专利摘要

本发明提供了一种杂色曲霉HY12菌株的培养方法，包括杂色曲霉HY12菌株分生孢子悬浮液的配制和发酵培养。本发明提供的一种杂色曲霉HY12菌株的培养方法，通过对杂色曲霉HY12菌株生长繁殖习性的研究，利用本发明中的培养方法，可在短时间内使得杂色曲霉HY12具有极快的生长繁殖速度，能够产生大量的分生孢子，对斜纹夜蛾具有较高的致畸率和致死率，为后期对斜纹夜蛾的防治奠定实验基础，同时为本领域内其他害虫的防治提供有利的参考。

权利要求

1.一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)HY12菌株的培养方法，其特征在于，所述菌株于2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：14790；其培养方法步骤包括：

(1)杂色曲霉(Aspergillus versicolor)HY12菌株分生孢子悬浮液的配制

将所述杂色曲霉(Aspergillus versicolor)HY12菌株在真菌培养基平板上培养至充分产孢，挑取分生孢子粉，利用Tween 80溶液配制成孢子悬浮液；

(2)发酵培养

将步骤(1)中的所述孢子悬浮液接种至发酵培养基中，于28-30℃、pH5.5-6.0的条件下，光照培养1-2d，即可获得所述杂色曲霉(Aspergillus versicolor)HY12菌株的发酵液。

2.根据权利要求1所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)HY12菌株的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述真菌培养基包括以下重量份数的组分：葡萄糖4份，蛋白胨1份，酵母浸出粉1份，琼脂2份，庆大霉素0.2份，水100份。

3.根据权利要求1所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)HY12菌株的培养方法，其特征在于，所述Tween 80溶液的浓度为0.05％。

4.根据权利要求1所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)HY12菌株的培养方法，其特征在于，所述孢子悬浮液的浓度为108个/mL。

5.根据权利要求1所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)HY12菌株的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖40-50g，蛋白胨5-10g，酵母浸出粉5-10g和水1000mL。

6.根据权利要求1所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)HY12菌株的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基的C/N为20:1。

7.根据权利要求1所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)HY12菌株的培养方法，其特征在于，所述光照条件为12h L:12h D。

8.根据权利要求1所述的一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)HY12菌株的培养方法，其特征在于，所述孢子悬浮液与发酵培养基的体积比为1:100-150。

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是涉及一种杂色曲霉HY12菌株的培养方法。

背景技术

自发明化学农药之后，化学农药以每年5％惊人速度增长。虽然在过去的几十年中，化学农药在农业增产和害虫防治中起到了重要作用，但化学农药的大量使用，带来了严重的“3R”问题(即抗药性Resistance，农药残留Residence，再猖獗Resurgence)，也带来了一系列的生态环境问题。长期大量使用化学农药导致抗药性害虫增加，特别是近10年来，棉铃虫、蚜虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、叶螨类等多发性害虫对菊酯类、有机磷类化学农药的抗药性增加了几百乃至数千倍。化学农药的施用，使农产品中农药残留量增加，严重污染了环境，危及人类建康及生命。随着人们生活水平的提高，人们对环境的要求越来越高，因此迫使人们寻找一种害虫防治替代方法。

斜纹夜蛾(Spodoptera litura)属鳞翅目夜蛾科，危害寄主相当广泛，除十字花科蔬菜外，还可危害包括瓜、茄、豆、葱、韭菜、菠菜以及粮食、经济作物等近100科、300多种植物，是一种重要的农作物害虫，以幼虫咬食叶片、花蕾、花及果实，初龄幼虫啮食叶片下表皮及叶肉，仅留上表皮呈透明斑。斜纹夜蛾4龄以后进入暴食，咬食叶片，仅留主脉，在包心椰菜上，幼虫还可钻入叶球内危害，把内部吃空，并排泄粪便，造成污染，使之降低乃至失去商品价值。斜纹夜蛾虫害在国内各地都有发生，对生产带来了极大的损害。为了规避杀虫剂抗性的问题，也使农民和种植者能够回应消费者对农药残留问题，需要一个有效的方法来控制斜纹夜蛾而不涉及化学药品残留。

