专利摘要

本发明提供了一种在脉冲磁场三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法。本发明通过在磁场三相流化床中应用脉冲磁场，调控脉冲磁场的磁场强度、磁场作用时间、气体流速和液体流速等参数即可有效地提高磁性固定化纤维素酶的酶活力和利用率。通过本发明所述方法使用的磁性固定化纤维素酶稳定性好，回收后可以重复使用，重复利用9次，酶活回收率＞42％。本发明由于可以提高磁性固定化纤维素酶的酶活和利用率，有效地降低了成本，同时可以提高高分子物质的降解率，为实现连续化生产提供了依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高磁性固定化酶酶活和利用率的方法，特别涉及一种在脉冲磁场三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法。

背景技术

目前，大分子高粘度物质(例如天然壳聚糖大分子物系)降解方法主要有：化学法、物理法和酶解法等在内的多种方法。由于酶法降解具有可特异性地、选择性、易于控制，及对环境基本不造成污染等优点，因此，酶解法是较理想的方法。

而在固定化酶工程中，由于小颗粒具有较高的固定化比表面积，因此，小颗粒常常被用来作为固定化酶载体。但是，对于普通的固定化酶反应器——固定化床反应器来说，小颗粒载体通常主要会造成固定化床过高的压力降、且小颗粒还会带来流动性和稳定性问题。一般而言，上述问题可以通过使用流化床酶反应器解决，在流化床反应器中使用磁性小颗粒作为固定化酶载体，并运用磁场来解决流动性和稳定性等问题。在包含有磁性载体的流化床中应用磁场，微粒降受到磁场的影响，流化床的流动特性也将随着磁场强度和粒子特性而改变，而对于固定化酶反应体系而言，这些新的特性带来一定益处，如：可以提高酶的使用率。

然而，在这样的体系中，酶的活性不可避免地将受到影响。特别是由于酶的价格比较贵，专一性酶的价格更是昂贵，因而大大增加了生产成本。因此，寻求一种能够降低生产成本，即提高酶活或提高酶重复利用率的方法成为研究的热点。

而目前关于在三相流化床中施加脉冲磁场对酶活力变化方面的研究国内外鲜见报导。而磁场对酶活的影响，在酶反应体系中是非常重要的参数，因此，有必要对该反应体系做详细研究，为固定化酶工程的发展提供参考价值。目前，常用的固定化酶反应器中存在着酶使用率低、并且不利于酶的回收等问题。

发明内容

为了克服现有的流化床酶反应器中固定化酶酶活低、酶重复利用率低以及酶回收困难的不足和缺陷，本发明的首要目的在于提供一种在脉冲磁场三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法。该方法通过使用磁场三相(气、液、固)流化床酶解反应器(见申请日为2007年12月14日、专利号为200720061568.X、名称为“磁场三相流化床酶解反应器”的实用新型专利)来提高固定化酶酶活和酶的重复利用率。磁场的施加可以使得磁性固定化酶在一定区域内运动，而通入的气体对大分子底物粘稠物系起着类似搅拌的作用及气体对物系表观粘度的具有降低作用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种在脉冲磁场三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法，包括如下步骤：将磁性固定化纤维素酶加入到磁场三相流化床酶解反应器中，施加磁场强度为0.5～2.5kA/m的脉冲磁场，再将流速1～10mL/min气体鼓入磁场三相流化床酶解反应器，同时，将流速为1～10mL/min的反应溶液通入磁场三相流化床反应器，反应200～400min结束反应；使用后的磁性固定化纤维素酶回收后用去离子水冲洗至少3次，冷冻干燥，置于4℃保存，备用。

