专利摘要

一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法及利用该原细胞模型模拟生物细胞新陈代谢的方法。本发明属于原细胞模拟和仿生材料制备领域，具体涉及一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法及利用该原细胞模型模拟生物细胞新陈代谢的方法。本发明是为了解决现有原细胞模型不能模拟原细胞新陈代谢功能的问题。方法：利用Pickering微乳液的方法，直接利用脂肪酶充当表面活性剂，构建起水包油的微乳液，从而制得基于脂肪酶的原细胞模型，通过调控温度来控制脂肪酶的活性，制备出具有长大和缩小功能的原细胞模型，实现对原细胞新陈代谢功能的模拟。本发明不仅拓展了原细胞模型的种类，还从功能模拟方面实现了新的突破。

权利要求

1.一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法，其特征在于基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法具体是按以下步骤进行的：

一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH₂PO₄和Na₂HPO₄混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH₂PO₄与Na₂HPO₄的质量比为1:(20～40)；所述PBS缓冲溶液的浓度为40mmol/L～50mmol/L，pH值为7.0～8.5；

二、脂肪酶溶液的配制：将脂肪酶溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液中，得到脂肪酶溶液；所述脂肪酶溶液的浓度为0.2mg/mL～2mg/mL；

三、油相溶液的配制：将液态甘油三脂和硅油混合，得到油相溶液；所述油相溶液中液态甘油三脂的体积含量为2％～98％；

四、利用Pickering微乳液法来制备以脂肪酶为稳定剂的水包油原细胞模型：将步骤二得到的脂肪酶溶液和步骤三得到的油相溶液混合后，利用涡旋震荡仪震荡20s～30s，得到基于脂肪酶的原细胞模型；所述步骤三得到的油相溶液与步骤二得到的脂肪酶溶液的体积比为1:(0.1～0.4)。

2.根据权利要求1所述的一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法，其特征在于步骤一中所述NaH₂PO₄与Na₂HPO₄的质量比为1:30。

3.根据权利要求1所述的一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法，其特征在于步骤一中所述PBS缓冲溶液的浓度为45mmol/L。

4.根据权利要求1所述的一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法，其特征在于步骤一中pH值为8。

5.根据权利要求1所述的一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法，其特征在于步骤二中所述脂肪酶溶液的浓度为1mg/mL。

6.根据权利要求1所述的一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法，其特征在于步骤三中所述油相溶液中液态甘油三脂的体积含量为10％。

7.根据权利要求1所述的一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法，其特征在于步骤三中所述油相溶液中液态甘油三脂的体积含量为50％。

8.根据权利要求1所述的一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法，其特征在于步骤四中所述的步骤三得到的油相溶液与步骤二得到的脂肪酶溶液的体积比为1:0.2。

9.利用权利要求1制备的基于脂肪酶的原细胞模型模型模拟生物细胞新陈代谢的方法，其特征在于利用基于脂肪酶的原细胞模型模拟生物细胞新陈代谢的方法具体是按以下步骤进行的：

一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH₂PO₄和Na₂HPO₄混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH₂PO₄与Na₂HPO₄的质量比为1:(20～40)；所述PBS缓冲溶液的浓度为40mmol/L～50mmol/L，pH值为7.0～8.5；

二、养料溶液的配制：将液态甘油三脂溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液，得到养料溶液；所述步骤一得到的PBS缓冲溶液与液态甘油三脂的体积比为1:(1～3)；

三、在室温条件下，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为120min～150min；然后在0℃条件下，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为20min～30min；

七、在0℃条件下，向基于脂肪酶的原细胞模型中加入步骤四得到的养料溶液，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为180min～220min；

五、根据步骤三和步骤四得到的大小变化数据，得到原细胞模型的收缩和增长规律。

10.根据权利要求9所述的利用基于脂肪酶的原细胞模型模拟生物细胞新陈代谢的方法，其特征在于步骤二中所述步骤一得到的PBS缓冲溶液与液态甘油三脂的体积比为1:2。

说明书

技术领域

本发明属于原细胞模拟和仿生材料制备领域，具体涉及一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法及利用该原细胞模型模拟生物细胞新陈代谢的方法。