因此，研究斜纹夜蛾生长和繁殖特性，提供一种能够感染斜纹夜蛾的菌株，并探索合适培养菌株的方法，使得菌株速度繁殖，为防治斜纹夜蛾提供实验基础是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种杂色曲霉HY12菌株的培养方法，通过对杂色曲霉HY12菌株生长繁殖习性的研究，利用本发明中的培养方法，可在短时间内使得杂色曲霉HY12具有极快的生长繁殖速度，能够产生大量的分生孢子，对斜纹夜蛾的繁衍具有一定的抑制作用，为后期对斜纹夜蛾的防治奠定实验基础，同时为本领域内其他害虫的防治提供有利的参考。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

从烟田斜纹夜蛾为害区采集土样，从土样中于偶然情况下分离获得13个真菌菌株并对真菌进行纯培养，经形态学观察初步鉴定，它们分别为白僵菌属(Beauverja)2株，镰刀菌属(Fusarium)2株，曲霉属(Aspergullus)3株，木霉属(Trichoderma)1株，青霉属(Penicillium)1株，枝孢属(Cladosporium)1株、未鉴定真菌3株。用纯培养的13个菌株接种斜纹夜蛾3龄幼虫后观察，筛选出1株繁殖速度快，对斜纹夜蛾致病性强的菌株。

一种杂色曲霉HY12(Aspergillus versicolor)菌株，该菌株于2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC NO：14790；其培养方法步骤包括：

(1)杂色曲霉HY12菌株分生孢子悬浮液的配制

将所述杂色曲霉HY12菌株在真菌培养基平板上培养至充分产孢，挑取分生孢子粉，利用Tween 80溶液配制成孢子悬浮液；

(2)发酵培养

将步骤(1)中的所述孢子悬浮液接种至发酵培养基中，于28-30℃、pH5.5-6.0的条件下，光照培养1-2d，即可获得所述杂色曲霉HY12菌株的发酵液。

杂色曲霉HY12菌株的生长量随温度的升高而增大，在28℃为最大值，当发酵培养基的温度高于30℃时，菌体生长受到明显抑制；其中当发酵培养基的pH为6时，菌体生长量较大，但随着pH的升高而抑制菌体生长。

进一步的，步骤(1)中所述真菌培养基包括以下重量份数的组分，葡萄糖4份，蛋白胨1份，酵母浸出粉1份，琼脂2份，庆大霉素0.2份，水100份。

进一步的，所述Tween 80溶液的浓度为0.05％。

本发明公开的Tween 80溶液的浓度为0.05％，能够克服真菌疏水性，使孢子分散均匀。

进一步的，所述孢子悬浮液的浓度为108个/mL。

孢子悬浮液能将孢子较好的分散，便于下一步的吸取和接种，设定为108个/mL的浓度，能将孢子较好的分散，便于下一步的吸取和接种，如果孢子悬浮液的浓度过大，则浓影响计数的精确性；反之，浓度过小过则降低接种成功率。

进一步的，所述发酵培养基包括葡萄糖40-50g，蛋白胨5-10，酵母浸出粉5-10g和水1000mL。

进一步的，所述发酵培养基的C/N为20:1。

进一步的，所述光照条件为12h L:12h D。

进一步的，所述孢子悬浮液与发酵培养基的体积比为1:100-150。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种杂色曲霉HY12菌株培养方法，具有如下技术优点：本发明通过对杂色曲霉HY12菌株生长繁殖习性的研究，利用本发明中的培养方法，可在短时间内使得杂色曲霉HY12具有极快的生长繁殖速度，能够产生大量的分生孢子，对斜纹夜蛾具有较高的致畸率和致死率，为后期对斜纹夜蛾的防治奠定实验基础，同时为本领域内其他害虫的防治提供有利的参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的杂色曲霉HY12菌株在实施例2提供的发酵培养基中不同时间内的生长情况。