所述的反应溶液为含有可被所述磁性固定化纤维素酶降解的底物的缓冲溶液；底物的分子量为60000～100000；

所述的底物优选为壳聚糖；

所述的缓冲溶液优选为乙酸溶液；

所述的反应溶液优选为pH为4.0～5.0、浓度为30～50mg/mL的壳聚糖乙酸溶液；其中溶质是壳聚糖，溶剂是体积百分比为0.1～1％的乙酸溶液；

所述磁性固定化纤维素酶的加入量优选为50～250g；

所述的磁性固定化纤维素酶通过以下步骤制备得到：

(1)壳聚糖乙酸溶液的配制

用体积百分比为0.1～1％的乙酸溶液与壳聚糖溶液配置30～50mg/mL的壳聚糖乙酸溶液，用碱调pH为4.0～5.0，得到壳聚糖乙酸溶液；

(2)磁性壳聚糖微球的制备

在200～300mL壳聚糖乙酸溶液中加入3.5～5.0g Fe₃O₄粉末，搅拌混合均匀，加入10～20mL Span-80(司班-80)、300～400mL石蜡，待分散均匀后，在40～60℃条件下加入10～20mL戊二醛，搅拌反应3～5h，得到磁性微球，静置冷却至室温，冲洗磁性微球，用磁场收集磁性微球，于60～65℃干燥筛分，得到磁性壳聚糖微球；

(3)磁性固定化纤维素酶的制备

将5.0～7.0g磁性壳聚糖微球加入250～300mL的0.2～0.5mol/L磷酸钠缓冲液中溶胀1～2小时，再加入100～200mL的2.0mg/mL纤维素酶液，于15～20℃以50～100rpm的速度振荡，让磁性壳聚糖微球吸附纤维素酶，6～16h后，在磁场作用下，将磁性壳聚糖微球沉淀，去上清液，用0.2～0.5mol/L磷酸钠缓冲液反复冲洗磁性壳聚糖微球，直至洗液中检测不到蛋白为止，即得到磁性固定化纤维素酶。

所述的磁性固定化纤维素酶更优选通过以下步骤制备得到：

(1)壳聚糖乙酸溶液的配制

用体积百分比为0.1～0.8％的乙酸溶液与壳聚糖溶液配置40～50mg/mL的壳聚糖乙酸溶液，用碱调pH为4.0～5.0，得到壳聚糖乙酸溶液；

(2)磁性壳聚糖微球的制备

在200～250mL壳聚糖乙酸溶液中加入4.0～5.0g Fe₃O₄粉末，搅拌混合均匀，加入12～20mL Span-80(司班-80)、320～400mL石蜡，待分散均匀后，在40～55℃条件下加入10～20mL戊二醛，搅拌反应3～5h，得到磁性微球，静置冷却至室温，冲洗磁性微球，用磁场收集磁性微球，于60～65℃干燥筛分，得到磁性壳聚糖微球；

(3)磁性固定化纤维素酶的制备

将5.5～7.0g磁性壳聚糖微球加入260～300mL的0.2～0.4mol/L磷酸钠缓冲液中溶胀1～1.5小时，再加入100～200mL的2.0mg/mL纤维素酶液，于15～18℃以50～90rpm的速度振荡，让磁性壳聚糖微球吸附纤维素酶，6～16h后，在磁场作用下，将磁性壳聚糖微球沉淀，去上清液，用0.2～0.4mol/L磷酸钠缓冲液反复冲洗磁性壳聚糖微球，直至洗液中检测不到蛋白为止，即得到磁性固定化纤维素酶。

步骤(1)中所述的碱优选为磷酸氢二钠；

步骤(2)中所述冲洗磁性微球是用石油醚、无水乙醇依次冲洗磁性微球。

本发明的原理：在脉冲磁场作用下，脉冲磁场对酶先是产生激活作用，紧接着磁场产生瞬间停顿，可使酶分子结构向更有利于提高酶活的构象伸展，如此反复，激活了酶的活性中心；同时，脉冲磁场对反应体系中物质如此反复的作用也可产生类似振动的现象，仍促进了酶与底物的接触机会，增加了传质速率。另外，通入的气体对大分子底物粘稠物系起着类似搅拌的作用及气体对物系表观粘度的具有降低作用，降低了传质阻力，增大了底物、固定化酶和产物之间的传质速率，宏观表现则是增大了酶活。在包含有磁性载体的流化床中应用磁场，磁性固定化纤维素酶有规则地分布在脉冲磁场三相流化床中以及易于回收，有效地提高磁性固定化纤维素酶的利用率。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)本发明操作简单，通过调控磁场三相流化床中的磁场强度、磁场作用时间、气体流速和液体流速等参数即可有效地提高磁性固定化纤维素酶的酶活力和利用率。

