瓜皂苷和苦瓜多糖的新型提取方法，该方法采用超声-微波辅助双水相体系分离技术，充分利用超声振动的空化作用、微波的高能作用以及双水相的快速分离作用，尤其是双水相体系可提供一个温和的分离环境和富集效果，有利于获得高纯度的苦瓜皂苷和苦瓜多糖。
本发明的苦瓜皂苷和苦瓜多糖双水相一步提取方法包括如下步骤：
（1）制备苦瓜皂苷和苦瓜多糖粗提液：取干燥的苦瓜粉于异丙醇/(NH4)2SO4双水相体系中，震荡混匀，使用超声-微波协同萃取/反应仪进行提取；待提取结束后，离心分离上下相，得到富集皂苷的上相，即苦瓜皂苷粗提液；富集多糖的下相，即苦瓜多糖粗提液；
（2）制备苦瓜皂苷提取液：将苦瓜皂苷粗提液经旋转蒸发至无醇味，制得苦瓜皂苷提取液；
（3）制备苦瓜皂苷精提液：将苦瓜皂苷提取液进一步通过AB-8型大孔树脂静态吸附纯化，制得苦瓜皂苷精提液；
（4）制备苦瓜多糖精提液：将苦瓜多糖粗提液经无水乙醇醇沉、丙酮洗涤、透析除盐，制得苦瓜多糖精提液；
（5）冷冻干燥制备苦瓜皂苷和苦瓜多糖成品。
其中，步骤(1)中异丙醇/(NH4)2SO4双水相萃取条件为系线长度(TLL)为65，上相与下相体积比(相比R)为1，其中各组分质量分数分别为15.33%(NH4)2SO4、31.61%异丙醇，其余用0.01mol/L PBS缓冲液(pH=7.0)补齐；
超声-微波协同萃取/反应仪为CW-2000型，超声波功率50W，微波功率800W；
苦瓜粉与双水相体系的质量比(料液比)为1:70(g/g)，提取时间为15min，提取温度为70℃；
离心条件为4000rpm离心10min。
其中，步骤(3)中大孔树脂纯化苦瓜皂苷的具体步骤如下：
静态吸附：
取5-8g预处理好的大孔树脂，将其倒入装有100-150mL苦瓜皂苷提取液的锥形瓶中，于25℃恒温振荡器中以160r/min震荡8h。
静态解吸：
用双蒸水冲洗大孔树脂，待洗至用苯酚-硫酸法检测不显红色为止，抽滤至干，将大孔树脂倒入装有100-150mL无水乙醇的锥形瓶中，于25℃恒温振荡器中以160r/min震荡1h。过滤后将醇溶液旋转蒸发至无醇味(旋蒸过程中加适量双蒸水)，即制得苦瓜皂苷精提液。
其中，步骤(4)中向苦瓜多糖粗提液中加入4倍体积无水乙醇醇沉，静置12h或过夜；
透析除盐的步骤为：将丙酮洗涤后的多糖沉淀复溶于双蒸水，倒入3500Da的透析袋中进行透析30-40h。
其中，步骤(3)为冷冻干燥制得淡黄色粉末状苦瓜皂苷成品和白色粉末状苦瓜多糖成品。
所述的原材料苦瓜粉优选苦瓜果实，由苦瓜经低温烘干超微粉碎而成。
本发明的另一目的是提供由上述方法制备的苦瓜皂苷和苦瓜多糖粗提液、精提液及成品。
本发明制得的苦瓜皂苷成品应用香草醛-72%硫酸法在紫外可见光谱下测得其纯度(皂苷成品中所含苦瓜皂苷的百分比)75.24-79.57%；苦瓜多糖成品应用苯酚-硫酸法在紫外可见光谱下测得其纯度(多糖成品中所含苦瓜多糖的百分比)为95.70-99.54%。
本发明制得的苦瓜皂苷成品，皂苷得率(皂苷成品与苦瓜粉的质量百分比)为1.45-1.47%；苦瓜多糖成品，多糖得率(多糖成品与苦瓜粉的质量百分比)为22.13-27.21%。
其中，香草醛-72%硫酸法测定苦瓜皂苷纯度的具体方法如下：
母液的配制：
人参皂苷Rg1标准溶液配制：准确称取5.0mg人参皂苷Rg1于试管中，用甲醇溶解，并用容量瓶定容至10mL，配制成0.5mg/mL人参皂苷Rg1标准溶液；
8%香草醛溶液配制：准确称取8.0g香草醛于100mL锥形瓶中，用冰醋酸溶解，并用容量瓶定容至100mL，配制成8%香草醛溶液；
72%硫酸溶液配制：准确量取87mL双蒸水于500mL烧杯中，向其中缓慢加入163mL浓硫酸，边加边用玻璃棒搅拌，待温度降至室温后用容量瓶定容至250mL，配制成质量浓度为72%硫酸溶液。
人参皂苷Rg1标准曲线绘制：
分别吸取30、60、90、120、150、180、210μL人参皂苷Rg1标准溶液于具塞试管中，用甲醇将各管溶液补齐至210μL，另取210μL甲醇做空白对照，加入0.3mL8%香草醛溶液和3mL72%硫酸溶液，摇匀，60℃水浴15min，冰浴10min，室温静置2-3min，于560nm下测定各管紫外可见光谱吸光光度值，以人参皂苷Rg1质量(μg)为横坐标，吸光光度值(OD)为纵坐标，绘制出标准曲线。
