专利摘要

本发明公开了一种重组脂肪酶突变体、工程菌及其制备(2S,3R)‑N‑乙酰‑哌啶‑2,3‑二甲酸二甲酯应用，所述突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列第140位、141位、144位、189位、第190位进行单突变或者组合突变获得的。该突变体相比于野生型酶在转化上述反应时催化活力和底物耐受性大大提高，反应进程耗时明显缩短。相比于化学法制备(S,S)‑2,8‑二氮杂双环[4,3,0]壬烷，本发明提供的技术所得产品立体选择性高，反应条件更加温和，对设备要求低，降低了反应成本，且对环境友好。

权利要求

1.一种重组脂肪酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第144位的亮氨酸突变为丝氨酸，且第189位异亮氨酸突变为赖氨酸；(2)第140位亮氨酸突变为甘氨酸、第141位的丙氨酸突变为亮氨酸且第189位异亮氨酸突变为赖氨酸。

2.一种权利要求1所述重组脂肪酶突变体的编码基因。

3.一种由权利要求2所述编码基因构建的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述重组脂肪酶突变体在制备莫西沙星药物中间体(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：将整合有重组脂肪酶突变体编码基因的基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心，以发酵上清或分离纯化后的酶作为催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，以pH值为3.0-10.0的100mM磷酸盐的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-50℃转化反应，反应结束后，获得(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯的反应液。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物初始浓度为1-2mol/L，所述酶的用量为0.1-0.8g/L。

说明书

(一)技术领域

本发明属于生物制药和生物转化领域，具体涉及南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)突变体、突变体基因、含有该突变体基因的重组载体、含有该突变体基因的重组基因工程菌以及南极假丝酵母脂肪酶B突变体在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用。

(二)背景技术

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)，系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)，在生物体内主要催化甘油三酯水解为甘油和游离脂肪酸，在工业中，广泛应用于酯化及酯交换、醇解、酸解、氨解等酯基转移反应。脂肪酶广泛存在于微生物、植物及动物等生物体内，其中，微生物脂肪酶具有种类多、活性高、稳定性较好，选择性和底物特异性优良，反应pH和温度范围广泛等特性，在工业生产中有着重要应用。目前，微生物脂肪酶的研究主要集中于根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、地霉属(Geotrichum)、假丝酵母属(Candida)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)等具有工业应用价值的菌株。

(S,S)-2,8-二氮杂双环[4,3,0]壬烷是合成第四代喹诺酮类抗菌药物莫西沙星的重要手性中间体，后者是由德国拜耳公司研制，主要用于治疗治疗急性窦腺炎、慢性支气管炎等呼吸道疾病的广谱抗生素。对于(S,S)-2,8-二氮杂双环[4,3,0]壬烷的制备，传统的合成方法主要有化学拆分法、不对称合成法和手性源法。化学拆分法是目前主要的应用方法，具体是以2,3-二甲酸吡啶为起始原料，经脱水，氨解，环合，还原，化学拆分等步骤获得目的产物。但是该方法存在着拆分收率低，能耗大，污染严重等问题，已不符合当代绿色化学的发展趋势(EP 0550903A1，US 20080221329A1)。近年来，利用酶法代替化学法改善反应条件，降低反应成本，提高产物的选择性成为关注的重点。生物拆分法不仅具有高度的化学、区域和立体选择性，并且反应条件温和，对环境友好，有效弥补了化学方法的不足。利用脂肪酶为催化剂，可高效拆分外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯获得光学纯的(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯，并进而用于合成(S,S)-2,8-二氮杂双环[4,3,0]壬烷。相比于化学拆分法，脂肪酶拆分法将拆分步骤提前，原子经济性强，立体选择高，避免了化学拆分剂的使用。目前关于脂肪酶法拆分生产(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯的报道较少，专利US 8680276B2报道了采用40g/L的固定化南极假丝酵母脂肪酶B在140h内将80g/L的外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯拆分完全。Nitin W.，Fadnavis等人用40g/L的液态南极假丝酵母脂肪酶B(Addzyme CALB(5000TBU))取代固定化南极假丝酵母脂肪酶B，在16h内将80g/L的外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯拆分完全(ORGANICPROCESS RESEARCH&DEVELOPMENT卷:19期:1页:296-301)。