(2)通过本发明所述方法使用的磁性固定化纤维素酶稳定性好，回收后可以重复使用，重复利用9次，酶活回收率＞42％(如图4所示)。

(3)本发明由于可以提高磁性固定化纤维素酶的酶活和利用率，有效地降低了成本，同时可以提高高分子物质的降解率，为高分子、粘稠物质实现连续化降解提供了理论依据。

附图说明

图1为磁场强度(H)对磁性固定化纤维素酶酶活力的影响图。

图2为非磁场三相流化床条件下，磁场对磁性固定化纤维素酶活的影响图。

图3为气速(Ug)对磁性固定化纤维素酶酶活力的影响图。

图4为磁性固定化纤维素酶酶活回收率变化图。

图5为液速(U₁)对磁性固定化纤维素酶酶活力的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)壳聚糖乙酸溶液的配制

用体积百分比为0.1％的乙酸溶液与壳聚糖溶液(壳聚糖分子量为10万)配制30mg/mL的壳聚糖乙酸溶液，用Na₂HPO₄调pH值为4.0～5.0，得到壳聚糖乙酸溶液；

(2)磁性壳聚糖微球的制备

在1000mL烧瓶中加入200mL壳聚糖乙酸溶液中，再加入3.5g Fe₃O₄粉末，搅拌混合均匀，加入10mL司班-80、300mL石蜡，待分散均匀后，在40℃条件下加入5.0mL戊二醛，搅拌反应1h后，再滴加5.0mL戊二醛，继续反应3h后，得到磁性微球，静置冷却至室温，用石油醚、无水乙醇依次冲洗磁性微球，用磁场收集磁性微球，于60℃烘箱烘干、筛分，得到干燥的磁性壳聚糖微球。

(3)磁性固定化纤维素酶的制备

将5.0g磁性壳聚糖微球加入250mL 0.2mol/L磷酸钠缓冲液中溶胀1小时，加入100mL的2.0mg/mL纤维素酶液，在15℃、50rpm的恒温振荡器上反应制备磁性固定化纤维素酶，6h后，在磁场作用下，将磁性壳聚糖微球沉淀，用0.2mol/L磷酸钠缓冲液反复冲洗磁性壳聚糖微球，直至洗液中用凯氏定氮法检测不到蛋白为止；得到磁性固定化纤维素酶，将磁性固定化纤维素酶冷冻干燥。

(4)提高磁性固定化纤维素酶的酶活

在磁场三相流化床酶解反应器中加入50g磁性固定化纤维素酶，连接好实验装置，在0.2MPa操作压力下，分别施加H＝0，0.5，1.0，1.5，2.5kA/m的脉冲磁场，再将流速为5mL/min的气体鼓入磁场三相流化床酶解反应器，同时，将流速为5mL/min(U₁)的步骤(1)制备的壳聚糖乙酸溶液通入磁场三相流化床反应器中，反应200min。将不同磁场强度条件下反应得到的产物(即低聚壳聚糖)用DNS法测定还原糖含量计算磁性固定化纤维素酶酶活力的变化。酶活力单位指1g固体纤维素酶，1min水解反应溶液(如壳聚糖乙酸溶液)底物，产生出1μmoL还原糖量为1个酶活力单位，以IU/g表示。

如图1所示，在实验磁场强度范围内，施加脉冲的磁场三相流化床反应器中，磁场的作用有助于提高酶的活性。随着磁场强度的增加，磁性固定化纤维素酶酶活力呈现快速增加的变化趋势，当H＝1.5kA.m^-1时，酶活力比初始值增大了将近70％。分析认为，在脉冲磁场作用下，脉冲磁场对酶先是产生激活作用，紧接着磁场产生瞬间停顿，可使酶分子结构向更有利于提高酶活的构象伸展，如此反复，激活了酶的活性中心；同时，脉冲磁场对反应体系中物质如此反复的作用也可产生类似振动的现象，仍促进了酶与底物的接触机会，增加了传质速率。两种作用的结果表现为脉冲磁场条件下，酶活快速增长。而同时在非磁场三相流化床条件下，考察了磁场对磁性固定化纤维素酶酶活力影响，结果如图2所示，发现随着磁场强度的增加，磁性固定化纤维素酶酶活力呈下降趋势。这说明，磁场三相流化床有助于提高磁性固定化纤维素酶酶活力。