苦瓜皂苷成品纯度的测定：
称取一定质量的苦瓜皂苷成品，配成一定浓度的皂苷溶液。吸取210μL皂苷溶液于具塞试管中，加入0.3mL 8%香草醛溶液和3mL 72%硫酸溶液，摇匀，60℃水浴15min，冰浴10min，室温静置2-3min，于560nm下测定吸光光度值，根据绘制出的标准曲线，计算皂苷成品的纯度。
其中，苯酚-硫酸法测定苦瓜多糖纯度的具体方法如下：
母液的配制：
葡萄糖标准溶液配制：取标准葡萄糖适量放于105℃烘箱中至质量不再减少时取出，准确称取10.0mg葡萄糖于100mL锥形瓶中，用双蒸水溶解，并用容量瓶定容至100mL，配制成10mg/mL葡萄糖标准溶液；
80%苯酚溶液配制：将苯酚置于50℃水浴锅中使之融化，准确称取40.0g苯酚于100mL烧杯中，加入10.0g双蒸水，混匀后倒入棕色试剂瓶中，置于4℃冰箱中保存，配制过程在通风橱中进行，用时将母液稀释至5%。
葡萄糖标准曲线绘制：
分别吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL葡萄糖标准溶液于玻璃试管中，用双蒸水将各管溶液补齐至0.5mL，另取0.5mL双蒸水做空白对照，加入0.5mL 5%苯酚溶液，摇匀后静置2min使其充分反应，再加入2.5mL浓硫酸溶液，充分混匀后室温静置20min，于490nm下测定各管紫外可见光谱吸光光度值，以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标，吸光光度值(OD)为纵坐标，绘制出标准曲线。
苦瓜多糖成品纯度的测定：
称取一定质量的苦瓜多糖成品，配成一定浓度的多糖溶液。吸取0.5mL多糖溶液于玻璃试管中，加入0.5mL 5%苯酚溶液，摇匀后静置2min使其充分反应，再加入2.5mL浓硫酸溶液，充分混匀后室温静置20min，于490nm下测定各管紫外可见光谱吸光光度值，根据绘制出的标准曲线，计算多糖成品的纯度。
此外，本发明的另一目的是通过建立苦瓜皂苷和苦瓜多糖新型双水相一步法提取工艺技术，制备具有一定生物及降糖活性的苦瓜皂苷和苦瓜多糖成品，从而比较和评价二者的降糖效果。
本发明所得苦瓜皂苷和苦瓜多糖成品对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50分别为1.05mg/mL和6.01mg/mL，阿卡波糖的IC50为0.21mg/mL。苦瓜皂苷的抑制作用明显强于苦瓜多糖，但二者抑制α-葡萄糖苷酶的活性均低于阳性对照阿卡波糖，其中苦瓜皂苷对α-葡萄糖苷酶的抑制活性相当于阿卡波糖的1/5。
本发明所得苦瓜皂苷成品对α-淀粉酶的半抑制浓度IC50为6.70mg/mL，苦瓜多糖无明显抑制作用，阿卡波糖的IC50为0.16mg/mL，苦瓜皂苷对α-淀粉酶的抑制活性相当于阿卡波糖的1/42。
本发明的苦瓜皂苷和苦瓜多糖双水相一步提取方法具有以下优点：
（1）本发明的超声-微波辅助双水相体系分离技术采用三强结合的方法，充分利用超声振动的空化作用、微波的高能作用以及双水相的快速分离作用。避免了传统提取技术生物活性低、收率低、成本高等弊端，提取工艺简单、成本低、适于间歇性和规模化生产加工高纯度、高收率的苦瓜皂苷和苦瓜多糖。
（2）本发明通过建立苦瓜皂苷和苦瓜多糖新型双水相一步法提取工艺技术，制备具有一定生物及降糖活性的苦瓜皂苷和苦瓜多糖成品，从而比较和评价二者的降糖效果，为进一步合理利用苦瓜资源奠定基础。
附图说明
图1是本发明的苦瓜皂苷和苦瓜多糖双水相一步法制备工艺流程图；
图2是人参皂苷Rg1和葡萄糖的标准曲线图；其中，图2(a)为人参皂苷Rg1标准曲线；图2(b)为葡萄糖标准曲线；
图3是苦瓜皂苷和苦瓜多糖纯度及得率；其中，图3(a)为苦瓜皂苷和苦瓜多糖的纯度；图3(b)为苦瓜皂苷和苦瓜多糖的得率；
图4是苦瓜皂苷成品、苦瓜多糖成品及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制率图；