然而，目前报道的脂肪酶法拆分生产(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯技术主要存在的问题是拆分过程中底物浓度低，脂肪酶催化活力低，催化剂使用量大，需长时间反应等，尚不能达到规模化工业生产的要求。

(三)发明内容

本发明目的是提供南极假丝酵母脂肪酶B突变体、编码基因、含有该突变体基因的重组载体、含有该突变体基因的重组基因工程菌，以及南极假丝酵母脂肪酶B突变体在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用。该突变体对外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯具有较高的底物耐受性、和较高的催化活力，可有效解决目前面临的脂肪酶催化活力低，拆分反应底物浓度低，反应时间长等问题，极大的提高了催化效率，减少了工业生产周期，降低生产成本。

本发明采用的技术方案是：

本发明通过对野生型南极假丝酵母脂肪酶B进行单个氨基酸或者多个氨基酸的突变，提高其对外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯催化活力。

所述脂肪酶在本发明的一种实施方式中，脂肪酶编码基因(SEQ ID NO.1)与表达载体pET22b连接，构建重组表达质粒。将重组表达质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)宿主菌中，获得含有重组质粒的基因工程菌。

所述脂肪酶在本发明的一种实施方式中，以是含有脂肪酶基因的重组表达质粒为模板，通过单点饱和突变或多位点组合饱和突变技术进行基因改造的。改造后的重组表达质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)宿主菌中，获得含有脂肪酶突变体基因的基因工程菌。对所得基因工程菌进行诱导表达培养，得到脂肪酶突变体的菌体细胞，并通过以溴百里香酚蓝为显色剂的高通量筛选方法进行大批量筛选，进而得到性能优异的突变体。

所述重组脂肪酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第140位、141位、144位、189位、190位进行单突变或者组合突变获得的，优选所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第140位亮氨酸突变为甘氨酸；(2)第141位的丙氨酸突变为亮氨酸；(3)第144位的亮氨酸突变为丝氨酸；(4)第189位异亮氨酸突变为赖氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、组氨酸或酪氨酸；(5)第190位缬氨酸突变为亮氨酸；(6)第140位亮氨酸突变为甘氨酸，且第141位的丙氨酸突变为亮氨酸；(7)第189位异亮氨酸突变为天冬酰胺、且第190位缬氨酸突变为亮氨酸；(8)第189位异亮氨酸突变为组氨酸，且第190位缬氨酸突变为亮氨酸；(9)第144位的亮氨酸突变为丝氨酸，且第189位异亮氨酸突变为赖氨酸；(10)第140位亮氨酸突变为甘氨酸、第141位的丙氨酸突变为亮氨酸且第189位异亮氨酸突变为赖氨酸。

所述脂肪酶突变体，在本发明的一种实施方式中，是将脂肪酶突变体基因通过同源重组整合到Pichia pastoris X-33基因组中，得到含有脂肪酶突变体基因的重组毕赤酵母基因工程菌。对所得基因工程菌进行甲醇诱导培养，培养液与菌体分离得到脂肪酶突变体初酶液。所得粗酶液通过镍柱亲和层析进行分离，获得脂肪酶突变体纯酶，并将突变体脂肪酶与原始脂肪酶进行催化活力的比较，以确定催化性能的提升。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 6.0条件下，1min内消耗1μmol(2R,3S)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯所需的酶量定义为1U。

