专利摘要

本发明公开了一种苹果花粉管微丝的标记方法，是将苹果花粉经过培养、固定、酶处理、表面活性剂处理和染料标记步骤后封片进行扫描成像。本发明的有益效果为：本发明在梨花粉微丝标记的方法基础之上结合裸子植物花粉管微丝的标记方法进行借鉴与改进，通过固定、酶解细胞壁、表面活性剂使染料更容易进入胞内，运用FITC-Phalloidin标记，避免了应用TRITC-Phalloidin由于酶解不充分导致细胞外壁自发荧光的干扰，可以得到保存相对完好的苹果花粉微丝，且具有高效、快速的特点，可以获得更加清晰、明亮的图片，填补了苹果花粉管微丝标记的空白，为蔷薇科乃至被子植物花粉管中微丝的标记提供参考，应用价值高。

权利要求

1.一种苹果花粉管微丝的标记方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）苹果花粉培养：将储存在-20℃的花粉取出回温，采用液体培养法，称取花粉10mg，悬浮于10ml培养基中，温度30℃，100rpm/min振荡暗培养，培养基组成为：20%蔗糖+0.015%CaCl₂+0.01%H₃BO₃；

2）固定：用含有质量百分含量为4%的多聚甲醛洗步骤1）得到的培养好的苹果花粉两次，固定1.5h，同时真空抽气10-15min，得到固定后花粉，所述4%的多聚甲醛是用pH值为6.9的50mM PIPES缓冲液配置的；

3）酶处理：将步骤2）得到的固定后花粉以50mM的PIPES缓冲液洗涤三次，再将洗涤后的花粉置于含有质量百分含量1%的果胶酶和质量百分含量1%的纤维素酶的50mM PIPES缓冲液中，37℃培养15-20min，得到酶处理后花粉；

4）将步骤3）得到的酶处理后花粉以50mM PIPES缓冲液洗涤三次后，再置于体积百分含量为1%的Triton X-100溶液中，室温孵育1-2h，得到孵育花粉；

5）将步骤4）得到的孵育花粉以200nM Alexa Fluor 488 phalloidin标记，标记过程为200nM Alexa Fluor488 phalloidin是以PBS缓冲液稀释的，pH值为6.9，置于暗培养环境下培养2h，直接观察或以4℃过夜后观察再以甘油封片即可得到标记花粉封片；

6）将步骤5）得到的标记花粉封片利用Leica TCS SP5激光共聚焦扫描成像系统，FITC，Ar激光，波长488nm，每个样品取180-200个不同光学切片扫描，再将所有光学切片叠加成像即可。

说明书

技术领域

本发明涉及一种苹果花粉管微丝的标记方法。

背景技术

目前国内外几乎没有对苹果花粉管中微丝进行标记的报道。花粉中微丝标记的技术主要有化学染色方法：将带有荧光染料的鬼笔环肽进行标记，其次冷冻固定结合显微注射和利用基因重组技术将绿色荧光蛋白基因转入活体花粉管中的方法进行观察，但目前多用化学染色的方法较简捷、高效。近几年在裸子植物松科花粉中微丝的研究相对较多，多采用Rhodamine-Phalloidin进行标记。在被子蔷薇科植物中，梨花粉管微丝的标记已有报道，标记过程中没有进行酶解花粉管壁、Triton去污通透的步骤可能是导致标记效果欠佳的原因。而在苹果花粉管中微丝标记稍显空白。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种苹果花粉管微丝的标记方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种苹果花粉管微丝的标记方法，包括以下步骤：

1）苹果花粉培养：将储存在-20℃的花粉取出回温，采用液体培养法，称取花粉10mg，悬浮于10ml培养基中，温度30℃，100rpm/min振荡暗培养，培养基组成为：20%蔗糖+0.015%CaCl₂+0.01%H₃BO₃；

2）固定：用含有质量百分含量为4%的多聚甲醛洗步骤1）得到的培养好的苹果花粉两次，固定1.5h，同时真空抽气10-15min，得到固定后花粉，所述4%的多聚甲醛是用pH值为6.9的50mM PIPES缓冲液配置的；

3）酶处理：将步骤2）得到的固定后花粉以50mM的PIPES缓冲液洗涤三次，再将洗涤后的花粉置于含有质量百分含量1%的果胶酶和质量百分含量1%的纤维素酶的50mM PIPES缓冲液中，37℃培养15-20min，得到酶处理后花粉；

4）将步骤3）得到的酶处理后花粉以50mM PIPES缓冲液洗涤三次后，再置于体积百分含量为1%的Triton X-100溶液中，室温孵育1-2h，得到孵育花粉；

