专利摘要

本发明公开了一种酯酶EstC11及其编码基因和应用。本发明从嗜热芽孢杆菌Bacillussp.CX01中克隆得到酯酶基因EstC11，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，全长为717bp，其编码的酯酶EstC11共包含238个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。将酯酶基因EstC11与表达载体pET‑28α(+)连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组酯酶EstC11。酯酶EstC11能催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应，酯酶EstC11作为催化剂通过水解拆分(±)‑乙酸苏合香酯，可制备得到光学纯度为98％，得率为39％的R‑乙酸苏合香酯。

权利要求

1.一种酯酶EstC11，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的酯酶EstC11的酯酶基因。

3.根据权利要求2所述的酯酶基因，其特征在于，所述的酯酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

4.一种含有权利要求2所述的酯酶基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pET-28α(+)载体。

6.一种含有权利要求2所述的酯酶基因的基因工程菌。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.权利要求1所述的酯酶EstC11在拆分(±)-乙酸苏合香酯制备得到R-乙酸苏合香酯中的应用。

9.权利要求1所述的酯酶EstC11在耐受金属离子、表面活性剂或有机溶剂环境下进行催化的应用；所述的应用为酯酶EstC11在水解对硝基苯酚乙酸酯中的应用；所述的金属离子为Mg2+、Na+、Ca2+或Li+；所述的表面活性剂为三聚磷酸钠；所述的有机溶剂为正己烷或异辛烷。

说明书

技术领域：

本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种酯酶EstC11及其编码基因和应用。

背景技术：

酯酶广泛存在于动物、植物及微生物中，是一类催化水解或形成酯键的酶，作用的底物通常是脂肪链小于十个碳原子的酯类。酯酶属于α/β折叠水解酶超家族，催化中心一般由丝氨酸、天冬氨酸/谷氨酸和组氨酸组成，保守序列为丝氨酸附近的五肽(GXSXG)序列。酯酶能催化水解、酯化、转酯化等多种化学反应，是一种很重要的工业生物催化剂，被广泛运用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、废水处理和饲料工业等领域。从催化特性来看，酯酶具有高度的化学选择性和立体异构选择性，且反应不需要辅酶、反应条件温和、副产物少。在生产应用中的酯酶的另一显著特点是它能在异相系统(即油-水界面)或有机相中作用。在水相中，酯酶通常催化水解反应，而在有机相中，它却能催化酯化和转酯化反应。通过微生物酯酶的生物转化制备新型药物中间体或者去除药物消旋体中的非有效成分，是一种重要的手性技术，有着非常广阔的应用前景，它可以为合成手性药物提供新的平台，为大量制备光学纯化合物提供新的方法。酶法选择性拆分消旋体化合物，具有立体专一性高，副反应少，产率高，产物光学纯度好以及反应条件温和的优点，所以是一种被广泛认可的拆分方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新的酯酶EstC11及其编码基因和应用。

本发明从一株嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01中开发得到一种酯酶EstC11及其编码基因EstC11，构建了含有酯酶基因EstC11的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得酯酶EstC11，其可应用于拆分(±)-乙酸苏合香酯。

本发明的第一个目的是提供一种酯酶EstC11，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的酯酶EstC11的酯酶基因EstC11。

所述的酯酶基因EstC11的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种含有所述的酯酶基因EstC11的重组表达载体。所述的表达载体，优选pET-28α(+)载体。

本发明还提供一种含有所述的酯酶基因EstC11的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。

本发明的第三个目的是提供所述的酯酶EstC11在催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应中的应用。

优选，所述的应用为酯酶EstC11在拆分(±)-乙酸苏合香酯制备得到R-乙酸苏合香酯中的应用。

本发明的第四个目的是提供酯酶EstC11在耐受金属离子、表面活性剂或有机溶剂环境下进行催化的应用，所述的金属离子为Mg2+、Na+、Ca2+或Li+；所述的表面活性剂为三聚磷酸钠；所述的有机溶剂为正己烷或异辛烷。