图5是苦瓜皂苷成品、苦瓜多糖成品及阿卡波糖对α-淀粉酶活性抑制率图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
制备苦瓜皂苷和苦瓜多糖
苦瓜皂苷和苦瓜多糖的双水相一步法制备工艺流程图如图1所示。主要包括以下步骤：
(1)配制异丙醇/(NH4)2SO4双水相体系：称取53.655g (NH4)2SO4于500mL反应锥形瓶中，加入185.71g 0.01mol/L PBS缓冲液(pH=7.0)，振摇使(NH4)2SO4溶解，再加入110.635g异丙醇，震荡混匀后静置分层；
(2)制备苦瓜皂苷和苦瓜多糖粗提液：称取5g干燥的苦瓜粉于350g异丙醇/(NH4)2SO4双水相体系中，震荡混匀，使用CW-2000型超声-微波协同萃取/反应仪进行提取。超声波功率为50W，微波功率为800W，提取时间为15min，提取温度为70℃，待提取结束后，4000rpm离心10min分离上下相，得到苦瓜皂苷粗提液(上相)和苦瓜多糖粗提液(下相)；
(3)制备苦瓜皂苷提取液：将苦瓜皂苷粗提液用旋蒸仪于83℃旋转蒸发至无醇味(旋蒸过程中加适量双蒸水)，制得苦瓜皂苷提取液；
(4)制备苦瓜皂苷精提液：将苦瓜皂苷提取液进一步通过AB-8型大孔树脂静态吸附纯化，制得苦瓜皂苷精提液。大孔树脂纯化苦瓜皂苷的具体步骤是首先为静态吸附：取5g预处理好的大孔树脂，将其倒入装有150mL苦瓜皂苷提取液的250mL锥形瓶中，于25℃恒温振荡器中以160r/min震荡8h。然后进行静态解吸：用双蒸水冲洗大孔树脂，待洗至用苯酚-硫酸法检测不显红色为止，抽滤至干，将大孔树脂倒入装有150mL无水乙醇的锥形瓶中，于25℃恒温振荡器中以160r/min震荡1h。过滤除去大孔树脂后将醇溶液在80℃下旋转蒸发至无醇味(旋蒸过程中加适量双蒸水)，即制得苦瓜皂苷精提液；
（5）制备苦瓜多糖精提液：将苦瓜多糖粗提液先经4倍体积无水乙醇醇沉过夜，然后经100mL丙酮洗涤，再将多糖沉淀复溶于双蒸水，置于3500Da透析袋中透析除盐，透析时间40h，制得苦瓜多糖精提液；
（6）冷冻干燥制备淡黄色粉末状苦瓜皂苷成品和白色粉末状苦瓜多糖成品。
通过应用香草醛-72%硫酸法测定苦瓜皂苷成品在560nm处紫外可见光谱吸光光度值，可得到苦瓜皂苷成品的得率及纯度；通过应用苯酚-硫酸法测定苦瓜多糖成品在490nm处紫外可见光谱吸光光度值，可得到苦瓜多糖成品的得率及纯度。
人参皂苷Rg1和葡萄糖标准曲线如图2所示，其中，图2(a)为人参皂苷Rg1标准曲线；图2(b)为葡萄糖标准曲线。
苦瓜皂苷和苦瓜多糖纯度及得率如图3所示，其中，图3(a)为苦瓜皂苷和苦瓜多糖的纯度，图3(b)为苦瓜皂苷和苦瓜多糖的得率。
上述实施例的步骤中各条件可以根据说明书的内容进行适应性的变动，得到如下数据：
苦瓜皂苷成品纯度为75.24-79.57%，得率(皂苷成品与苦瓜粉的质量比)为1.45-1.47%；苦瓜多糖成品纯度为95.70-99.54%，得率(多糖成品与苦瓜粉的质量比)为22.13-27.21%。
实施例2
苦瓜皂苷和苦瓜多糖体外降糖活性比较评定
本实施例中样品为阿卡波糖、苦瓜皂苷成品和苦瓜多糖成品。苦瓜皂苷和苦瓜多糖体外降糖活性测定指标由其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制率来评定。
1、α-葡萄糖苷酶体系
酶活力单位定义：在37℃，pH=6.8条件下，α-葡萄糖苷酶1min内水解PNPG释放1μmol PNP所需要的量；抑制剂活力单位：在相同条件下，降低1个酶活力单位所需要的抑制剂量。
反应原理：
反应过程：以50%二甲基亚砜为溶剂，分别配制样品苦瓜皂苷溶液（浓度为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00mg/mL）和苦瓜多糖溶液（浓度为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00mg/mL），选用阿卡波糖为阳性对照（浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.80mg/mL）。