5）将步骤4）得到的孵育花粉以200nM Alexa Fluor 488 phalloidin标记，标记过程为200nM Alexa Fluor488 phalloidin是以PBS缓冲液稀释的，pH值为6.9，置于暗培养环境下培养2h，直接观察或以4℃过夜后观察再以甘油封片即可得到标记花粉封片；

6）将步骤5）得到的标记花粉封片利用Leica TCS SP5激光共聚焦扫描成像系统，FITC，Ar激光，波长488nm，每个样品取180-200个不同光学切片扫描，再将所有光学切片叠加成像即可。

本发明的有益效果为：本发明在梨花粉微丝标记的方法基础之上结合裸子植物花粉管微丝的标记方法进行借鉴与改进，通过固定、酶解，运用FITC-Phalloidin标记，可以得到保存相对完好的苹果花粉微丝，且具有高效、快速的特点，可以获得更加清晰、明亮的图片，填补了苹果花粉管微丝标记的空白，为蔷薇科乃至被子植物花粉管中微丝的标记提供参考，应用价值高。 

附图说明

图1为本发明提供的一种苹果花粉管微丝的标记方法中，苹果花粉微丝的分布状态图（bar=25μm）。

具体实施方式

试剂来源：

多聚甲醛：批号:20080512，北京拓英坊科技有限公司；

PIPES缓冲液：SIGMA，80635-50G，50mM PIPES 称取7.55925g溶解于双蒸水中，调片pH为6.9，定容至500ml。西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；

果胶酶：Pectolase Y-23 ,MFCD00131809, 北京北元高科农业发展中心；

纤维素酶：Cellulase R-10，批号201097，105-0004，北京北元高科农业发展中心；

Triton X-100：SIGMA,T9284-500ML，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；

Alexa Fluor 488 phalloidin：SIGMA，A12379,西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；

PBS缓冲液：100mM PBS:分别称取8.0 g NaCl, 0.2g KCl, 2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄，依次按顺序溶解于800 ml双蒸水中，用1 N HCl调pH 7.2，然后定容至1000 ml。

实施例1：

一种苹果花粉管微丝的标记方法，包括以下步骤：

1）苹果花粉培养：将储存在-20℃的花粉取出回温，采用液体培养法，称取花粉10mg，悬浮于10ml培养基中，温度30℃，100rpm/min振荡暗培养，培养基组成为：20%蔗糖+0.015%CaCl₂+0.01%H₃BO₃；

2）固定：用含有质量百分含量为4%多聚甲醛（用pH值为6.9的50mM PIPES缓冲液配置）洗步骤1）得到的培养好的苹果花粉两次，固定1.5h，同时真空抽气10-15min，得到固定后花粉；

3）酶处理：将步骤2）得到的固定后花粉以50mM的PIPES缓冲液洗涤三次，再将洗涤后的花粉置于含有质量百分含量1%的果胶酶和质量百分含量1%的纤维素酶的50mM PIPES缓冲液中，37℃培养15-20min，得到酶处理后花粉；

4）将步骤3）得到的酶处理后花粉以50mM PIPES缓冲液洗涤三次后，再置于体积百分含量为1%的Triton X-100溶液中，室温孵育1-2h，得到孵育花粉；

5）将步骤4）得到的孵育花粉以200nM Alexa Fluor 488 phalloidin标记，标记过程为200nM Alexa Fluor488 phalloidin是以PBS缓冲液稀释的，pH值为6.9，置于暗培养环境下培养2h，直接观察或以4℃过夜后观察再以甘油封片即可得到标记花粉封片；

6）将步骤5）得到的标记花粉封片利用Leica TCS SP5激光共聚焦扫描成像系统，FITC，Ar激光，波长488nm，每个样品取180-200个不同光学切片扫描，再将所有光学切片叠加成像即可。

苹果花粉微丝分布状态（bar=25μm）如图1所示。

本发明提供的一种苹果花粉管微丝的标记方法与现有技术相比，具有以下效果：

1、在梨花粉培养基础上改进，固定液直接采用4%多聚甲醛固定，而非分别用2%和4%的多聚甲醛，节省时间用于酶解细胞壁，1%纤维素酶与1%果胶酶的配比使细胞壁酶解且不影响花粉中微丝的形态，运用1%非离子型去污剂Triton X-100，增加膜的通透性，使染料更容易进入胞内标记微丝，图片中微丝更加清楚，而且保持了微丝的完整性。

2、在染料的应用上没有采用裸子植物TRITC标记的鬼笔环肽,采用适宜浓度200nM的FITC标记的鬼笔环肽，TRITC标记的花粉细胞外壁存在时，外壁自发荧光较强，影响标记效果，选用可能与外壁激发光波长较远的FITC-ph标记,微丝的标记不会受到没有充分酶解的细胞壁自发荧光影响，可以观察到更加清晰的微丝形态。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

一种苹果花粉管微丝的标记方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。