背景技术

原细胞模型的构建在真核细胞起源甚至生命起源等研究中具有重要意义，这是因为原细胞是一种能够模拟真实细胞的人工模型，可以模拟真实细胞的多室化、细胞复制或分裂等功能。因此，为了能够对真实细胞进行深入的探究，许多基于不同成分的原细胞模型被构建出来，如磷脂胶囊原细胞模型、脂肪酸胶囊原细胞模型、基于凝胶纳米粒子的原细胞模型、聚合物微胶囊原细胞模型以及胶囊体和树枝状大分子构建的原细胞模型。目前所报道的大多数原细胞模型都具有与原始细胞相似的中空结构，但是在模拟原细胞的多重功能方面却进展相对缓慢。例如，磷脂胶囊原细胞模型成功地被用于模拟真实细胞生命周期中各项生命活动，包括物质的摄入、自我复制和分裂等过程。类似地，基于凝胶纳米粒子的凝胶胶囊原细胞模型也可用于模拟细胞的生长和分裂过程，甚至可以实现基因表达和酶催化作用。类似地，聚合物囊泡原细胞模型也被用于模拟原始细胞的功能，包括光诱导的释放功能和对酶的响应作用等。此外，乔等人研究了人工细胞群体中的掠夺行为，即凝聚液滴可以捕食蛋白质囊泡，将其裂解然后掠夺它们的内溶物。另一方面，蛋白质-聚合物耦合体作为构建基元来制备蛋白质原细胞模型，来模拟原细胞的装载能力、可调控的膜透性、基因诱导的蛋白质合成以及膜诱导的多级反应。这些研究不仅促进了原细胞模型的发展，还成功模拟了原始细胞的一些功能，然而，据我们所知，目前为止还没有出现过关于模拟原始细胞代谢过程的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有原细胞模型不能模拟原细胞新陈代谢功能的问题，而提供了一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法及利用该原细胞模型模拟生物细胞新陈代谢的方法。

一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法具体是按以下步骤进行的：

一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH₂PO₄和Na₂HPO₄混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH₂PO₄与Na₂HPO₄的质量比为1:(20～40)；所述PBS缓冲溶液的浓度为40mmol/L～50mmol/L，pH值为7.0～8.5；

二、脂肪酶溶液的配制：将脂肪酶溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液中，得到脂肪酶溶液；所述脂肪酶溶液的浓度为0.2mg/mL～2mg/mL；

三、油相溶液的配制：将液态甘油三脂和硅油混合，得到油相溶液；所述液态甘油三脂和硅油的体积比为1:(0.5～9)；

四、利用Pickering微乳液法来制备以脂肪酶为稳定剂的水包油原细胞模型：将步骤二得到的脂肪酶溶液和步骤三得到的油相溶液混合后，利用涡旋震荡仪震荡20s～30s，得到基于脂肪酶的原细胞模型；所述步骤三得到的油相溶液与步骤二得到的脂肪酶溶液的体积比为1:(6～26)。

利用基于脂肪酶的原细胞模型模拟生物细胞新陈代谢的方法具体是按以下步骤进行的：

一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH₂PO₄和Na₂HPO₄混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH₂PO₄与Na₂HPO₄的质量比为1:(20～40)；所述PBS缓冲溶液的浓度为40mmol/L～50mmol/L，pH值为7.0～8.5；

二、养料溶液的配制：将液态甘油三脂溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液，得到养料溶液；所述步骤一得到的PBS缓冲溶液与液态甘油三脂的体积比为1:(1～4)；

三、在室温条件下，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为120min～150min；然后在0℃条件下，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为20min～30min；

七、在0℃条件下，向基于脂肪酶的原细胞模型中加入步骤四得到的养料溶液，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为180min～220min；

五、根据步骤三和步骤四得到的大小变化数据，得到原细胞模型的收缩和增长规律。

本发明的原理：

1、模拟原细胞的新陈代谢中的排泄功能是利用在室温条件下脂肪酶催化油相底物液态甘油三脂的分解反应，产物甘油和丁酸均易溶于水相，因此能够通过渗透作用从原细胞中排出到体外，导致原细胞模型尺寸变小，从而模拟了原细胞的排泄功能。