本发明涉及所述脂肪酶突变体在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用，具体所述应用为：以含有脂肪酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的粗酶液中提取的纯酶为催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，以pH值为6的缓冲溶液(优选磷酸钠缓冲溶液)为反应介质构成反应体系，在35℃，600rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯。所述反应体系中，催化剂用量以纯酶重量计为0.1-0.8g/L(即3000-30000U/L)，所述底物的初始浓度为1-2mol/L(即200-500g/L)，所需的转化时间为5-8h。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明得到了一系列对外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯具有高立体选择性，高催化活力的脂肪酶突变体，所得脂肪酶突变体用于催化拆分生产(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯具有反应条件温和、底物浓度高、催化剂用量少、反应时间短、光学纯度高的优点。1mol/L(243.26g/L)的外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯在0.1g/L的脂肪酶突变体催化下，5h内其转化率达到49.9％，e.e.s>99％明显优于现有报道的脂肪酶。

(四)附图说明

图1：脂肪酶法拆分外外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯示意图。

图2：E.coli Rosetta(DE3)/pET22b-CALB表达脂肪酶SDS-PAGE图。

泳道1为Marker；泳道2为E.coli Rosetta(DE3)/pET22b-CALB未诱导破碎上清样；泳道3为E.coli Rosetta(DE3)/pET22b-CALB未诱导破碎沉淀样；泳道4为E.coli Rosetta(DE3)/pET22b-CALB诱导破碎上清样；泳道5为E.coli Rosetta(DE3)/pET22b-CALB诱导破碎沉淀清样。

图3：Pichia pastoris X-33/CALB表达及纯化脂肪酶SDS-PAGE图。

泳道1为Marker；泳道2为Pichia pastoris X-33/CALB发酵上清样；泳道3为Pichia pastoris X-33/CALB纯化样。

图4：CALB拆分1mol/L底物进程图。

图5：mut-Ile189Lys拆分1mol/L底物进程图。

图6：mut-Ile189Lys拆分500g/L底物进程图。

图7：mut-Leu144Ser/Ile189Lys拆分1mol/L底物进程图。

图8：mut-Leu140Gly/Ala141Leu/Ile189Lys拆分1mol/L底物进程图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。

实施例1：重组脂肪酶基因工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET22b-CALB的构建

南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因序列经酵母密码子优化后通过全基因合成获得pGEM-T-CALB质粒。设计表达引物1(GGCCATGGCCTTACCTAGTGGTTCCGACCCTG)、引物2(GGGCGGCCGCTCAATGATGATGATGGTGGTGAGGAGTAACAATTCCTGAAC)(下划线为Nco I和Not I限制性酶切位点)，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得951bp的脂肪酶基因序列(核苷酸序列如SEQ IN NO.1所示，氨基酸序列SEQ IN NO.2所示)。利用Nco I和Not I限制性内切酶对扩增片段进行酶切处理，利用T4DNA连接酶将该片段与用相同限制性内切酶处理的pET22b进行连接，构建表达载体pET22b-CALB。将构建的表达载体转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中获得重组脂肪酶酶基因工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET22b-CALB。

实施例2：重组脂肪酶突变体的表达及筛选

以含有表达载体pET22b-CALB的重组菌(E.coli Rosetta(DE3)/pET22b-CALB)为出发菌株，通过定点饱和突变技术，进一步提高脂肪酶对底物外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯的催化活力。设计引物如下：

Leu/Ala(L/A)140/141组合：

上游引物5：5’-ACTACAAAGGTACCGTGNDTNDTGGTCCACTTGACGCCTT-3’

下游引物6：5’-GAGAACTGTGATGTCAAAGATCCTGCATGATCGATAAC-3’

Leu(L)144：

上游引物7：5’-AGGTACCGTGTTGGCTGGTCCANNKGACGCCTTGGCAGT-3’

下游引物8：5’-GGACACTGCCAAGGCGTCMNNTGGACCAGCCAACACGGT-3’

Ile(I)189：

上游引物9：5’-CTCAGCTACAGACGAANNKGTTCAGCCTCAAGTTAGT-3’