图2附图为本发明提供的不同温度下杂色曲霉HY12菌株的生长情况；

图3附图为本发明提供的不同pH下杂色曲霉HY12菌株的生长情况；

图4附图为本发明提供的不同碳源下杂色曲霉HY12菌株的生长情况；

图5附图为本发明提供的杂色曲霉HY12菌株在实施例6提供的发酵培养基中不同时间内的生长情况。

图6附图为本发明提供的杂色曲霉HY12菌株在实施例7提供的发酵培养基中不同时间内的生长情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

杂色曲霉HY12菌株筛选

从湘南烟田斜纹夜蛾为害区采集47个土样，其中永州江华25个土样，衡阳16个土样，江永4个土样，宁远2个土样。其中利用5点取样法采集土样，选择两烟株之间的中心距离处作为取土点，用土铲向下切取长10cm、宽10cm、深5cm土壤样品放入无菌的自封塑料袋中，带回实验室，置于冰箱中保存备以分离。详细记录样品采集的时间、地点及相关信息，不同土样要分别进行标记。

将采回的烟田土样在无菌状态下碾碎并充分混合，过目筛后再充分混合，进一步用四分法进行多次取样，直至最终土壤样品量为20-50g。

土壤悬浮液的制备：随机挑取2.5g土壤样品，加入50mL 0.05％吐温-80溶液置于试管中，充分震荡混匀；取出2mL悬浊液加入到另一试管中，再加入8mL 0.05％吐温80溶液中，震荡混匀，从中再取出2mL，加8mL0.05％吐温80溶液，依次类推，悬浊液的浓度分别为0.05、0.01、0.002mg/L；各浓度取0.2mL悬浊液加入到HECK培养基中进行稀释涂布，25.6℃下培养5天。其中HECK培养基包括下列重量份数的组分：葡萄糖4份、蛋白胨2份，高锰酸钾0.025份，放线菌酮0.5份，庆大霉素0.2份，氨苄青霉素0.048份，琼脂2份和水100份。

挑取HECK培养基中的单菌落，然后在SDAY真菌培养基上采用平板划线法进行分离纯化，获得纯化的生长的菌株。其中SDAY培养基为：葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g和水1000mL，共获得13个真菌菌株，经形态学观察初步鉴定，它们分别为白僵菌属(Beauverja)2株，镰刀菌属(Fusarium)2株，曲霉属(Aspergullus)3株，木霉属(Trichoderma)1株，青霉属(Penicillium)1株，枝孢属(Cladosporium)1株、未鉴定真菌3株。将每个菌株保存至斜面试管中编号，保存于4℃冰箱中，后期用于接种试验。以上操作均在超净工作台上保持无菌状态进行。

虫体接种试验

供试试虫采用斜纹夜蛾的3龄幼虫，第一代幼虫采自湖南农业大学耘园基地，连续室内饲养2代后用于试验。

将上述得到的菌株在SDAY平面培养基培养15d充分产孢后，用灭菌水(0.05％吐温-80)配制成3.13×109个/mL的孢子悬浮液。选用虫龄、生长状况一致并且健康的斜纹夜蛾3龄幼虫置于直径为90cm的培养皿中，底部垫有一层吸水纸，用移液枪吸取已配置好的孢子悬浮液均匀滴在虫体体壁周围，以充分接触为宜。待斜纹夜蛾幼虫体壁较干时添加干净红薯叶，然后盖上纱布，置于室温中；同时以灭菌水喷洒斜纹夜蛾体壁作对照，每皿处理10头，每个处理3次重复。

