专利摘要

本发明公开了一种五肽、以其为活性中心的多肽、环肽衍生物和化合物以及以其为活性中心的免疫抑制药物，以及其用于免疫抑制药物中的应用。本发明的五肽TIPP(thymicimmunosuppressivepentapeptide)，来源于LMW-TISE-c（低分子量牛胸腺免疫抑制提取物），它是如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列：Ala-Glu-Trp-Cys-Pro。本发明是多年来首次从胸腺免疫抑制组分中获取结构确定的成分。该五肽来源于胸腺免疫抑制提取物（TISE），本发明可用于制备免疫抑制药物。

权利要求

1.一种胸腺免疫抑制五肽，其特征在于，它是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：

Ala-Glu-Trp-Cys-Pro。

2.一种以权利要求1所述的五肽为活性中心，从其N端或C端添加L-氨基酸、D-氨基酸、羟基氨基酸、甲基化氨基酸或杂环氨基酸中的一个或多个得到的多肽。

3.一种由权利要求1～2所述的五肽的N端和C端连接成环得到的环肽衍生物。

4.一种由权利要求1～2所述的五肽的N端经乙酰化、甲酰化、烷基化或C端经氨酰化、酯化得到的化合物。

5.一种免疫抑制药物，其特征在于，其活性成分包括权利要求1所述的五肽、权利要求2所述的多肽、权利要求3所述的环肽衍生物或权利要求4所述的化合物。

6.权利要求1所述的五肽、权利要求2所述的多肽、权利要求3所述的环肽衍生物或权利要求4所述的化合物在制备免疫抑制药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种五肽、以其为活性中心的多肽、环肽衍生物和化合物以及以其为活性中心的免疫抑制药物，以及其用于免疫抑制药物中的应用。

背景技术

胸腺是哺乳动物重要的中枢免疫器官。胸腺除了提供一个T细胞发育所需的细胞微环境外，还产生多种多肽激素，这些激素影响T细胞的分化和成熟，也有调节成熟T细胞功能的作用，对机体免疫学功能的发挥具有重要意义。目前，国内外对胸腺中增强机体免疫能力的提取物或因子已有较深刻的认识和研究，如胸腺素和胸腺五肽，但对胸腺中免疫抑制作用的因子研究报道较少。

1960年，Bullough及Laurence自上皮细胞分离得到了一种上皮细胞分裂的抑制物质，并提出了抑素(Chalone)的概念。抑素是一类内源性的细胞生长抑制因子。自20世纪70年代，人们陆续从牛、猪和人胚胸腺中提得了抑制淋巴细胞分裂的抑素样物质，研究表明其有免疫抑制活性且无细胞毒性。国外研究胸腺来源具有免疫抑制功能的物质主要是指抑素样物质。因从胸腺中提取得到的抑素样物质均为未知混合物，研究者对其的成分及性质进行了研究。Houck等曾分离出分子量为30kD～50kD的免疫抑制物，含有核酸，具有热敏感性，后来，他们将其经核糖核酸酶水解后超滤，回收具有免疫抑制活性的组分并推测抑素为分子量在5kD左右的荷正电的糖肽。法国的Kiger等通过凝胶过滤和离子交换层析制得淋巴细胞抑制因子，经分析推测其可能为一种具有热稳定性、结合于核苷酸的碱性多肽。Allen等认为淋巴细胞抑制因子的生物活性物质为精胺，分子量只有202D，在提取物中与一种组织特异性物质结合成紧密的精胺复合物而显示特异的免疫抑制活性。Rijke等发现淋巴细胞抑制因子是精胺与蛋白质结合的复合物，在淋巴细胞转化抑制试验中，真正起抑制作用的是精胺，但在以精胺为对照的研究中发现它并不能抑制淋巴细胞转化。Patt等证明淋巴细胞转化抑制因子为分子量500D～600D、疏水、酸性、含有巯基的肽。Blazsek证明淋巴细胞转化的抑制物为pI5.9的组分，加热、加入蛋白质变性剂（4mol/L去离子脲）或蛋白酶，都能使其活性受到破坏，但用核糖核酸酶消化对其活性没有影响。虽然早期研究者对胸腺来源的免疫抑制物的性质进行了研究，但近来对其的研究未见报道，也未见自其中发现结构明确的单一化合物。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种五肽、以其为活性中心的多肽、环肽衍生物和化合物以及以其为活性中心的免疫抑制药物，以及其用于免疫抑制药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种胸腺免疫抑制五肽TIPP(thymic immunosuppressive pentapeptide)，来源于LMW-TISE-c（低分子量牛胸腺免疫抑制提取物），它是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：