下游引物10：5’-CTAACTTGAGGCTGAACMNNTTCGTCTGTAGCTGAG-3’

Val(V)190：

上游引物11：5’-TCAGCTACAGACGAAATTNNKCAGCCTCAAGTTAGTA-3’

下游引物12：5’-TTACTAACTTGAGGCTGMNNAATTTCGTCTGTAGCTG-3’

Ile/Val(I/V)189/190组合：

上游引物13：5’-TACTCAGCTACAGACGAANDTNDTCAGCCTCAAGTTAGT-3’

下游引物14：5’-GAGAACTGTGATGTCAAAGATCCTGCATGATCGATAAC-3’

以pET22b-CALB质粒为模板，通过PCR引入突变，PCR反应程序如下：98℃3min；98℃10s，58℃10s，72℃6min，重复29个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coliRosetta(DE3)感受态细胞中，涂布于含终浓度100mg/L氨苄抗性和20mg/L氯霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h后，随机挑取单菌落进行筛选。

阳性克隆子的筛选：随机挑选平板上的单菌落于96孔板中，加入1mL含100μg/mLAmp(氨苄霉素)+20μg/mLCm(氯霉素)的液体LB培养基，37℃，150rpm下培养过夜。转接50μL种子液于另一块新的加有1mL含100μg/mLAmp(氨苄霉素)+20μg/mLCm(氯霉素)的液体LB培养基的96孔板中，37℃，150rpm培养4h后加入IPTG(终浓度0.1mM)在22℃下进行诱导表达培养12h，诱导表达情况如图2所示。所得的菌液通过96孔板离心机离心30min得到湿菌体，湿菌体经pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤一次后，保存至-80℃冰箱，反复冻融3次，再加入200μL 2g/L的溶菌酶酶液于22℃处理2h，离心除去细胞碎片，得到粗酶液。突变体酶活通过pH指示剂溴百里香酚蓝的颜色变化来判断，具体地，96孔板220μL酶活测定体系包含：20μL pH指示剂，100μL底物(40g/L的外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯)，100μL经溶菌酶破胞处理所得的酶液，观察反应液颜色变化。相应地，突变体酶活越高，颜色由蓝色变为黄色的速度越快，从而筛选出活力相对较高的突变体。

通过对Leu140/Ala141，Leu144，Ile189，Val190和Ile189/Val190位点的饱和突变分析，获得一系列不同的脂肪酶突变体。通过比较不同脂肪酶突变体在催化底物(外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯)时的转化率高低来确定最优突变体。转化反应在10mL的转化瓶中进行，底物浓度为40g/L，突变体湿菌体10g/L，30℃，150rpm反应30min，反应液通过HPLC分析来确定反应的转化率从而确定最优的突变体。

结果表明，不同突变位点获得的较优突变体为mut-Leu140Gly/Ala141Leu(SEQ INNO.2所示氨基酸序列的140位Leu突变为Gly，且141位Ala突变为Leu)、mut-Leu144Ser(SEQIN NO.2所示氨基酸序列144位Leu突变为Ser)、mut-Ile189Lys(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列189Ile突变为Lys)、mut-Ile189Arg(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列189位Ile突变为Arg)、mut-Ile189Ala(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列189位Ile突变为Ala)、mut-Ile189Asn/Val190Leu(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列18位Ile突变为Asn，且190位Val突变为Leu)、mut-Ile189His/Val190Leu(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列189位Ile突变为His且190位Val突变为Leu)和mut-Ile189Tyr/Val190Leu(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列189位Ile突变为Tyr，且190位Val突变为Leu)。

将较优的突变位点进行叠加突变，获得一系列更优突变体，其中最优的突变体为mut-Leu144Ser/Ile189Lys(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列144位Leu突变为Ser，且189位Ile突变为Lys)和mut-Leu140Gly/Ala141Leu/Ile189Lys(SEQ IN NO.2所示氨基酸序列140位Leu突变为Gly+141位Ala突变为Leu+189位Ile突变为Lys)