本发明的酯酶基因EstC11来自嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01，保存在中国科学院南海海洋研究所。本发明利用生物信息学分析方法，分析得到一个酯酶基因EstC11。通过PCR的方法，从上述嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01基因组中克隆得到酯酶基因EstC11，全长为717bp(从起始密码子到终止密码子)，编码238个氨基酸。将酯酶基因EstC11与表达载体pET-28α(+)连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组酯酶EstC11。酯酶EstC11能催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应，酯酶EstC11作为催化剂拆分(±)-乙酸苏合香酯，可制备得到R-乙酸苏合香酯。

附图说明：

图1是酯酶EstC11的SDS-PAGE电泳；其中，M为蛋白marker，泳道1为IPTG诱导前的含有pET-28α(+)-EstC11的大肠杆菌BL21(DE3)总蛋白，泳道2为IPTG诱导后的含有pET-28α(+)-EstC11的大肠杆菌BL21(DE3)蛋白上清，泳道3为纯化的酯酶EstC11。

图2是酯酶EstC11对不同侧链长度酰基的对硝基苯酚酯的特异性。

图3是pH对酯酶EstC11活性的影响。

图4是不同pH对酯酶EstC11稳定性的影响。

图5是温度对酯酶EstC11活性的影响。

图6是不同温度对酯酶EstC11稳定性的影响。

图7是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随反应pH的变化曲线。

图8是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随反应温度的变化曲线。

图9是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随底物浓度的变化曲线。

图10是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随酶量的变化曲线。

图11是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随反应时间的变化曲线。

图12是反应前(±)-乙酸苏合香酯气相色谱图，S表示S-乙酸苏合香酯，R表示R-乙酸苏合香酯。

图13是最适反应条件下酯酶EstC11对(±)-乙酸苏合香酯的选择性水解气相色谱图，S表示S-乙酸苏合香酯，R表示R-乙酸苏合香酯，S’表示S-1-苯乙醇，R’表示R-1-苯乙醇。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明的酯酶基因EstC11来源于基因组测序的嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01，该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。

实施例1：酯酶基因EstC11开放阅读框边界确定及引物设计

提取嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01的基因组DNA，经全基因组测序后，利用生物信息学手段对基因组进行基因注释，分析其中的酯酶基因，确定了其中酯酶基因EstC11的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长为717bp(从起始密码子到终止密码子)，将其在NCBI中进行blastx比对分析，表明其与来源Bacillus paralicheniformisMDJK30的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(rhamnogalacturonan acetylesterase，WP_003180904.1)有96％的一致性。该鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(共235个氨基酸)只在蛋白质数据库中进行了序列注释并未对其功能进行鉴定(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_003180904.1)，并且目前没有发现对这个鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶的功能进行相应的鉴定和在手性拆分中的应用的报道。酯酶基因EstC11编码的酯酶EstC11的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共238个氨基酸。根据分析得到的酯酶基因EstC11序列，设计全长扩增引物如下：上游引物：5′-CACGGATCCATGAAACGAACAGACAAAAAGCC-3′(下划线为BamH I酶切位点)；下游引物：5′-CATCTCGAGTTACACGCCGGCACGGAA-3′(下划线为Xho I酶切位点)。

实施例2：酯酶基因EstC11的克隆及载体构建

2.1 PCR扩增

将实施例1设计的引物(上游引物：5′-CACGGATCCATGAAACGAACAGACAAAAAGCC-3′；下游引物：5′-CATCTCGAGTTACACGCCGGCACGGAA-3′)送至上海生物工程有限公司合成，合成的引物使用TE缓冲液溶解成终浓度为10μM，以提取的嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：

表1 PCR反应体系

使用以下PCR扩增程序扩增酯酶基因EstC11：94℃变性5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸2min，进行32个循环；72℃延伸10min，冷却到18℃。

将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察，回收735bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用30μL无菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。

2.2酶切

PCR产物使用以下体系进行酶切，酶切时间1.5h。酶切体系为：BamH I 2μL，Xho I2μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至40μL。酶切后按照胶回收试剂盒方法回收经过双酶切的PCR产物。