将接种处理后的斜纹夜蛾置于室内常温下培养，每隔6h定量添加新鲜红薯叶，每天定时观察记录斜纹夜蛾的发病和死亡情况，如斜纹夜蛾体壁颜色变化、湿润程度和行为特征和取食情况等。连续观察15d，记录相应的数据，将记录的原始数据，计算各处理中始见虫体死亡时间、虫体的累计死亡率。

其中，对照组的斜纹夜蛾生长发育正常，全部都能正常化蛹。用纯培养的13个菌株接种斜纹夜蛾3龄幼虫后观察，有6个菌株(CZ-6青霉属、YJH2青霉属、HY-7木霉属、HY-9曲霉属、HY-10木霉属和NY-1木霉属)没有引起发病，其取食和生长发育未受到影响。其他7个菌株对斜纹夜蛾表现出不同程度的致病性，见表1。

表1分离出的不同菌株对斜纹夜蛾3龄幼虫的影响

由表1可知，菌株HY12接种斜纹夜蛾15天后的累积死亡率为93.33％，但初见死亡时间为3d，较BS\HL的初见死亡时间分别提前2d、1d，死亡时间每提前1d，将减少害虫对作物造成的损失，这在农业生产实践上是非常有意义的。

利用筛选出的曲霉属菌株(HY12)、孢霉菌属(BS)和枝孢属(HL)，对斜纹夜蛾的毒性测定数据进行毒力回归分析：以虫生真菌对斜纹夜蛾的累积死亡率的概率值为因变量(y)，处理浓度对数为自变量(x)，用多重线性回归方法建立各菌株的毒力回归线性模型，再利用此模型求得致死中浓度(LT50)。其中利用筛选出的菌株做毒力测定试验，利用灭菌水处理后，观察斜纹夜蛾生长发育情况。结果如表2。

表2不同菌株对斜纹夜蛾的毒力测定结果

利用筛选出的曲霉属菌株(HY12)、孢霉菌属(BS)和枝孢属(HL)，分别接种斜纹夜蛾幼虫，统计从接种起到幼虫化蛹的时间，所化蛹的畸形率(12d)及蛹的死亡率(20d)，见表格3。

表3不同菌株对斜纹夜蛾的影响

斜纹夜蛾在接种曲霉属菌株(HY12)后在初期症状没有明显的差异，从第3d开始就开始有幼虫死亡，LT50时间最短为8.14d，从接种第1d起，接种菌株HY12的试虫行动迟缓，提前进入蛹期，化蛹期间试虫畸形率最高，死亡率与其他两种菌相当，但是H12从感染到化蛹的时间缩短为5.73d,在生产实际中，极大地缩短了害虫对作物的为害时间，从而可以挽回部分产量上的损失。

实施例2

杂色曲霉HY12菌株的培养

将实施例1得到的杂色曲霉HY12菌株进行鉴定，杂色曲霉HY12与曲霉属的多株真菌相似性较高，与Aspergillus versicolor相似性系数达到99％，根据rDNA ITS序列，再结合其形态学将菌株HY12鉴定为杂色曲霉真菌(Aspergillus versicolor)，其中杂色曲霉HY12(Aspergillus versicolor)的rDNA ITS区段大小约为500bp；SEQ ID NO.1。

将杂色曲霉HY12菌株在真菌培养基(葡萄糖4份，蛋白胨1份，酵母浸出粉1份，琼脂2份，庆大霉素0.2份，水100份)平板上培养至充分产孢，挑取分生孢子粉，利用0.05％Tween80溶液配制成浓度为108个/mL孢子悬浮液；将10ml的孢子悬浮液接种至1L的发酵培养基(葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g和水1000mL)中，于28℃、pH6.0的条件下，12h L:12h D光照条件下培养2d，即可获得所述杂色曲霉HY12菌株的发酵液。在不同发培养时间段内用分光光度计测OD600nm值并记录结果，结果如图1。