实施例3：野生型及突变体重组脂肪酶基因工程菌Pichia pastoris X-33/CALB和Pichia pastoris X-33/CALB-muts的构建

以pGEM-T-CALB质粒为PCR模板，设计表达引物3(GGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTTACCTAGTGGTTCCGACC)、引物4(GGTCTAGATCAATGATGATGATGGTGGTGAGGAGTAACAATTCCTGAA)(下划线为Xho I和Xba I限制性酶切位点)，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得951bp的脂肪酶基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。利用Xho I和Xba I限制性内切酶对扩增片段进行酶切处理，利用T4DNA连接酶将该片段与用相同限制性内切酶处理的pPiczα-A进行连接，构建载体pPiczα-A-CALB。将构建的载体用Sca I线性化，通过电击转化法将线性化的pPiczα-A-CALB导入Pichia pastoris X-33，整合到基因组后获得重组脂肪酶基因工程菌Pichia pastoris X-33/CALB。

定点突变引物设计如下：

Leu140Gly/Ala141Leu：

上游引物15：5’-TCCTGACTACAAAGGTACCGTGGGGCTTGGTCCACTTGA-3’

下游引物16：5’-TGCCAAGGCGTCAAGTGGACCAAGCCCCACGGTACCTTT-3’

Leu144Ser：

上游引物17：5’-GGTACCGTGTTGGCTGGTCCATCTGACGCCTTGGCAGTG-3’

下游引物18：5’-GGAGCGGACACTGCCAAGGCGTCAGATGGACCAGCCAA-3’

Ile189Lys：

上游引物19：5’-CTCAGCTACAGACGAAAAGGTTCAGCCTCAAGTTAG-3’

下游引物20：5’-CTAACTTGAGGCTGAACCTTTTCGTCTGTAGCTGAG-3’

Ile189Arg：

上游引物21：5’-CTCAGCTACAGACGAACGTGTTCAGCCTCAAGTT-3’

下游引物22：5’-AACTTGAGGCTGAACACGTTCGTCTGTAGCTGAG-3’

Ile189Ala：

上游引物23：5’-ACTCAGCTACAGACGAAGCAGTTCAGCCTCAAGTTAG-3’

下游引物24：5’-CTAACTTGAGGCTGAACTACTTCGTCTGTAGCTGAGT-3’

Ile189Asn/Val190Leu：

上游引物25：5’-CTCAGCTACAGACGAAAATCTGCAGCCTCAAGTTAGTAA-3’

下游引物26：5’-GTTACTAACTTGAGGCTGCAGATTTTCGTCTGTAGCTGAG-3’

Ile189His/Val190Leu：

上游引物27：5’-CTCAGCTACAGACGAACATCTTCAGCCTCAAGTTAGTAA-3’

下游引物28：5’-GTTACTAACTTGAGGCTGAAGATGTTCGTCTGTAGCTGA-3’

Ile189Tyr/Val190Leu：

上游引物29：5’-TACTCAGCTACAGACGAATATCTGCAGCCTCAAGTTAG-3’

下游引物30：5’-CTAACTTGAGGCTGCAGATATTCGTCTGTAGCTGAGTA-3’

以pPiczα-A-CALB质粒为模板，通过PCR引入突变，PCR反应程序如下：98℃3min；98℃10s，58℃10s，72℃4min 30s，重复29个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coliDH5α感受态细胞中，涂布于含终浓度100mg/L博来霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h后，随机挑取单菌落进行测序。将构建的载体用Sca I线性化，通过电击转化法将线性化的pPiczα-A-CALB-muts导入Pichia pastoris X-33，整合到基因组后获得重组脂肪酶基因工程菌Pichia pastoris X-33/CALB-muts。