质粒pET-28α(+)的双酶切：挑取含有质粒pET-28α(+)的大肠杆菌DH5α单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用BamH I和Xho I按以下体系双酶切，酶切时间1.5h。酶切体系为：BamH I 2μL，Xho I 2μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至40μL。酶切后在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，按照胶回收试剂盒方法回收经过双酶切的线性pET-28a(+)载体。

上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen，Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)，质粒提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。

2.3连接

将经过双酶切的PCR产物和双酶切的线性pET-28α(+)载体按以下体系进行连接：双酶切PCR产物5μL，双酶切的线性pET-28α(+)载体1μL，T4连接酶(5U/μL)0.5μL，连接缓冲液(5×)2μL，用去离子水补足10μL，连接温度为20℃，20min。由此得到连接产物。

2.4转化及筛选

取5μL连接产物加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴20～30min，后于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm转速下，孵育培养1h。取一定量的菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mLLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。

2.5基因核苷酸序列测定

将筛选的阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与酯酶基因EstC11序列进行比对，进一步确认是将酯酶基因EstC11(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)插入到pET-28α(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有酯酶基因EstC11的pET-28α(+)质粒(命名为pET-28α(+)-EstC11)，可用于进行下一步试验。

实施例3：酯酶EstC11在E.coli BL21(DE3)中的高效表达

3.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制备

1.将少量大肠杆菌BL21(DE3)菌种接入5mL LB试管液中，200rpm、37℃过夜培养；

2.按1％体积比的接种量将试管中的菌液接种到200mL LB摇瓶中，200rpm、20℃过夜培养，得到原培养物；

3.将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至0℃，分装至冰预冷的离心管(50mL)，冰置数分钟；

4. 4℃、4000rpm离心10min回收细胞，弃上清；

5.用冰预冷的10mL 0.1M的CaCl2重悬细胞，4℃、4000rpm离心10～15min回收细胞；

6.重复5，用10mL 0.1M的CaCl2重悬细胞，冰浴30min以上；

7.4℃，4000rpm离心10min回收细胞；

8.每50mL原培养物用5mL含体积分数7.5％DMSO的0.1M CaCl2来重悬，分装于1.5mL离心管，50～100μL每管。-80℃保藏。由此得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

3.2转化

取实施例2中得到的pET-28α(+)-EstC11质粒0.5～1μL与50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm培养1h。培养物离心后涂布50μg/mL的卡那霉素LB平板，培养过夜20h后挑选单菌。由此得到含有pET-28α(+)-EstC11的大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例4：酯酶EstC11的表达和纯化

4.1蛋白诱导

将含有pET-28α(+)-EstC11的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中培养至OD600为0.85左右，加IPTG至终浓度0.2mM，22℃培养16h。300mL菌液4000rpm、4℃离心20min，收集菌体，用30mL(50mM，pH 7.4)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声400w，超4s，停6s，破碎15min分钟，离心，收集上清。将收集的上清于冷冻干燥机中冷冻干燥得到粗酶粉。

4.2酯酶EstC11的纯化与SDS-PAGE电泳

用镍离子亲和层析柱纯化4.1中收集的上清，具体实施方案如下：使用25mM的咪唑洗脱5个柱体积，40mM咪唑洗脱20～30个柱体积，最后使用3.5mL 300mM咪唑洗脱，收集最后的3mL洗脱液。用脱盐柱SephadexG25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。将纯化的酯酶进行SDS-PAGE凝胶电泳，得到纯化的酯酶EstC11(图1)，纯化的蛋白大小约29kD，符合理论预期。

4.3酯酶EstC11活性测定

酯酶EstC11活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①用乙腈配制5mM的对硝基苯酚酯溶液；②在0.2mL反应体系中加入188μL Tris-HCl buffer(50mM，pH 8.0)，8μL对硝基苯酚酯溶液(5mM)，4μL酯酶EstC11纯酶液(即纯化的酯酶EstC11，酯酶EstC11纯酶液稀释10倍后的酯酶EstC11浓度为0.7μg/μL，反应体系中酯酶EstC11的终浓度为0.14μg/μL)；③20℃下，反应4min后，加入50μL正丙醇终止反应，于405nm测定吸光度。