Ala-Glu-Trp-Cys-Pro。

以所述五肽为活性中心，从其N端或C端添加L-氨基酸、D-氨基酸、羟基氨基酸、甲基化氨基酸或杂环氨基酸中的一个或多个得到的多肽。

所述杂环氨基酸为色氨酸、组氨酸或脯氨酸。

所述五肽的N端和C端连接成环得到的环肽衍生物。

所述五肽的N端经乙酰化、甲酰化、烷基化或C端经氨酰化或酯化得到的化合物，较所述五肽的生物活性、半衰期、稳定性等有了很大提高。

所述烷基化为甲基化、乙基化、丙基化或丁基化。

所述酯化为与甲醇、乙醇、丁醇或己醇酯化反应。

一种免疫抑制药物，其活性成分包括上述五肽、多肽、环肽衍生物或化合物在制备免疫抑制药物中的应用。

上述五肽、多肽、环肽衍生物或化合物在制备免疫抑制药物中的应用。

本发明的五肽可采用现有技术中的公知方法获得。既可以用多肽自动合成仪进行化学合成，又可以将短肽序列推导成核苷酸序列，然后克隆到表达载体中进行生物合成。

本发明提供了一种免疫抑制药物，其活性成分包括所述的五肽、以其为活性中心的多肽、环肽衍生物和化合物。上述免疫抑制药物中还可含有一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。本发明的免疫抑制药物可以制成注射剂、粉针剂、吸入剂、片剂、粉剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明还提供了所述五肽、以其为活性中心的多肽、环肽衍生物和化合物在制备免疫抑制药物中的应用。

特别是，所述五肽在制备用于自身免疫性疾病、器官移植、变态反应性疾病以及炎症性疾病的药物中的应用。

山东医科大学（现山东大学）药学院于20世纪80年代中期进行胸腺素开发研究时发现，用酸性提取方法制备的胸腺免疫抑制药物以免疫促进活性为主，而用碱性提取方法制备的胸腺制剂以免疫抑制活性为主。因制备方法与已报道的胸腺来源的免疫抑制药物的不同，申请人将用碱性提取法制备的提取物命名为胸腺免疫抑制提取物（thymic immunosuppressive extract,TISE）。通过对TISE的生物活性和药理作用及不同动物胸腺来源的TISE活性的异同的研究发现，TISE对细胞免疫和体液免疫均有抑制作用，对非特异性免疫功能也有抑制作用，可以有效地抑制皮肤移植的排斥反应，还有抗I型变态反应和III型变态反应的作用，且TISE的活性没有种属特异性。这提示申请人TISE作为一种新型的免疫抑制药物的可能性。

本发明的有益效果是：

为减少异种来源的TISE用于人体引起过敏反应的可能，运用超滤技术，将小牛胸腺来源的TISE（TISE-c）制备成了分子量较小、且生物活性较强的低分子量TISE-c（Low Molecular Weight TISE-c，LMW-TISE-c）。在此基础上，进一步采用微球菌核酸酶降解LMW-TISE-c及RP-HPLC分离，结合酸水解，最终纯化出一个分子量为604.95D的由5个氨基酸残基组成的多肽，其结构为N′-AEWCP-C′（Ala-Glu-Trp-Cys-Pro）。本发明是多年来首次从胸腺免疫抑制组分中获取结构确定的成分。该五肽来源于TISE，基于之前对TISE的活性研究，本发明可用于制备免疫抑制药物。

