专利摘要

本发明提供一种降血压菜籽活性肽及其制备方法和应用。所述制备降血压菜籽活性肽的方法为用胃蛋白酶及胰酶水解菜籽蛋白液获得降血压菜籽活性肽粗提液，精制后获得降血压菜籽活性肽。本发明还提供一种采用该方法制备的降血压菜籽活性肽及其应用。本发明制备降血压菜籽活性肽的菜子粕来源广泛，生产工艺简单、成本低、环保，是适合工业化的方法。所述降血压菜籽活性肽，胃肠反应小，能够抵抗人体消化道酶的水解，以其活性形式作用于靶器官，具有较好的降血压作用。该降血压菜籽活性肽，不仅能够抑制ACE，而且能够抑制肾素活性，可以避免长期服用降血压药物ACE抑制剂激活的RAS的旁路途径，在降血压方面有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及降血压菜籽活性肽、其制备方法及应用。

背景技术

我国是世界上油菜籽产量最大的国家，年产量已近1200万吨，菜籽粕是菜籽油加工的主要副产物，占菜籽总量的65%，其中含蛋白35% ~ 42%。菜籽蛋白氨基酸组成合理，赖氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量较高，是一种优良的植物蛋白。开发利用菜籽蛋白质资源对有效利用我国的植物蛋白资源，提高我国人民的营养水平，具有重大的社会意义和良好的经济效益。

目前，我国约有2 亿高血压患者，每年仍然新增1000万人，现有的降血压药物存在以下问题：一方面，现有降血压药物长期服用会对身体造成很多的副反应，尤其是对消化道系统有很大的伤害；另外一方面，目前大多数降血压肽研究的靶标都是血管紧张素转移酶（ACE），但是，长期服用降血压药物ACE抑制剂，会激活血管紧张素系统（RAS）的旁路途径，从而影响高血压的临床治疗。而肾素抑制剂可以从源头阻断RAS系统，具有比ACE 抑制剂更多的潜在获益、更少的不良反应和更好的耐受性，并且在大型中间终点事件的研究中显示出具有靶器官保护的作用。但是，基于肾素抑制剂的降血压药物较少。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种酶法制备降血压菜籽活性肽的方法，原料来源广泛，生产工艺简单、成本低，而且变废为宝，有利于环境保护，是一种低成本、适合工业化大批量制备菜籽降血压的方法。

本发明的另一目在于：提供降血压菜籽活性肽，该菜籽活性肽胃肠反应小，能够抵抗人体消化道酶的水解，以其活性形式作用于靶器官，具有较好的降血压作用。

本发明的另一目的在于：提供降血压菜籽活性肽在制备治疗降血压药物中的应用。

本发明提供一种制备降血压菜籽活性肽的方法,包括如下步骤:

（1）以粉碎后的菜籽粕为原料，将该原料与水混合，调节pH值至1.5～2.5，温度36.5℃～37.5 ℃，搅拌分散0.5～2 h,获得菜籽蛋白液;

（2）向步骤（1）所述菜籽蛋白液中,加入胃蛋白酶,在36.5℃～37.5 ℃下水解1～3 h,获得菜籽蛋白胃蛋白酶水解液;将菜籽蛋白胃蛋白酶水解液的pH值调节至6.5.~8.0,加入胰酶, 在36.5℃～37.5 ℃下水解3-5小时,灭活其中的胃蛋白酶和胰酶,离心取上清液，得降血压菜籽活性肽粗提液;

（3）将步骤（2）所述降血压菜籽活性肽粗提液精制后获得降血压菜籽活性肽。

步骤（1）所述菜籽粕的来源是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽粕的粒径为10～200μm。

步骤（1）所述菜籽蛋白液的原料也可以是从菜籽粕中分离的蛋白质。

步骤(3)所述精制方法为: 降血压菜籽活性肽粗提液经截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，取透过液透析脱盐，冷冻干燥得降血压菜籽活性肽。