酶活力单位定义：1min内水解对硝基苯酚酯，释放1μM对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活力单位。

实施例5：酯酶EstC11的酶学性质

5.1水解不同侧链长度的对硝基苯酚酯

按照4.3的测定条件，比较酯酶EstC11水解不同长度酰基的对硝基苯酚酯C2-C12，结果如图2。说明酯酶EstC11对长链对硝基苯酚酯特异性差，而对于短链长度的对硝基苯酚酯的作用效果较好，最佳的底物是C2，即对硝基苯酚乙酸酯。

5.2最适pH和pH稳定性

配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表2所示，其浓度均为50mM。

表2不同pH的缓冲体系

将4.3中测定条件所述的缓冲液(Tris-HCl buffer)按照表2中的缓冲溶液分别进行替换，测定不同pH的缓冲溶液中重组酯酶EstC11的酶活力，底物为对硝基苯酚乙酸酯。pH对重组酯酶EstC11活性的影响结果见图3。在50mM的Tris-HCl pH8.5时，酯酶EstC11的酶活性最高，pH值在7.5-9之间有较高的酶活性。当pH低于7.5时，其活性迅速降低。酯酶EstC1 1在不同pH的缓冲液中的稳定性见图4。pH在7.0-9.0时酶活性较稳定，处理8h后残余活性在80％以上。在pH大于9.0时，酶活性丧失则较为明显。

5.3最适温度和温度稳定性

使用50mM的Tris-HCl pH8.5作为缓冲液，对硝基苯酚乙酸酯作为底物，按照4.3中的反应体系，在不同温度下测定酶活。测得酯酶EstC11催化水解对硝基苯酚乙酸酯的最适温度为25℃(图5)。在10-30℃间的酶活力达80％以上，温度大于35℃时酶活性急剧下降。将酯酶EstC11在不同温度(30-50℃)下，每隔15min取出测酶活力，结果见图6。酯酶EstC 11在低于40℃时，酶活性保持较高，处理90min后残余酶活性仍保持85％以上。随着处理温度的升高，酯酶残余酶活力逐渐下降，当温度高于45℃时酶活性急剧降低，在45℃处理90min后，残余酶活力为20％(图6)，说明酯酶EstC11在低于40℃时稳定性较好。在最适条件下(底物为硝基苯酚乙酸酯、缓冲液为50mM的Tris-HCl pH8.5和反应温度为25℃)，按4.3测定方法测得的酯酶EstC11酶活为124.5U/mg。

5.4金属离子对酯酶EstC11活性的影响

按照表3中的离子种类和浓度处理酯酶EstC11，以未添加任何离子或表面活性剂的反应体系中的酶活力为100％，作为对照，在室温下孵育3h，按4.3测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)测定相对酶活。金属离子对酶活性的影响见表3。与对照相比，Mn2+、Fe2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+等金属离子对酯酶EstC11催化对硝基苯酚乙酸酯的活力有强烈的抑制作用。而Na+、Ca2+、Mg2+、Li+、K+等对酯酶EstC11酶活力的影响很小。

表3金属离子对酯酶EstC11活力的影响

5.5表面活性剂对酯酶EstC11活性的影响

按照表4中的表面活性剂的种类和浓度处理酯酶EstC11，以未添加任何离子或表面活性剂的反应体系中的酶活力为100％，作为对照。在室温下孵育3h，按4.3测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)测定相对酶活。表面活性剂对酶活性的影响见表4。三聚磷酸钠对酶活性具有明显的激活作用，而TritonX-100、Tween-20和Tween-80对酶活性具有不同程度的抑制作用，并且随着浓度增加抑制作用增强。SDS和SDBS对CX-11的酶活具有强抑制性。