实施例4：野生型及突变体重组脂肪酶的分离纯化

将实施例3构建的野生型及突变体重组脂肪酶基因工程菌，接种至BMGY培养基，在30℃培养12h后，离心转接至BMMY培养基，在30℃下用甲醇诱导72h。离心获得含有目标蛋白的发酵上清液。上清液经超滤膜超滤浓缩后，获得浓缩的酶液。将浓缩酶液与经结合缓冲液平衡过的Ni亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mMNaCl，15mM咪唑)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mMNaCl，500mM咪唑)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(20mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液)透析24h，取截留液用BCA试剂盒测定蛋白含量，并冻存于-80℃冰箱中(图3)，获得野生型及突变体脂肪酶CALB-WT、mut-Ile189Lys、mut-Ile189Arg、mut-Ile189Ala、mut-Ile189Asn/Val190Leu、mut-Ile189His/Val190Leu、Ile189Tyr/Val190Leu、mut-Leu140Gly/Ala141Leu/Ile189Lys、mut-Leu144Ser/Ile189Lys纯酶。

实施例5：脂肪酶酶活力测定

将实施例4中分离纯化得到的野生型及突变体脂肪酶CALB-WT、mut-Ile189Lys、mut-Ile189Arg、mut-Ile189Ala、mut-Ile189Asn/Val190Leu、mut-Ile189His/Val190Leu、Ile189Tyr/Val190Leu、mut-Leu144Ser/Ile189Lys、mut-Leu140Gly/Ala141Leu/Ile189Lys纯酶用于催化底物(外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯)

酶催化体系组成及催化条件如下：1mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.0，)中含有50mM的外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯，加入用相同缓冲溶液稀释的野生型及突变体纯酶，于35℃，800rpm条件下反应。反应一定时间后加入30μL 6M的HCl终止反应，混合均匀后取样萃取，样品处理检测酶活。

表1 CALB野生型及突变体脂肪酶酶活

酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 6.0条件下，1min内消耗1μmol(2R,3S)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯所需的酶量定义为1U。

实施例6：重组野生型脂肪酶CALB在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用

以实施例4中获得的野生型CALB纯酶为生物催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，进行酶法拆分反应制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯。

催化反应体系及催化条件如下：30mL磷酸钠缓冲溶液(pH 6.0)中加入CALB纯酶至终浓度为0.1g/L，初始底物浓度(外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物)为1mol/L(243.26g/L)，35℃水浴，磁力搅拌600rpm，通过自动流加4M NaOH溶液的方式控制pH为6.0，反应定时取样，并通过HPLC分析。催化进程(图4)结果表明催化5h转化率为1.13％。

实施例7：重组脂肪酶突变体mut-Ile189Lys在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用

以实施例4中获得的脂肪酶突变体mut-Ile189Lys纯酶为生物催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，进行酶法拆分反应制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯。

催化反应体系及催化条件如下：30mL磷酸钠缓冲溶液(pH 6.0)中加入mut-Ile189Lys纯酶至终浓度为0.1g/L，初始底物浓度(外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物)为1mol/L(243.26g/L)，35℃水浴，磁力搅拌600rpm，通过自动流加4M NaOH溶液的方式控制pH为6.0，反应定时取样，并通过HPLC分析。催化进程结果(图5)表明催化5h转化率为49.9％，e.e.s>99％。

实施例8：重组脂肪酶突变体mut-Ile189Lys在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用

以实施例4中获得的脂肪酶突变体mut-Ile189Lys纯酶为生物催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，进行酶法拆分反应制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯。

催化反应体系及催化条件如下：30mL磷酸钠缓冲溶液(pH 6.0)中加入mut-Ile189Lys纯酶至终浓度为0.8g/L，初始底物浓度(外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物)为500g/L，35℃水浴，磁力搅拌600rpm，通过自动流加4M NaOH溶液的方式控制pH为6.0，反应定时取样，并通过HPLC分析。催化进程结果(图6)表明催化8h转化率为49.9％，e.e.s>99％。