步骤(3)所述精制方法为：将降血压菜籽活性肽粗提液经反相高效液相色谱分离，分别取有机溶剂体积浓度为30%~35% 和45%~50%的两部分洗脱液，将该两部分洗脱液分别冷冻干燥，即得降血压菜籽活性肽；所述反相高效液相色谱分离的条件为：色谱柱为碳12或碳18硅胶柱；流动相为水和有机溶剂，所述有机溶剂为甲醇或乙腈，所述水和有机溶剂中均含有质量浓度为0.05～0.10%三氟乙酸，洗脱条件为：线性洗脱，流动相中的有机溶剂体积浓度从5%变化到80%。

步骤(2)所述加入的胃蛋白酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为1～10:100, 加入的胰酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为1～10:100。优选，所述加入的胃蛋白酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为5:100, 加入的胰酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为5:100。

本发明还提供一种采用上述方法制备的降血压菜籽活性肽。

本发明还提供所述降血压菜籽活性肽在制备降血压药物中的应用。

本发明的有益效果：

（1）本发明制备降血压菜籽活性肽的方法中使用的菜子粕来源广泛，生产工艺简单、成本低，而且变废为宝，有利于环境保护，是一种低成本、适合工业化大批量制备菜籽降血压的方法。

（2）本发明直接以菜籽粕为原料，模拟胃肠道消化，将胃蛋白酶和胰酶联合使用来水解菜籽粕制备的降血压菜籽活性肽，胃肠反应小，能够抵抗人体消化道酶的水解，以其活性形式作用于靶器官，具有较好的降血压作用。原因在于：胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等胃肠道蛋白酶，水解食物蛋白质可以释放出具有抗消化道酶水解能力的降血压肽；胰酶（pancreatin），又叫胰液素，是胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的混合物，具有较强的蛋白质水解能力，可以用于制备菜籽降血压肽。

（3）另外，采用两种精制方法获得的降血压菜籽活性肽，不仅能够抑制血管紧张素转移酶（ACE），而且能够抑制肾素，可以避免由于长期服用降血压药物ACE抑制剂激活的血管紧张素系统（RAS）的旁路途径，从而大大提高降压效果。 

附图说明

图1是采用反相高效液相色谱分离降血压菜籽活性肽粗提液的色谱图。

具体实施方式

本发明中使用的胃蛋白酶（Pepsin）购于Sigma 公司,货号是232-629-3，产品编号P7000；胰酶（Pancreatin）购于Sigma 公司,货号是232-468-9，产品编号P1750 。

实施例1模拟胃肠道消化、水解菜籽粕制备降血压菜籽活性肽粗提液

方法（一）

(1)将菜籽粕粉碎，通过100目筛，以粉碎后的菜籽粕为原料，按固液比1:20，将该原料与水混合，调节pH值至2.0，温度36.5℃～37.5℃，搅拌分散1h,获得菜籽蛋白液。

所述菜籽粕的来源是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽粕的粒径为10～200μm。

也可以用从菜籽粕中分离的蛋白质代替粉碎后的菜子粕制备菜籽蛋白液。

(2)按加入的胃蛋白酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为1～10:100，向菜籽蛋白液中加入胃蛋白酶，控制温度和pH值不变，水解2 h，获得菜籽蛋白胃蛋白酶水解液；将菜籽蛋白胃蛋白酶水解液调节pH值至7.0~7.5，按照加入的胰酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为1～10:100，加入胰酶，在36.5℃～37.5 ℃下继续水解4 h。反应结束后，将混合液加热至90～100 ℃，保持10 min，灭活其中的蛋白酶和胰酶，冷却至室温，10000 g离心力离心1 h取上清液，得降血压菜籽活性肽粗提液。

方法（二）

 （1）将菜籽粕粉碎，通过100目筛，以粉碎后的菜籽粕为原料，按固液比1:20，将该原料与水混合，调节pH值至2.5，温度36.5℃-37.5℃，搅拌分散2 h,获得菜籽蛋白液。

所述菜籽粕的来源是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽粕的粒径为10～200μm。

也可以用从菜籽粕中分离的蛋白质代替粉碎后的菜子粕制备菜籽蛋白液。

（2）按加入的胃蛋白酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为5:100，向菜籽蛋白液中加入胃蛋白酶，控制温度和pH值不变，水解2 h，获得菜籽蛋白胃蛋白酶水解液；将菜籽蛋白胃蛋白酶水解液调节pH值至7.0~7.5，按照加入的胰酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为5:100加入胰酶，在37 ℃下继续水解4 h。反应结束后，将混合液加热至95 ℃，保持10 min，灭活其中的蛋白酶和胰酶，冷却至室温，10000 g离心力离心1 h取上清液，得降血压菜籽活性肽粗提液。