表4表面活性剂对酯酶EstC11活性的影响

5.6有机溶剂对酯酶EstC11活性的影响

按照表5中所示有机溶剂种类和终浓度，在反应体系中加入有机溶剂处理酯酶EstC11酶液，处理条件为室温，Tris-HCl(pH8.5)缓冲溶液中孵育3h，以未加入有机溶剂的反应体系中酯酶EstC11活力为100％作为对照，再按照4.3的测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)测定相对酶活，结果如表5所示。在体积分数10％的浓度下，绝大多数有机溶剂对酯酶EstC11有不同程度的抑制作用。在高浓度(体积分数50％)下，酯酶EstC11在正己烷中保持较高的酶活，残余酶活力为50％以上。以上结果说明该酯酶能够耐有机溶剂。

表5有机溶剂对酯酶EstC11活性的影响

实施例6：酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯

6.1 pH对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

不同pH(6.0-9.5)的反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉和50mM(±)-乙酸苏合香酯，其余为不同pH(6.0-9.5)缓冲液(见表2)；在37℃下反应2h，气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算底物对映体过量值(Enantionmeric excess，e.e.s)和得率(Yie ld，Y)，结果见图7。从图7可以看出，随着pH的升高e.e.s值不断升高，但得率不断降低，综合考虑，酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的最适pH为9.0。

公式1： 公式2：

式中：AR和AS分别表示R-乙酸苏合香酯和S-乙酸苏合香酯的峰面积，A0和A分别表示反应前和反应后R-乙酸苏合香酯的峰面积。

6.2反应温度对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉和50mM底物(±)-乙酸苏合香酯，其余为Tris-HCl(pH9.0)缓冲液；在不同温度下反应2h，手性气相色谱测定酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的立体选择性，结果见图8。从图8中可以看出，在20℃时e.e.s最高，随着温度的升高，e.e.s不断降低降低，因此酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的最适温度为20℃。

6.3有机溶剂对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉、50mM底物(±)-乙酸苏合香酯和10％(v/v)有机溶剂，其余为Tris-HCl(pH9.0)缓冲液；以未加有机溶剂为对照；在20℃下反应2h，用气相色谱手性柱检测。从表6可以看出，在10％(v/v)DMSO存在的情况下，e.e.s明显提高，而其他绝大多数有机溶剂的存在都降低了酯酶EstC11的立体选择性。

表6有机溶剂对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

6.4表面活性剂对酯酶EstC11拆分乙酸苏合香酯的影响

在优化条件下(20℃，pH9.0Tris-HCl缓冲液)，反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉、50mM底物(±)-乙酸苏合香酯和1g/L的表面活性剂(Tween-20、Tween-80、TritonX-100、三聚磷酸钠)，其余为pH9.0Tris-HCl缓冲液；以未加表面活性剂为对照；在20℃下反应2h后，样品用于气相色谱检测，结果见表7。从表7中可以看出，与对照相比，在表面活性剂存在的情况下，e.e.s和Y基本没什么变化。

表7表面活性剂对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

6.5底物浓度对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在优化条件下(20℃，pH9.0Tris-HCl缓冲液)，反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉和20-100mM底物(±)-乙酸苏合香酯，其余为pH9.0Tris-HCl缓冲液；在20℃下反应2h后，样品用于GC检测，结果见图9。从图9中可以看出，底物浓度为40mM时，e.e.s达到93％，得率为37％，而底物浓度为50mM时，e.e.s为91％，得率却达到46％。综合考虑，50mM为酯酶EstC11选择性水解(±)-乙酸苏合香酯的最适底物浓度。

6.6酶量对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在优化条件下(20℃，pH9.0Tris-HCl缓冲液)，反应体系为0.5mL，包括10-60mg/mL酯酶EstC11粗酶粉和50mM底物(±)-乙酸苏合香酯，其余为pH9.0Tris-HCl缓冲液；在20℃下反应2h后，样品用于GC检测，结果见图10。当酶量为10mg时，e.e.s达到91％，得率为45％，随酶量的增大，e.e.s基本不变。因此，20mg/mL为酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的最适酶量。