附图说明

图1为不同药物浓度对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用。##表示与空白组相比，p<0.01，有显著性差异；**表示与Con A组相比，p<0.01，有显著性差异。

图2为不同药物浓度对LPS刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用。##表示与空白组相比，p<0.01，有显著性差异；**表示与Con A组相比，p<0.01，有显著性差异。

图3为不同浓度药物对小鼠脾淋巴细胞的毒性。

图4为不同药物浓度对RAW264.7细胞的活力的影响。**表示与空白组相比，p<0.01，有显著性差异。

图5为不同浓度药物对LPS刺激的RAW264.7细胞吞噬作用的影响。#表示与空白组相比，p<0.05，有差异，##表示与空白组相比，p＜0.01，有显著性差异；*表示与模型组相比，p＜0.05，有差异，**表示与模型组相比，p＜0.01，有显著性差异。

图6为不同浓度药物在卵清蛋白（OVA）诱导的小鼠哮喘模型中肺组织学影响（HE染色）；a.空白组（×100），b.模型组（×100），c.地塞米松（Dex）（×100），d.TIPP10mg/kg（×100），e.TIPP50mg/kg（×100）。

图7为不同浓度药物对OVA诱导的小鼠哮喘模型肺泡灌洗液中IL-5含量的影响。#表示与空白组相比，p<0.05，有差异，##表示与空白组相比，p＜0.01，有显著性差异；*表示与模型组相比，p＜0.05，有差异，**表示与模型组相比，p＜0.01，有显著性差异。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

一种胸腺免疫抑制五肽TIPP(thymic immunosuppressive pentapeptide)，来源于LMW-TISE-c（低分子量牛胸腺免疫抑制提取物），它是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：

Ala-Glu-Trp-Cys-Pro。

以所述五肽为活性中心，从其N端或C端添加L-氨基酸、D-氨基酸、羟基氨基酸、甲基化氨基酸或杂环氨基酸中的一个或多个得到的多肽。

所述杂环氨基酸为色氨酸、组氨酸或脯氨酸。

所述五肽的N端和C端连接成环得到的环肽衍生物。

所述五肽的N端经乙酰化、甲酰化或C端经氨酰化或酯化得到的化合物，较所述五肽的生物活性、半衰期、稳定性等有了很大提高。

所述烷基化为甲基化、乙基化、丙基化或丁基化。

所述酯化为与甲醇、乙醇、丁醇、或己醇酯化反应。

一种免疫抑制药物，其活性成分包括上述五肽、多肽、环肽衍生物或化合物在制备免疫抑制药物中的应用。

上述五肽、多肽、环肽衍生物或化合物在制备免疫抑制药物中的应用。

实施例1不同浓度TIPP对小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用

6～8周雄性Balb/c小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5min，取出小鼠置于无菌皿，左腹侧朝上。在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏。在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入培养皿中，用Hank’s液5mL冲洗两次。将脾脏放置不锈钢网（200目）上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，并用Hank’s液7-8mL冲洗，收集细胞悬液于10mL无菌离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，加红细胞裂解液8mL充分打匀，静置5min，1000r/min离心10min，弃上清，再用Hank’s液8mL洗一次。最终用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清）5mL重悬细胞，计数，调整细胞浓度为2×10⁶个/mL。接种于96孔板，100μL/孔，并设调零孔。分别用刀豆蛋白Con A（终浓度5μg/mL）及脂多糖（LPS，终浓度10μg/mL）刺激细胞使其增殖。分组情况为：空白组、单纯Con A或LPS刺激组、环孢菌素A（CsA）对照组（Con A或LPS刺激，CsA浓度为0.1μmol/L）、不同浓度TIPP作用组（Con A或LPS刺激，TIPP终浓度分别为50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L），每组设5个复孔。37℃，5%CO₂培养68h后，每孔加5mg/mLMTT20μL，于37℃、5%CO₂条件下继续培养4h后，3000r/min离心10min，上清用1mL注射器小心吸除，每孔加DMSO150μL，震荡10min，酶标仪570nm检测OD值，以630nm为参考波长。

