专利摘要

本发明涉及一种丝肽、制备方法和应用，该丝肽分子量为600-5500Da，其中丝肽分子量2000-4000Da的部分占60-85%。系用CaCl2-H2O-C2H5OH溶液溶解丝素成均相溶液，随后加入酸或碱控制性降解，获得目标分子量丝肽，经电渗析脱杂离子获得丝肽溶液，经干燥即可获得丝肽粉。电渗析浓水箱中的盐溶液可浓缩干燥得到回收的氯化钙，该氯化钙可套用溶解丝素。该丝肽可以用于缓释药物的包覆骨架材料。

权利要求

1.一种丝肽，其特征是所述的丝肽分子量分布在600-5500Da范围内。 

2.如权利要求1所述的丝肽，其特征是所述的丝肽中分子量2000-4000Da部分占60-85%。 

3.如强烈要求1所述的丝肽，其特征是丝肽中总杂离子含量小于1%。 

4.一种如权利要求1所述的丝肽的制备方法，其特征是通过如下的步骤1）、2）和4），或者1）、3）和4）二种方法获得： 

步骤序列一： 

1）取脱胶丝素加入50~80℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中搅拌溶解，丝素与CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液的质量体积比为20-200克/升，CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中氯化钙、水、乙醇质量体积比为111g：100-200ml：70-120ml； 

2）将无机酸加入到步骤1）获得的丝素混悬液中，60-90℃加热反应30分钟至4小时，得到浅黄色溶液，每升丝素溶液的加入0.1-2mol无机酸； 

3）将无机碱溶液滴加到步骤1）的丝素混悬液中，60-90℃加热反应30分钟至4小时，得到浅黄色悬浊液，每升丝素溶液的加入含0.2-3mol无机碱的水溶液，碱溶液的浓度0.5-4.5摩尔/升；悬浊液滤纸过滤可得到浅黄色清液。 

4）将步骤2）或3）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，溶液再经过干燥得到丝肽。 

5.一种如权利要求4所述的方法，其特征是步骤1）中所述的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中的CaCl₂系采用步骤4）电渗析除杂后的电渗析的浓水箱中的溶液经浓缩干燥得到回收的氯化钙。 

6.如权利要求4所述的方法，其特征是：所述步骤2）中的无机酸是磷酸、硝酸、盐酸或硫酸。 

7.如权利要求4所述的方法，其特征是：所述步骤3）中的无机碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氨水或氢氧化钙。 

8.如权利要求4所述的方法，其特征是：所述步骤4）是将2）或3）获得的溶液作为料液，循环至料液电导率降至10-500us/cm。 

9.如权利要求1所述的丝肽的用途，其特征是所述的丝肽用于控缓释药物的骨架包覆材料。 

说明书

发明领域

本发明是一种丝肽、制备方法和应用。该水溶性丝肽分子量为600-5500Da，其中丝肽中分子量2000-4000Da的部分占60-85%。 

技术背景

蚕丝是蚕在结茧时所分泌出的液体凝固而成的一种天然纤维，主要是由两条丝素链和外面覆盖的丝胶两部分所组成，丝肽是丝素蛋白的降解产物，控制水解条件不同，可得到不同分子量的丝肽产品。丝肽具有降低胆固醇、降血糖、抑制皮肤黑色素生成等作用，具有良好的护肤保湿和护发作用。 

现有丝肽生产工艺耗水量大、含钙废水量大、污染严重、丝肽分子量不可控，获得的丝肽分子量从数百到数万不等。 

发明内容

本发明提供一种丝肽、制备方法和用于缓释药物的包覆骨架材料。 

针对丝肽分子量分布和生产中的三废污染等问题，提供了一种丝肽和低污染低能耗的丝肽制备方法。采用本方法可规模化生产质量稳定可控的丝肽（粉），该丝肽的分子量集中分布在600-5500Da，，其中分子量2000-4000Da部分占60%-85%。该丝肽可以用于缓释药物的包覆骨架材料。 

本发明的丝肽（粉）总杂离子含量小于1%。 

本发明的目的是通过下述技术方案实现的： 

CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液加入下溶解丝素成均相溶液，滴加酸或碱控制性降解丝素获得目标分子量丝肽，丝肽盐溶液置于电渗析器中，通过加载电流，驱动无机离子通过阴阳分离膜，达到脱盐效果，脱盐的丝肽溶液直接干燥即可获得丝肽，电渗析器浓水箱中的盐溶液可回收套用。 

具体方法通过如下的步骤1）、2）和4），或者1）、3）和4）二种方法获得： 

1）取脱胶丝素加入50~80℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中搅拌溶解，丝素与CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液的质量体积比为20-200克/升，CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中氯化钙、水、乙醇质量体积比为111g：100-200ml：70-120ml； 