实施例3

本实施例中，杂色曲霉HY12菌株在发酵培养基中的培养温度分别为15、20、22、25、28、30和35，用分光光度计测OD600nm值并记录结果，每组重复3次，统计各发酵培养基中菌体生长达最大值，其他技术特征与实施例2相同。结果如图2所示，由图2可知，发酵培养基的温度在28℃为最大值，OD600nm为0.833；当温度高于30℃时，杂色曲霉HY12菌株生长受到明显抑制。

实施例4

本实施例中，杂色曲霉HY12菌株在发酵培养基中的pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8、8.5和9，用分光光度计测OD600nm值并记录结果，每组重复3次，统计各发酵培养基中菌体生长达最大值，其他技术特征与实施例2相同。结果如图3所述，由图3可知，发酵培养基的pH为6.0时，杂色曲霉HY12菌株的生长量最大。

实施例5

本实施例中，将发酵培养基中的葡萄糖，分别利用等量的蔗糖、麦芽糖和乳糖进行替换，用分光光度计测OD600nm值并记录结果，每组重复3次，统计各发酵培养基中菌体生长达最大值，其他技术特征与实施例2相同。结果如图4，由图4可知，杂色曲霉HY12菌株在葡萄糖培养基上的产孢量最多，分别达到1.22×109/mL。

实施例6

将杂色曲霉HY12菌株在真菌培养基(麦芽糖4份，蛋白胨1份，酵母浸出粉1份，琼脂2份，庆大霉素0.2份，水100份)平板上培养至充分产孢，挑取分生孢子粉，利用0.05％Tween80溶液配制成浓度为108个/mL孢子悬浮液；将10ml的孢子悬浮液接种至1.5L的发酵培养基(麦芽糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g和水1000mL)中，于30℃、pH5.5的条件下，12h L:12h D光照条件下培养2d，用分光光度计测OD600nm值并记录结果，每组重复3次，统计杂色曲霉HY12菌株的最大生长量，结果如图5所示。

实施例7

将杂色曲霉HY12菌株在真菌培养基(乳糖4份，蛋白胨1份，酵母浸出粉1份，琼脂2份，庆大霉素0.2份，水100份)平板上培养至充分产孢，挑取分生孢子粉，利用0.05％Tween80溶液配制成浓度为108个/mL孢子悬浮液；将10ml的孢子悬浮液接种至1.2L的发酵培养基(乳糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g和水1000mL)中，于28℃、pH6的条件下，8h L:16h D光照条件下培养2d，用分光光度计测OD600nm值并记录结果，每组重复3次，统计杂色曲霉HY12菌株的最大生长量，结果如图6所示。

本发明提供了一种杂色曲霉HY12菌株的培养方法，通过对杂色曲霉HY12菌株生长繁殖习性的研究，利用本发明中的培养方法，可在短时间内使得杂色曲霉HY12具有极快的生长繁殖速度，能够产生大量的分生孢子，对斜纹夜蛾的蛹具有较高的死亡率和畸形率，为后期对斜纹夜蛾的防治奠定实验基础，同时为本领域内其他害虫的防治提供有利的参考。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种杂色曲霉HY12菌株的培养方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggctggcgcc cggccggccc taatcgagcg ggtgacaaag ccccatacgc tcgaggaccg 60

gacacggtgc cgccgctgcc ttttgggccc gtcccccggg ggggacgacg acccaacaca 120

caagccgggc ttgatgggca gcaatgacgc tcggacaggc atgccccccg gaatgccagg 180

gggcgcaatg tgcgttcaaa gactcgatga ttcactgaat tctgcaattc acattactta 240

tcgcagttcg ctgcgttctt catcgatgcc ggaaccaaga gatccattgt tgaaagtttt 300

gactgatttt atattcaaac tcaaactgca tcactctcag gcatgaagtt cagtagtccc 360

cggcggctcg cccccgagag ggctccccgc caaagcaaca gtgttaggta gtcacgggtg 420

ggaggttggg cgcccg 436

一种杂色曲霉HY12菌株的培养方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。