结果如图1、图2所示，Con A和LPS可以引起脾淋巴细胞的显著增殖；而CsA作为T细胞的一种强效抑制剂可以显著抑制由Con A引起的脾淋巴细胞的增殖而对LPS引起的脾淋巴细胞的增殖无明显作用；TIPP对Con A及LPS诱导的脾淋巴细胞的增殖均表现出抑制作用，并呈剂量依赖性，且对Con A引起的脾淋巴细胞增殖的抑制作用更明显。

实施例2不同浓度药物对小鼠脾淋巴细胞的毒性

6～8周雄性Balb/c小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5min，取出小鼠置于无菌皿，左腹侧朝上。在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏。在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入培养皿中，用Hank’s液5mL冲洗两次。将脾脏放置不锈钢网（200目）上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，并用Hank’s液7-8mL冲洗，收集细胞悬液于10mL无菌离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，加红细胞裂解液8mL充分打匀，静置5min，1000r/min离心10min，弃上清，再用Hank’s液8mL洗一次。最终用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清）5mL重悬细胞，计数，调整细胞浓度为1×10⁸个/mL，接种于96孔板，100μL/孔，并设调零孔。加入不同浓度TIPP，每个浓度设5个复孔。各浓度依次为：0、0.0064μmol/L、0.032μmol/L、0.16μmol/L、0.8μmol/L、4μmol/L、20μmol/L、100μmol/L、500μmol/L。37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养68h。加5mg/mL MTT20μL，于37℃、5%CO₂继续培养4h后3000r/min离心10min，上清用1mL注射器小心吸除，每孔加DMSO150μL，震荡10min，酶标仪570nm检测OD值，以630nm为参考波长。存活率=（试验组OD570nm/正常组OD570nm）×100%。

结果如图3所示，脾淋巴细胞与TIPP共培养68h后，存活率与未加TIPP组相比无明显差别，即TIPP对脾淋巴细胞无明显的细胞毒性。

实施例3不同浓度TIPP对RAW264.7细胞增殖的抑制作用

取DMEM培养基（10%FBS）培养的对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为2×10⁴个/mL，接种于96孔板上，每孔体积100μL,置于37℃、5%CO₂条件下培养2h使细胞贴壁，加入不同浓度的TIPP（终浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL，每个浓度设5个复孔），以地塞米松（Dex，终浓度为5μg/mL）为阳性对照，继续培养48h。每孔加5mg/mL MTT20μL，于37℃、5%CO₂条件下继续培养4h后，3000r/m离心10min，上清用1mL注射器小心吸除，每孔加DMSO150μL，震荡10min，酶标仪570nm检测OD值，以630nm为参考波长。

结果如图4所示。TIPP在浓度低于50μg/mL时，对RAW264.7细胞增殖抑制较小；而在100μg/mL及以上时对RAW264.7细胞增殖抑制作用明显。根据细胞毒性分级表所示，当细胞相对增值率在大于100%或在75%～99%时，其细胞毒性分级为0级或1级，被认为没有细胞毒性，当细胞相对增值率在50%～74%时，其细胞毒性分级为2级，有轻度毒性。由图4可得，在TIPP浓度为200μg/mL时，细胞活力仍达到约85%，可以认为TIPP在浓度≦200μg/mL时对RAW264.7没有细胞毒性；但TIPP400μg/mL时，细胞毒性达到2级,有轻度毒性。