6.7反应时间对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在优化条件下(20℃，pH9.0Tris-HCl缓冲液)，反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉和50mM底物(±)-乙酸苏合香酯，其余为pH9.0Tris-HCl缓冲液；在20℃下反应，每隔一段时间取出500μL，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠除水，气相色谱手性柱检测，结果见图11。从图11中可以看出，随着反应时间的延长，e.e.s逐渐升高。反应3h后，e.e.s变化不明显，因此酯酶EstC11催化(±)-乙酸苏合香酯的最适时间是3h，最适反应条件下酯酶EstC11催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到R-乙酸苏合香酯的e.e.s为98％，得率为39％。最适条件下反应前、后的气相色谱图见图12和图13。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种酯酶EstC11及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> 嗜热芽孢杆菌CX01 (Bacillus sp. CX01)

<400> 1

atgaaacgaa cagacaaaaa gccaaaagtg acagtatatt tggccgggga ttcgaccgtc 60

gcagactgtc ccccgcatga agcgccgatg gccggctggg gacagatgct tccgctgttt 120

ttctcagatg aggctgcggt tgtgaatatg gcaaaaggcg gggccagttc gaacagcttc 180

attgatgaag gccggcttga tgacatgacg gatcggcttg cgcctggtga ttatgtgttg 240

atccagttcg gccacaacga tcaaaagccg tacggaacag agccgtatac aacctatcag 300

gagcatcttg tccgctatgt ggaagcggtt cgtgaaaaac aggcgactcc ggttttgatc 360

acttccgcag agcgcagacg ttttgatcaa aacggaaagc ccgccgacac actcggggat 420

tttccgaaag cgatgaaggc gctcgctggc agctttgaag tgccgctgat cgatttatgg 480

tccaaaacaa aagcgctcta tgaatctctc ggaatcgaag gctcaaaagg gctgtttgtc 540

cactttcagc cgaatgaaca ccctcattat ccaaatggaa tcgaagacaa tacccatttt 600

tccgaggcgg gggcccgtca agtcgccagg ctggtaacag aaggaatcag agagctcggt 660

ctgcctttag cggcttatct tcattgtgaa aggagcgatt tccgtgccgg cgtgtaa 717

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> 嗜热芽孢杆菌CX01 (Bacillus sp. CX01)

<400> 2

Met Lys Arg Thr Asp Lys Lys Pro Lys Val Thr Val Tyr Leu Ala Gly

1 5 1015

Asp Ser Thr Val Ala Asp Cys Pro Pro His Glu Ala Pro Met Ala Gly

202530

Trp Gly Gln Met Leu Pro Leu Phe Phe Ser Asp Glu Ala Ala Val Val

354045

Asn Met Ala Lys Gly Gly Ala Ser Ser Asn Ser Phe Ile Asp Glu Gly

505560

Arg Leu Asp Asp Met Thr Asp Arg Leu Ala Pro Gly Asp Tyr Val Leu

65707580

Ile Gln Phe Gly His Asn Asp Gln Lys Pro Tyr Gly Thr Glu Pro Tyr

859095

Thr Thr Tyr Gln Glu His Leu Val Arg Tyr Val Glu Ala Val Arg Glu

100 105 110

Lys Gln Ala Thr Pro Val Leu Ile Thr Ser Ala Glu Arg Arg Arg Phe

115 120 125

Asp Gln Asn Gly Lys Pro Ala Asp Thr Leu Gly Asp Phe Pro Lys Ala

130 135 140

Met Lys Ala Leu Ala Gly Ser Phe Glu Val Pro Leu Ile Asp Leu Trp

145 150 155 160

Ser Lys Thr Lys Ala Leu Tyr Glu Ser Leu Gly Ile Glu Gly Ser Lys

165 170 175

Gly Leu Phe Val His Phe Gln Pro Asn Glu His Pro His Tyr Pro Asn

180 185 190

Gly Ile Glu Asp Asn Thr His Phe Ser Glu Ala Gly Ala Arg Gln Val

195 200 205

Ala Arg Leu Val Thr Glu Gly Ile Arg Glu Leu Gly Leu Pro Leu Ala

210 215 220

Ala Tyr Leu His Cys Glu Arg Ser Asp Phe Arg Ala Gly Val

225 230 235

一种酯酶EstC11及其编码基因和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。