实施例2 将降血压菜籽活性肽粗提液进行精制制备降血压菜籽活性肽

将降血压菜籽活性肽粗提液精制后获得降血压菜籽活性肽。

精制方法1：将降血压菜籽活性肽粗提液采用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，透过液(分子量小于3KDa的所有多肽)经透析脱盐，冷冻干燥得降血压菜籽活性肽，该降血压菜籽活性肽同时具有肾素抑制活性和ACE抑制活性。

ACE抑制活性检测方法如下:在比色杯中加入1 mL 0.5 mM FAPGG (全称N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl-glycine) ( 溶解在50 mM Tris-HCl 缓冲液，含 0.3 M NaCl, pH 7.5) ，20 μL ACE (1U/mL, 最终活力 20 mU) ，200 μL 降血压菜籽活性肽溶液（蛋白浓度为1mg/mL；溶剂为50 mM Tris-HCl 缓冲液，含 0.3 M NaCl, pH 7.5），混匀室温下，2 min 内测定345 nm下吸光值的降低速率.空白以 Tris–HCl 缓冲液代替样品. 根据以下公式计算ACE 抑制活性：

ACE抑制活性（%）=1-[△A.min^-1_(样品)/ △A.min^-1_(空白)]×100%，

其中，△A.min^-1_(样品) 和△A.min^-1_(空白) 分别是表示样品和空白的ACE活性抑制速率。

肾素抑制活性的检测方法如下: 降血压菜籽活性肽抑制血管紧张素活性的体外测定根据肾素活性试剂盒(购买于 Cayman Chemical，编号10006270)提供方法，按以下步骤测定：96-孔板中依次加入(1) 空白：20 μL 底物, 160 μL 测试用缓冲液, 10 μL 纯水；（2）空白对照：20 μL 底物, 150 μL 测试用缓冲液, 和10 μL 纯水；(3) 样品：20 μL 底物, 150 μL 测试用缓冲液, 和10 μL 样品。之后分别在每个孔（除空白外）中加入10 μL肾素启动反应。96-孔板室温下震荡10 s ，在37 ⁰C下预热15 min ，在10min内测定样品的荧光强度，激发波长340nm, 发射波长490nm，根据以下公式计算样品的肾素抑制活性：

，其中，100%抑制速率（空白对照）和抑制速率（样品）分别是表示空白对照和样品在10min内的肾素活性抑制速率。其中测试用缓冲液的制备：（1）配制缓冲液：50 mM Tris-HCl 缓冲液，含 0.1 M NaCl, pH 8.0；（2）将降血压菜籽活性肽溶解于该缓冲液中，制成蛋白浓度为1mg/mL 的溶液，即为测试用缓冲液。

采用上述方法制备的降血压菜籽活性肽的ACE抑制活性50.84 %、肾素抑制活性75.31 %，在降血压方面具有很好的应用前景。

精制方法2：将降血压菜籽活性肽粗提液经反相高效液相色谱分离，分别取有机溶剂体积浓度为30%~35% 和45%~50%的两部分洗脱液，将该两部分洗脱液分别冷冻干燥，即得降血压菜籽活性肽；所述反相高效液相色谱分离的条件为：色谱柱为碳12或碳18硅胶柱；流动相为水和有机溶剂，所述有机溶剂为甲醇或乙腈，所述水和有机溶剂中均含有质量浓度为0.05～0.10%三氟乙酸，洗脱条件为：线性洗脱，流动相中的有机溶剂体积浓度从5%变化到80%。

反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离时，采用紫外检测器（检测波长215 nm）。其中，组分4（有机溶剂洗脱浓度为45%~50%） ACE抑制活性达到85.91%，肾素抑制活性达到51.28%；组分6（有机溶剂洗脱浓度为45%~50%） ACE抑制活性达到89.93%，肾素抑制活性达到61.28%，可以看出采用该方法分离到的组分4和组分5均具有很高的ACE抑制活性和肾素抑制活性，在降血压方面有着很好的应用前景。

一种降血压菜籽活性肽及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。