实施例2

(1)壳聚糖乙酸溶液的配制

用体积百分比浓度1％的乙酸溶液与壳聚糖溶液(壳聚糖分子量为10万)配制50mg/mL的壳聚糖乙酸溶液，用Na₂HPO₄调pH为4.0～5.0，得到壳聚糖乙酸溶液。

(2)磁性壳聚糖微球的制备

在1000mL烧瓶中加入300mL壳聚糖乙酸溶液中，再加入5.0g Fe₃O₄粉末，搅拌混合均匀，加入20mL司班-80、400mL石蜡，待分散均匀后，在40℃条件下加入10.0mL戊二醛，搅拌反应1h后，升温至60℃再滴加10.0mL戊二醛，继续反应4h后，得到磁性微球，静置冷却至室温，用石油醚、无水乙醇依次冲洗磁性微球，用磁场收集磁性微球，于65℃烘箱烘干、筛分，得到干燥的磁性壳聚糖微球。

(3)磁性固定化纤维素酶的制备

将7.0g磁性壳聚糖微球加入300mL 0.2mol/L磷酸钠缓冲液中溶胀2小时，加入200mL的2.0mg/mL纤维素酶液，在20℃、100rpm的恒温振荡器上反应制备磁性固定化纤维素酶，12h后，在磁场作用下，将磁性壳聚糖微球沉淀，用0.5mol/L磷酸钠缓冲液反复冲洗磁性壳聚糖微球，直至洗液中用凯氏定氮法检测不到蛋白为止；得到磁性固定化纤维素酶，将磁性固定化纤维素酶冷冻干燥。

(4)提高磁性固定化纤维素酶的酶活

在磁场三相流化床酶解反应器中加入250g磁性固定化纤维素酶，连接好实验装置，在0.2MPa操作压力下，施加2.5kA/m的脉冲磁场，分别将流速Ug＝0，3，4，5，6，10mL/min气体鼓入磁场三相流化床酶解反应器，同时，将流速为8mL/min(U₁)的壳聚糖乙酸溶液通入磁场三相流化床反应器中，反应400min。将不同磁场强度条件下反应得到的产物(即低聚壳聚糖)用DNS法测定还原糖含量计算磁性固定化纤维素酶酶活力的变化。如图3所示，在适宜的操作范围内，随着气速的增加，固定化酶酶活力也呈上升趋势变化。这是因为，随着气速的增加，高分子底物的湍流强调增加，减少了边界层(Nernst层)厚度，降低了传质阻力，增大了底物、固定化酶和产物之间的传质速率，宏观表现则是增大了酶活。即气体的引入起到了类似“搅拌”的作用，增强了床层的混合程度，Nernst层厚度变薄，增加了壳聚糖底物、产物和固定化酶颗粒的传质速度，即提高了酶活力。

实施例3

(1)壳聚糖乙酸溶液的配制

用体积百分比浓度0.5％的乙酸溶液与壳聚糖溶液(壳聚糖分子量为10万)配置40mg/mL的壳聚糖乙酸溶液，用Na₂HPO₄调pH为4.0～5.0，得到壳聚糖乙酸溶液。

(2)磁性壳聚糖微球的制备

在1000mL烧瓶中加入300mL壳聚糖乙酸溶液中，再加入4.0g Fe₃O₄粉末，搅拌混合均匀，加入15mL司班-80、350mL石蜡，待分散均匀后，在40℃条件下加入8.0mL戊二醛，搅拌反应1h后，再滴加5.0mL戊二醛，继续反应4h后，得到磁性微球，静置冷却至室温，用石油醚、无水乙醇依次冲洗磁性微球，用磁场收集磁性微球，于60℃烘箱烘干、筛分，得到干燥的磁性壳聚糖微球。

(3)磁性固定化纤维素酶的制备

将6.0g磁性壳聚糖微球加入250mL 0.5mol/L磷酸钠缓冲液中溶胀1.5小时，加入150mL的2.0mg/mL纤维素酶液，在15℃、80r/min的恒温振荡器上反应制备磁性固定化纤维素酶，16h后，在磁场强度50～100kA/m的磁场作用下，将磁性壳聚糖微球沉淀，用0.3mol/L磷酸钠缓冲液反复冲洗磁性壳聚糖微球，直至洗液中用凯氏定氮法检测不到蛋白为止；得到磁性固定化纤维素酶，将磁性固定化纤维素酶冷冻干燥。