实施例9：重组脂肪酶突变体mut-Leu144Ser/Ile189Lys在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用

以实施例4中获得的脂肪酶突变体mut-Leu144Ser/Ile189Lys纯酶为生物催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，进行酶法拆分反应制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯。

催化反应体系及催化条件如下：30mL磷酸钠缓冲溶液(pH 6.0)中加入mut-Leu144Ser/Ile189Lys纯酶至终浓度为0.1g/L，初始底物浓度(外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物)为1mol/L(243.26g/L)，35℃水浴，磁力搅拌600rpm，通过自动流加4MNaOH溶液的方式控制pH为6.0，反应定时取样，并通过HPLC分析。催化进程结果(图7)表明催化6h转化率为49.9％，e.e.s>99％。

实施例10：重组脂肪酶突变体mut-Leu140Gly/Ala141Leu/Ile189Lys在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用

以实施例4中获得的脂肪酶突变体mut-Leu140Gly/Ala141Leu/Ile189Lys纯酶为生物催化剂，以外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，进行酶法拆分反应制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯。

催化反应体系及催化条件如下：30mL磷酸钠缓冲溶液(pH 6.0)中加入mut-Leu140Gly/Ala141Leu/Ile189Lys纯酶至终浓度为0.1g/L，初始底物浓度(外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物)1mol/L(243.26g/L)，35℃水浴，磁力搅拌600rpm，通过自动流加4M NaOH溶液的方式控制pH为6.0，反应定时取样，并通过HPLC分析。催化进程结果(图8)表明催化6h转化率为49.9％，e.e.s>99％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组脂肪酶突变体、工程菌及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

ttacctagtg gttccgaccc tgctttctct cagcctaaga gtgtgctgga tgcaggtctt 60

acatgtcaag gtgcatcccc atcttccgtt agtaaaccta ttttactggt tccaggaact 120

ggtactactg gaccacaaag tttcgattct aattggatcc ctctgtccac ccaactagga 180

tatacgccat gttggatttc tcctccacca ttcatgttaa acgatactca agttaacact 240

gagtacatgg ttaacgctat taccgcactt tacgctggtt caggaaacaa taaattgcct 300

gtcttgacct ggtctcaggg tggcttagtc gcccaatggg gactgacatt cttcccttca 360

atcagatcaa aggtcgacag acttatggcc tttgctcctg actacaaagg taccgtgttg 420

gctggtccac ttgacgcctt ggcagtgtcc gctccttccg tctggcaaca aaccacgggt 480

tcagctttga cgactgccct gcgaaatgct ggaggattga ctcaaatagt gcccactact 540

aacctatact cagctacaga cgaaattgtt cagcctcaag ttagtaacag tccactagat 600

tcatcctatc tatttaacgg caagaatgtt caagcacagg cagtctgtgg tcctcttttc 660

gttatcgatc atgcaggatc tttgacatca cagttctcat acgtagtggg tcgatccgcc 720

ttgaggtcaa caacgggtca agccagatct gccgactacg gtatcaccga ttgtaaccct 780

ctgcctgcaa acgatctgac ccctgaacaa aaggtcgctg ccgcagccct gctggctcca 840

gcagctgccg ctatcgttgc tggtccaaaa caaaattgcg aacctgattt aatgccttac 900

gcaagacctt tcgctgtcgg aaagagaacc tgttcaggaa ttgttactcc t 951

<210> 2

<211> 317

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu

1 5 1015

Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys

202530

Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe

354045

Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys

505560

Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr

65707580

Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn

859095

Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln

100 105 110

Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu

115 120 125

Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu

130 135 140

Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly

145 150 155 160

Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro

180 185 190

Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys

195 200 205

Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His

210 215 220

Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala

225 230 235 240

Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr

245 250 255

Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val

260 265 270

Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly

275 280 285

Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe

290 295 300

Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro

305 310 315

一种重组脂肪酶突变体、工程菌及应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。