实施例4不同浓度药物对LPS刺激的RAW264.7细胞吞噬作用的影响

取对数生长期的RAW264.7细胞，接种于96孔板上，每孔加细胞悬液（2×10⁵个/mL）100μL，置37℃、5％CO₂培养箱过夜培养，弃上清液，换用2.5%FBS的DMEM培养液，100μL/孔。分组，空白对照组：加入2.5%FBS的DMEM培养液100μL；模型组：加入LPS，使其终浓度为1μg/mL；Dex组：加入Dex（终浓度是5μg/mL）和LPS（终浓度为1μg/mL）；给药组：TIPP（终浓度分别为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL）和LPS（终浓度为1μg/mL）各50μL，每组均设5个复孔。37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，弃上清液，加入0.1％中性红溶液100μL，37℃、5％CO₂孵育1h，弃中性红，用预温的PBS洗3遍，每次200μL，并扣干。加入醋酸-乙醇（体积比1：1）细胞溶解液200μL/孔，4℃静置过夜，酶标仪490nm处测OD值。

结果如图5所示。与空白组相比，LPS组OD值与空白组相比有显著性差异，表明LPS可以增强RAW264.7细胞的吞噬作用。与LPS组相比，Dex组及50、100、200、400μg/mL的TIPP均能抑制LPS刺激的RAW264.7吞噬中性红的活性，且在TIPP浓度为100μg/mL时OD值与空白组水平相当，表明TIPP浓度为100μg/mL时就可完全抑制因LPS诱导的巨噬细胞的吞噬作用。

实施例5TIPP对OVA诱导的小鼠哮喘模型的作用

SPF级雌性Balb/c小鼠，5-6周，随机分成6组，每组12只，分别为空白组、模型组、地塞米松对照组（3mg/kg）、TIPP低剂量组（2mg/kg）、TIPP中剂量组（10mg/kg）、TIPP高剂量组（50mg/kg）。同一条件饲养，模型组及给药组于1、7、14天腹腔注射（i.p）含50μg OVA（sigma，Grade V）的Alu-Gel-S（SERVA Electrophoresis GmbH）0.2mL，空白组i.p生理盐水。从第28天开始，模型组及给药组用2mg/mL的OVA溶液50μL滴鼻激发，空白组用生理盐水滴鼻。滴鼻前1h，空白组皮下注射（i.h）生理盐水，模型组i.h生理盐水,地塞米松组i.h地塞米松(Dex，3mg/kg)，TIPP低、中、高剂量组分别i.h TIPP2mg/kg、10mg/kg、50mg/kg。滴鼻时，用乙醚麻醉小鼠至抓起小鼠其身体无力下垂，用生理盐水50μL或2mg/mL的OVA溶液50μL滴鼻，使溶液随小鼠自然呼吸吸入。在第29、30、31、32、33天重复滴鼻激发，建立小鼠哮喘模型。末次激发后24-48h内取材。拉颈处死小鼠，仰卧位固定，75%乙醇消毒颈部皮肤，打开胸腔行气管插管。结扎左肺，右肺用冷的PBS0.4mL进行肺泡灌洗，确保肺均匀的膨胀，每次缓慢注入后再缓慢回抽以回收灌洗液于1.5mLEP管中，重复2次，确保回收率达到80%～90%。4℃、650×g离心5min。取上清分装，-80℃保存，用于细胞因子检测。取左肺，用4%甲醛溶液固定，切片，HE染色。

结果如图6、图7所示。对各组小鼠肺组织切片进行HE染色，与正常组相比，模型组黏膜充血水肿，黏膜层增厚，并有炎性细胞浸润，管腔内充满大量黏液、支气管壁周围有炎症细胞浸润。而Dex及TIPP给药组炎症明显减轻，支气管壁周围仅有少量炎性细胞浸润。表明Dex及TIPP可抑制哮喘小鼠气道炎症，抑制炎性细胞在气道的浸润。

图7为TIPP对哮喘小鼠肺泡灌洗液中IL-5水平的影响。IL-5是Th2类细胞因子，与哮喘的发生发展密切相关，它可促进嗜酸性粒细胞分化、成活和募集至气道并辅助B淋巴细胞产生抗体。由图7可以看出，与空白组相比，模型组IL-5水平明显升高，而Dex和TIPP均可明显降低肺泡灌洗液中IL-5的水平。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

一种五肽、多肽、环肽衍生物、化合物及其药物和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。