准确移取50μL67mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8），加入96孔板后，依次加入10μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.5U/mL）和20μL样品溶液。将混合溶液在37℃恒温培养箱中预热5min，然后加入20μL底物（PNPG1mmol/L），摇匀，37℃恒温培养箱中反应20min后，加入50μL 1mol/LNaCO3溶液终止反应。酶标仪在405nm处测定其吸光光度值，并按以下公式计算出不同浓度对应的抑制率，其中，空白组不加酶和PNPG，样品对照组不加酶。
抑制率(%)＝[A空白-(A样品-A样品对照)]/A空白×100％
2、α-淀粉酶体系
母液的配制：
磷酸盐缓冲液的配制：量取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250mL于500mL烧杯中，加入0.2mol/L氢氧化钠溶液118mL，混匀，用双蒸水定容至1000mL，摇匀，配制得pH6.8磷酸盐缓冲液；
1%淀粉溶液的配制：准确称取1.0g可溶性淀粉，用适量双蒸水煮沸后定容至100mL，配制得1%淀粉溶液；
DNS溶液的配制：准确称取10.0g 3,5-二硝基水杨酸于1000mL烧杯中，适量双蒸水溶解后，缓慢加入100mL 5mol/LNaOH溶液，搅拌均匀，随后加入200.0g酒石酸钾纳，于50℃水浴锅中边加双蒸水边搅拌，待全部溶解后加2.0g结晶苯酚和0.5g无水亚硫酸钠，继续加热搅拌至全部溶解后，流水冷却，用双蒸水稀释定容至1000mL，储于棕色试剂瓶中，一周后使用。
反应过程：以pH6.8磷酸盐缓冲液为溶剂，分别配制样品苦瓜皂苷溶液(浓度为1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mg/mL)和苦瓜多糖溶液(浓度为8.00、12.00、16.00、20.00、50.00mg/mL)，选用阿卡波糖为阳性对照(浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mg/mL)。依次准确移取125μL α-淀粉酶溶液(2U/mL)和125μL样品溶液于玻璃试管中，摇匀，37℃恒温培养箱中孵育10min，然后加入250μL 1%淀粉溶液于37℃恒温培养箱中反应10min，随后加入500μLDNS试剂，沸水浴5min终止反应，流水冷却，向试管中加入双蒸水4mL，混匀，酶标仪在540nm处测定其吸光光度值，并按以下公式计算出不同浓度对应的抑制率。
其中，空白组(缓冲液+酶+缓冲液)，样品对照组(样品+酶+缓冲液)，对照组(缓冲液+酶+底物)，样品组(样品+酶+底物)。
抑制率(%)＝[1-(A样品-A样品对照)/(A对照-A空白)]×100％
如图4所示，苦瓜皂苷和苦瓜多糖对α-葡萄糖苷酶活性均有一定的抑制作用。其中，苦瓜皂苷对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50为1.05mg/mL，苦瓜多糖的IC50为6.01mg/mL，阿卡波糖的IC50为0.21mg/mL。苦瓜皂苷的抑制作用明显强于苦瓜多糖，但二者抑制α-葡萄糖苷酶的活性均低于阳性对照阿卡波糖，苦瓜皂苷对α-葡萄糖苷酶的抑制活性相当于阿卡波糖的1/5。
如图5所示，苦瓜皂苷对α-淀粉酶活性有一定的抑制作用，本发明所得苦瓜皂苷成品对α-淀粉酶的半抑制浓度IC50为6.70mg/mL，阿卡波糖的IC50为0.16mg/mL，苦瓜皂苷对α-淀粉酶的抑制活性相当于阿卡波糖的1/42。而苦瓜多糖各浓度组应用酶标仪在540nm处测得的吸光光度值显示其对α-淀粉酶活性无明显抑制作用。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
一种具有降糖活性的苦瓜皂苷和多糖双水相一步提取方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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