2）将无机酸加入到步骤1）获得的丝素混悬液中，60-90℃加热反应30分钟至4小时，得到浅黄色溶液，每升丝素溶液的加入0.1-2mol无机酸； 

3）将无机碱溶液滴加到步骤1）的丝素混悬液中，60-90℃加热反应30分钟至4小时，得到浅黄色悬浊液，每升丝素溶液的加入含0.2-3mol无机碱的水溶液，碱溶液的浓度0.5-4.5摩尔/升；悬浊液滤纸过滤可得到浅黄色溶液。 

4）将步骤2）或3）得到的浅黄色溶液用常规的电渗析器除杂离子，料液干燥得到丝肽。建议将步骤2）或3）获得的溶液作为料液循环至料液电导率降至10-500us/cm。 

所述的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中的CaCl₂可以采用步骤4）中电渗析除杂后的电渗析的浓水箱中溶液经过浓缩干燥得到回收的氯化钙。 

上述的方法可以进一步描述如下： 

方法一： 

（1）取脱胶丝素加入50~80℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中搅拌溶解，丝素与CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液的质量体积比为20-200克/升，CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中氯化钙、水、乙醇质量体积比为111g：100-200ml：70-120ml。 

（2）将无机酸滴加到步骤（1）的丝素混悬液中，60-90℃油浴加热反应30分钟至4小时，得到浅黄色溶液，每升丝素溶液加入0.1-2mol无机酸。 

（3）将步骤（2）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，以步骤（2）的浅黄色溶液为料液循环至料液电导率降至10-500us/cm，得到料液干燥得到丝肽。 

方法二： 

（1）取脱胶丝素加入50~80℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中搅拌溶解，丝素与CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液的质量体积比为20-200克/升，CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中氯化钙、水、乙醇质量体积比为111g：100-200ml：70-120ml。 

（2）将无机碱的水溶液滴加到步骤（1）的丝素混悬液中，60-90℃油浴加热反应30分钟至4小时，得到浅黄色悬浊液体，每升丝素溶液加入含0.2-3mol碱的水溶液，碱溶液的浓度为0.5-4.5摩尔/升。悬浊液用滤纸过滤可得到浅黄色清液。 

（3）将步骤（2）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，以步骤（2）的浅黄色溶液为，得到料液干燥得到丝肽。 

方法三： 

（1）将方法一步骤（3）中电渗析后浓水箱中溶液浓缩干燥得到回收的氯化钙，取脱胶丝素加入50~80℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中搅拌溶解，丝素与CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液的质量体积比为20-200克/升，CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中回 收氯化钙、水、乙醇质量体积比为111g：70-180ml：50-100ml。 

（2）将无机酸滴加到步骤（1）的丝素混悬液中，60-90℃油浴加热反应30分钟至4小时，得到浅黄色溶液，每升丝素溶液加入0.1-2mol无机酸。 

（3）将步骤（2）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，以步骤（2）的浅黄色溶液为料液循环至料液电导率降至10-500us/cm，得到料液干燥得到水溶性丝肽。 

方法四： 

（1）将方法三步骤（3）中电渗析后浓水箱中溶液浓缩干燥得到回收的氯化钙，取脱胶丝素加入50~80℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中搅拌溶解，丝素与CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液的质量体积比为20-200克/升，CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH溶液中回收氯化钙、水、无水乙醇质量体积比为111g：70-180ml：50-100ml。 

（2）将无机碱溶液滴加到步骤（1）的丝素混悬液中，60-90℃油浴加热反应30分钟至4小时，得到浅黄色悬浊液，每升丝素溶液加入含0.2-3mol碱的水溶液，碱溶液的浓度为0.5-4.5摩尔/升。悬浊液用滤纸过滤可得到浅黄色清液。 

（3）将步骤（2）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，以步骤（2）的浅黄色溶液为料液循环至料液电导率降至10-500us/cm，得到料液干燥得到水溶性丝肽。 

上述的所述的酸为无机酸，如磷酸、硝酸、盐酸或硫酸等。 

上述的碱为无机碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、氨水或氢氧化钙。 

上述的电渗析器为分离膜的膜对数、流量和工作电压根据处理料液规模匹配。 

采用本方法得到的丝肽分子量分布均匀，采用高效液相色谱，TSKgelG3000PWXL柱分离，水为流动相，测得丝肽在色谱柱上保留时间，带入保留时间和分子量对数标准分子量曲线计算，获得的丝肽分子量主要分布在 600-5500Da，其中分子量2000-4000Da部分占60-85%，如附图1-6所示。 