2、模拟原细胞新陈代谢中的摄取功能是由于在0℃的条件下，脂肪酶的活性被抑制，而外界溶液中加入的液态甘油三脂会通过渗透作用进入原细胞模型中，导致原细胞模型尺寸变大，从而模拟了原细胞模型的食物摄取功能。

3、通过改变温度，实现了利用原细胞模型循环模拟原细胞的新陈代谢功能。

本发明的有益效果：

本发明首次利用脂肪酶为稳定剂，制备出具有模拟新陈代谢功能的原细胞模型，通过改变外界温度调节脂肪酶的活性，模拟了原细胞的新陈代谢功能，包括摄入(肿胀)和排出(收缩)等。本发明不但拓展了构建原细胞模型的材料，并且实现了新陈代谢功能的模拟，为深入开展生物细胞功能研究提供了新的原细胞模型。同时，解决了难以模拟生物细胞新陈代谢过程的科学问题。该发明为未来深入研究细胞功能和行为提供了新的研究平台。

附图说明

图1为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型的外观形貌图；

图2为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型进行新陈代谢中的排泄功能，尺寸缩小之后的光学显微镜照片；

图3为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型进行新陈代谢中的摄取功能，尺寸增长之后的光学显微镜照片；

图4为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型进行新陈代谢中的排泄功能之前的荧光显微镜照片；

图5为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型进行新陈代谢中的排泄功能之后的荧光显微镜照片。

图6为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型在进行两个新陈代谢循环过程中的尺寸变化图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法具体是按以下步骤进行的：

一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH₂PO₄和Na₂HPO₄混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH₂PO₄与Na₂HPO₄的质量比为1:(20～40)；所述PBS缓冲溶液的浓度为40mmol/L～50mmol/L，pH值为7.0～8.5；

二、脂肪酶溶液的配制：将脂肪酶溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液中，得到脂肪酶溶液；所述脂肪酶溶液的浓度为0.2mg/mL～2mg/mL；

三、油相溶液的配制：将液态甘油三脂和硅油混合，得到油相溶液；所述油相溶液中液态甘油三脂的体积含量为2％～98％；

四、利用Pickering微乳液法来制备以脂肪酶为稳定剂的水包油原细胞模型：将步骤二得到的脂肪酶溶液和步骤三得到的油相溶液混合后，利用涡旋震荡仪震荡20s～30s，得到基于脂肪酶的原细胞模型；所述步骤三得到的油相溶液与步骤二得到的脂肪酶溶液的体积比为1:(0.1～0.4)。

本实施方式所述液态甘油三脂为甘油三丁酯、甘油三乙酯或甘油三丙酯。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述NaH₂PO₄与Na₂HPO₄的质量比为1:30。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中所述PBS缓冲溶液的浓度为45mmol/L。其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中pH值为8。其他步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中所述脂肪酶溶液的浓度为1mg/mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中所述油相溶液中液态甘油三脂的体积含量为10％。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中所述油相溶液中液态甘油三脂的体积含量为50％。其他步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤四中所述的步骤三得到的油相溶液与步骤二得到的脂肪酶溶液的体积比为1:0.2。其他步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式利用基于脂肪酶的原细胞模型模拟生物细胞新陈代谢的方法具体是按以下步骤进行的：

一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH₂PO₄和Na₂HPO₄混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH₂PO₄与Na₂HPO₄的质量比为1:(20～40)；所述PBS缓冲溶液的浓度为40mmol/L～50mmol/L，pH值为7.0～8.5；

二、养料溶液的配制：将液态甘油三脂溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液，得到养料溶液；所述步骤一得到的PBS缓冲溶液与液态甘油三脂的体积比为1:(1～3)；

三、在室温条件下，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为120min～150min；然后在0℃条件下，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为20min～30min；

七、在0℃条件下，向基于脂肪酶的原细胞模型中加入步骤四得到的养料溶液，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为180min～220min；