(4)提高磁性固定化纤维素酶的酶活和利用率

在磁场三相流化床酶解反应器中加入80g磁性固定化纤维素酶，连接好实验装置，在0.15MPa操作压力下，分别施加1.0kA/m的脉冲磁场，再将流速8mL/min气体鼓入磁场三相流化床酶解反应器，同时，将流速为6mL/min(U₁)的反应溶液(如壳聚糖乙酸溶液)通入磁场三相流化床反应器中，反应240min。将不同磁场强度条件下反应得到的产物(如低聚壳聚糖)用DNS法测定还原糖含量计算磁性固定化纤维素酶酶活力的变化。将使用后的磁性固定化纤维素酶重复使用，磁性固定化纤维素酶使用后用去离子水反复冲洗，经冷冻干燥于4℃冰箱即可再次使用，每次使用后都如此操作。重复使用后，测定酶活力，计算酶活力回收率。

如图4所示，磁性固定化纤维素酶经重复使用9次后，酶活力回收率＞42％。同时，由图4可以看出，使用5次后酶活力仍大于磁性固定化酶酶活力的50％，说明本方法制备的磁性固定化酶稳定性较好，可以重复使用，从而达到降低成本的目的。

实施例4

(1)壳聚糖乙酸溶液的配制

用体积百分比浓度0.8％的乙酸溶液与壳聚糖溶液(壳聚糖分子量为6万)配制50mg/mL的壳聚糖乙酸溶液，用Na₂HPO₄调pH为4.0～5.0，得到壳聚糖乙酸溶液。

(2)磁性壳聚糖微球的制备

在1000mL烧瓶中加入250mL壳聚糖乙酸溶液中，再加入4.0g Fe₃O₄粉末，搅拌混合均匀，加入12mL司班-80、320mL石蜡，待分散均匀后，在55℃条件下加入10.0mL戊二醛，搅拌反应1h后，再滴加10.0mL戊二醛，继续反应2h后，得到磁性微球，静置冷却至室温，用石油醚、无水乙醇依次冲洗磁性微球，用磁场收集磁性微球，于65℃烘箱烘干、筛分，得到干燥的磁性壳聚糖微球。

(3)磁性固定化纤维素酶的制备

将5.5g磁性壳聚糖微球加入260mL 0.4mol/L磷酸钠缓冲液中溶胀1.5小时，加入200mL的2.0mg/mL纤维素酶液，在18℃、90rpm的恒温振荡器上反应制备磁性固定化纤维素酶，15h后，在磁场作用下，将磁性壳聚糖微球沉淀，用0.4mol/L磷酸钠缓冲液反复冲洗磁性壳聚糖微球，直至洗液中用凯氏定氮法检测不到蛋白为止；得到磁性固定化纤维素酶，将磁性固定化纤维素酶冷冻干燥。

(4)提高磁性固定化纤维素酶的酶活

在磁场三相流化床酶解反应器中加入100g磁性固定化纤维素酶，连接好实验装置，在0.2MPa操作压力下，施加1.5kA/m的脉冲磁场，分别将流速(U₁)为3，4，5，6，10mL/min的壳聚糖乙酸溶液通入磁场三相流化床反应器，同时，将5mL/min流速气体鼓入磁场三相流化床酶解反应器中，反应400min。将不同流速的壳聚糖乙酸溶液下反应得到的产物(即低聚壳聚糖)用DNS法测定还原糖含量计算磁性固定化纤维素酶酶活力的变化。

如图5所示，实验结果表明，随着U₁的增大，磁性固定化纤维素酶酶活力升高得越来越快。分析认为，加速了液相的湍流强度，减少了边界层(Nernst层)厚度，加速了壳聚糖底物与固定化酶的传质速率，同时产物由固定化酶微环境到达溶液主体的速度亦将随着U₁的增加而加快，从而降低了底物和产物的扩散限制效应。这意味着，在一定范围内，增大U₁可以加速固定化酶表面底物和产物的传质速率，宏观表现则是酶活的增加。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

在脉冲磁场三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。