本方法得到的丝肽产品分子量分布均匀、水溶性好。 

本发明制备丝肽的方法简单可以大规模工艺化生产，质量可控，生产能耗小，生产成本低，氯化钙废水可回收套用，基本无三废排放。 

本方法与过去制备方法显著不同的是，在本发明中，丝素溶解和水解连续化操作，中间无穿插脱盐步骤，丝素水解是在均相溶液中，水解度均匀，电渗析脱盐可回收溶解丝素的氯化钙实现回收套用，减少废液排放。通过本工艺制备的丝肽可将分子量控制于600-5500Da之间，可用于缓释药物的包覆骨架材料，以其为骨架材料配方可达到药物缓释效果。 

附图说明

图1：本发明实施例1制备的丝肽的凝胶色谱高效液相图谱 

图2：本发明实施例2制备的丝肽的凝胶色谱高效液相图谱 

图3：本发明实施例3制备的丝肽的凝胶色谱高效液相图谱 

图4：本发明实施例4制备的丝肽的凝胶色谱高效液相图谱 

图5：本发明实施例5制备的丝肽的凝胶色谱高效液相图谱 

图6：本发明实施例8制备的丝肽的凝胶色谱高效液相图谱 

具体实施方式

通过下述实施例可以进一步理解本发明，但是不能限制本发明的内容。 

实施例中采用的电渗析器为市场销售的QQ-DM-1*2/40特种电驱动膜分离器， 其含有QQ-HeM-HG005分离膜，该分离器中有40对的分离膜。也可以采用市售的其它工业化的电渗析脱盐装置。 

实施例1 

（1）取20克脱胶丝素加入50℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH（333克：600ml：360ml）溶液中搅拌溶解，搅拌至丝素完全溶解。 

（2）将10ml浓盐酸滴加到步骤（1）的丝素混悬液中，90℃油浴加热反应4小时，得到浅黄色溶液。 

（3）将步骤（2）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压10V，，溶液流速30L/h，料液循环至料液电导率降至10us/cm，完成脱盐的溶液干燥得到丝肽。丝肽经高效液相检测其分子量主要分布为850-2760Da，其中分子量2000-4000Da部分占60%。经氨基酸组成分析，其氨基酸组成如下表1所示，按照国标GB 5009.4—2010方法测得丝肽中灰分为0.42%。 

表1丝肽氨基酸组成 

实施例2 

（1）取40克脱胶丝素加入80℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH（111克：100ml：70ml）溶 液中搅拌溶解，搅拌至丝素完全溶解。 

（2）将28ml浓硝酸滴加到步骤（1）的丝素混悬液中，60℃油浴加热反应30分钟，得到浅黄色溶液。 

（3）将步骤（2）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压50V，，溶液流速80L/h，料液循环至料液电导率降至500us/cm，完成脱盐的溶液干燥得到丝肽。丝肽经高效液相检测其分子量主要分布为670-5290Da，其中分子量2000-4000Da部分占79%。 

实施例3 

（1）取20克脱胶丝素加入50℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH（333克：600ml：360ml）溶液中搅拌溶解，搅拌至丝素完全溶解。 

（2）将8克氢氧化钠配成0.5摩尔/升的水溶液滴加于步骤（1）的丝素混悬液中，90℃油浴加热反应4小时，得到浅黄色悬浊液体，悬浊液用滤纸过滤可得浅黄色溶液。 

（3）将步骤（2）的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压40V，，溶液流速60L/h，料液循环至料液电导率降至100us/cm，完成脱盐的溶液干燥得到丝肽。丝肽经高效液相检测其分子量主要分布为1530-5130Da，其中分子量2000-4000Da部分占85%。 

实施例4 

（1）取40克脱胶丝素加入80℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH（111克：100ml：70ml）溶液中搅拌溶解，搅拌至丝素完全溶解。 

（2）将34克氢氧化钾配成4.5摩尔/升的水溶液滴加于加入步骤（1）的丝素混悬液中，60℃油浴加热反应30分钟，得到浅黄色悬浊液体，悬浊液用滤纸过滤可得 浅黄色溶液。 

（3）将步骤（2）的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压20V，，溶液流速60L/h，料液循环至料液电导率降至200us/cm，完成脱盐的溶液干燥得到丝肽。丝肽经高效液相检测其分子量主要分布为650-4890Da，其中分子量2000-4000Da部分占78%。 

实施例5 

（1）取20克脱胶丝素加入50℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH（333克：600ml：360ml）溶液中搅拌溶解，搅拌至丝素完全溶解。 

（2）将10ml浓盐酸滴加到步骤（1）的丝素混悬液中，90℃油浴加热反应4小时，得到浅黄色溶液。 

（3）将步骤（2）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压50V，，溶液流速60L/h，料液循环至料液电导率降至100us/cm，完成脱盐后电渗析器浓水箱中溶液干燥得到回收的氯化钙。 