五、根据步骤三和步骤四得到的大小变化数据，得到原细胞模型的收缩和增长规律。

本实施方式所述液态甘油三脂为甘油三丁酯、甘油三乙酯或甘油三丙酯。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是：步骤二中所述步骤一得到的PBS缓冲溶液与液态甘油三脂的体积比为1:2。其他步骤及参数与具体实施方式九相同。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一：一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法具体是按以下步骤进行的：

一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH₂PO₄和Na₂HPO₄混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH₂PO₄与Na₂HPO₄的质量比为1:20；所述PBS缓冲溶液的浓度为40mmol/L，pH值为7.0；

二、脂肪酶溶液的配制：将0.2mg脂肪酶溶解在1mL步骤一得到的PBS缓冲溶液中，得到脂肪酶溶液；

三、油相溶液的配制：将甘油三丁酯和500μL硅油混合，得到油相溶液；所述油相溶液中甘油三丁酯的体积含量为10％；

四、养料溶液的配制：将1mL甘油三丁酯溶解在500μL步骤一得到的PBS缓冲溶液，得到养料溶液；

五、利用Pickering微乳液法来制备以脂肪酶为稳定剂的水包油原细胞模型：将120μL步骤二得到的脂肪酶溶液和120μL步骤三得到的油相溶液混合后，利用涡旋震荡仪震荡20s，得到基于脂肪酶的原细胞模型；

六、在室温条件下，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为120min～150min；然后在0℃条件下，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为20min～30min；

七、在0℃条件下，向基于脂肪酶的原细胞模型中加入步骤四得到的养料溶液，观察并测量基于脂肪酶的原细胞模型的大小变化，观察时间为180min～220min；

八、根据步骤六和步骤七得到的大小变化数据，得到原细胞模型的收缩和增长规律。

图1为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型的外观形貌图，图中标尺为10μm；从图中可以看出蛋白质胶囊大小分布均匀(尺寸在10～25μm之间)，透光性好，说明其具有明显的与真实细胞相似的空心结构，并且具有良好的稳定性，能够用于模拟原细胞。

图2为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型进行新陈代谢中的排泄功能，尺寸缩小之后的光学显微镜照片，图中标尺为10μm；从图中可以看出原细胞模型依旧稳定，并且保持良好的细胞结构。

图3为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型进行新陈代谢中的摄取功能，尺寸增长之后的光学显微镜照片，图中标尺为10μm；从图中可以看出原细胞模型依旧稳定，并且保持良好的细胞结构。

图4为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型进行新陈代谢中的排泄功能之前的荧光显微镜照片，图中标尺为10μm；从图中可以看出该原细胞模型在进行食物摄取之前，溶液中的荧光强度较强，原细胞模型中的荧光强度较弱。

图5为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型进行新陈代谢中的排泄功能之后的荧光显微镜照片，图中标尺为10μm。从图中可以看出该原细胞模型在进行食物摄取之后，溶液中的荧光强度明显减弱，原细胞模型中的荧光强度明显增强，证明该原细胞模型能够模拟原细胞摄入食物的功能。

图6为实施例一得到的基于脂肪酶的原细胞模型在进行两个新陈代谢循环过程中的尺寸变化图。图中从0min至100min，温度控制在0摄氏度，原细胞模型的尺寸几乎没有变化，证明在0摄氏度时，原细胞的新陈代谢功能被有效地抑制住；从100min～220min，原细胞模型的外在温度被调整为25摄氏度，导致脂肪酶的活性恢复到正常，即脂肪酶能够催化分解油相溶液中的甘油三丁酯底物，因此使得原细胞模型的排泄功能重新开始，直至细胞尺寸不变，即底物甘油三丁酯被完全消耗掉；从220min至470min，原细胞模型温度再次调整到0摄氏度，并在溶液中加入甘油三丁酯饱和的水溶液(养料溶液)，模拟原细胞模型的摄取功能，可见在这段时间内，原细胞模型的尺寸逐渐增长至平衡，即模拟原细胞模型从饥饿状态达到饱和状态。同样的，从470min至600min，再次模拟原细胞模型的食物消耗过程。从600～1000min，为第二次新陈代谢循环。

一种基于脂肪酶的原细胞模型的制备方法及利用该原细胞模型模拟生物细胞新陈代谢的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。