（4）将步骤（3）回收的氯化钙按照111克：水180ml：无水乙醇100ml的比例配成CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH，将其加热至50℃，向其中加入7克脱胶丝素可搅拌溶解，向其中滴加3ml浓盐酸，60℃油浴加热反应4小时，得到浅黄色溶液。 

（5）将步骤（4）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压50V，，溶液流速60L/h，料液循环至电导率降至100us/cm，完成脱盐的溶液干燥得到丝肽。丝肽经高效液相检测其分子量主要分布为860-2910Da，其中分子量2000-4000Da部分占79%。 

实施例6 

（1）取40克脱胶丝素加入50℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH（111克：100ml：70ml）溶液中搅拌溶解，搅拌至丝素完全溶解。 

（2）将33ml浓盐酸滴加到步骤（1）的丝素混悬液中，60℃油浴加热反应30分钟，得到浅黄色溶液。 

（3）将步骤（2）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压50V，，溶液流速60L/h，料液循环至电导率降至200us/cm，完成脱盐后电渗析器浓水箱中溶液干燥得到回收的氯化钙。 

（4）将步骤（3）回收的氯化钙按照111克：水70ml：无水乙醇50ml的比例配成CaCl2-H2O-C2H5OH，将其加热至80℃，向其中加入25克脱胶丝素可搅拌溶解，向其中滴加21ml浓盐酸，60℃油浴加热反应30分钟，得到浅黄色溶液明液体。 

（5）将步骤（4）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压50V，，溶液流速60L/h，料液循环至电导率降至100us/cm，完成脱盐的溶液干燥得到丝肽。 

实施例7 

（1）取20克脱胶丝素加入50℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH（333克：600ml：360ml）溶液中搅拌溶解，搅拌至丝素完全溶解。 

（2）将8克氢氧化钠配成1摩尔/升的水溶液滴加于加入步骤（1）的丝素混悬液中，90℃油浴加热反应4小时，得到浅黄色悬浊液体，悬浊液用滤纸过滤可得到浅黄色溶液。 

（3）将步骤（2）的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压40V，，溶液流速50L/h，料液循环至电导率降至300us/cm，完成脱盐后电渗析器浓水箱中溶 液干燥得到回收的氯化钙。 

（4）将步骤（3）回收的氯化钙按照111克：水70ml：无水乙醇50ml的比例配成CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH，将其加热至80℃，向其中加入25克脱胶丝素可搅拌溶解，向其中加入32克氢氧化钠配成的3摩尔/升的水溶液，60℃油浴加热反应30分钟，得到浅黄色悬浊液体，悬浊液用滤纸过滤可得到浅黄色溶液。 

（5）将步骤（4）得到的溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压30V，，溶液流速80L/h，料液循环至电导率降至200us/cm，完成脱盐的溶液干燥得到丝肽。 

实施例8 

（1）取40克脱胶丝素加入50℃的CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH（111克：100ml：70ml）溶液中搅拌溶解，搅拌至丝素完全溶解。 

（2）将34克氢氧化钾配成2M的水溶液滴加于加入步骤（1）的丝素混悬液中，60℃油浴加热反应30分钟，得到浅黄色悬浊液体，悬浊液用滤纸过滤可得到浅黄色溶液。 

（3）将步骤（2）的浅黄色水溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压40V，，溶液流速70L/h，料液循环至电导率降至100us/cm，完成脱盐后电渗析器浓水箱中溶液干燥得到回收的氯化钙。 

（4）将步骤（3）回收的氯化钙按照111克：水180ml：无水乙醇100ml的比例配成CaCl₂-H₂O-C₂H₅OH，将其加热至50℃，向其中加入7克脱胶丝素可搅拌溶解，向其中加入3克氢氧化钠配成的1摩尔/升的水溶液，60℃油浴加热反应4小时，得到浅黄悬浊液体。悬浊液用滤纸过滤可得到浅黄色溶液。 

（5）将步骤（4）得到的浅黄色溶液用电渗析器除杂离子，电渗析器工作电压 50V，，溶液流速30L/h，料液循环至电导率降至100us/cm，完成脱盐的料液干燥得到丝肽。丝肽经高效液相检测其分子量主要分布为1050-2800Da，其中分子量2000-4000Da部分占76%。 

实施例9 

参照中国药典2010版（二部）附录XD释放度测定法第一法，以为采用HPMCKIOOM 15%，丝肽22%为缓释制剂的骨架材料，并分别以MCC或Lactose为稀释剂制备盐酸地尔硫卓缓释片剂，将自制片剂与市售缓释制剂做累积释放度比较，数据见表2： 

表2自制片剂与市售制剂累积释放度结果 

丝肽、制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。