专利摘要
本发明公开了药用真菌赤芝中两种具有保肝活性的三萜化合物的制备方法和应用，所述两种三萜化合物即化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的结构式分别如I和Ⅱ所示：所述两种三萜化合物的制备方法是以赤芝的子实体为原料，用化学溶剂提取、萃取，经过正相柱色谱初步分离，MCI色谱脱色，再用正相柱色谱分离，然后用半制备HPLC分离获得。所述应用为上述两种三萜化合物在制备肝脏保护药物中的用途。本发明首次从赤芝中分离得到三萜甲基灵芝酸C和3β,7β‑二羟基‑11,15,23‑三羰基‑羊毛甾烷‑8,16‑二烯‑26‑羧酸，本制备方法简单，纯化度高；另外，本发明首次发现上述三萜化合物具有较好的保肝活性，为此类三萜化合物类物质的提取以及药用研究提供了基础及新思路。
权利要求
1.两种三萜化合物的制备方法，所述两种三萜化合物的结构式分别如Ⅰ和Ⅱ所示：
ⅠⅡ；
其特征在于，具体包括以下步骤：
(1) 有机溶剂超声提取：把赤芝子实体晒干，粉碎至60-100目，在室温下用第一有机溶剂浸泡后超声提取2-4次，每次20-40分钟，合并提取液，浓缩后得到赤芝浸膏a；所述第一有机溶剂为85%-99%的乙醇或85%-99%的甲醇；
(2) 有机溶剂萃取：将所述浸膏a倒入分液漏斗中，加入浸膏重量1-3倍的水和第二有机溶剂，搅拌均匀后摇动，充分静置，待溶液分液后取有机溶剂层，反复3次，合并有机溶剂层，减压蒸馏得到赤芝浸膏b；所述第二有机溶剂为85%-99%的二氯甲烷或85%-99%的乙酸乙酯；
(3) 正相色谱法分离：将所述浸膏b 用硅胶柱层析分离，用体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/丙酮进行梯度洗脱，经薄层色谱和紫外光谱分析检测后合并相似组分得到6个组分A-F；其中，硅胶柱的装柱方法如下：将浸膏b用85%-99%的二氯甲烷搅拌均匀，加入样品量1-3倍量的80-100目的硅胶晾干，用样品量12-39倍的100-200目的硅胶安装色谱柱；
(4) MCI柱色谱脱色：取组分D用MCI柱色谱脱色，用43%-89%甲醇水溶液为洗脱剂，用薄层色谱和紫外光谱分析检测后合并相似的组分，得到组分D1-D5；
(5) 正相柱色谱分离：将组分D4用硅胶柱层析分离，用体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/丙酮进行梯度洗脱，然后用薄层色谱分析合并相似组分收集得到组分到D4a-D4f；其中，硅胶柱的装柱方法如下：将组分D4用85%-99%的乙酸乙酯溶解后和样品量1-3倍量的80-100目硅胶搅拌均匀，晾干后用样品量12-39倍的100-200目的硅胶安装色谱柱；
(6) 半制备HPLC纯化：采用9.4×250 mm，10 μm的Zorbax SB-C
2.两种三萜化合物在制备肝脏保护药物中的用途，所述两种三萜化合物的结构式分别如Ⅰ和Ⅱ所示：
ⅠⅡ；
其特征在于，所述三萜化合物的药物剂型为片剂、胶囊剂、口服液、口含片、颗粒剂、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
说明书
技术领域
本发明属于天然产物化学技术领域，具体涉及赤芝中两种具有保护肝脏活性的三萜化合物的制备方法和应用。
背景技术
由于环境污染、过度饮食、过度饮酒、食品添加剂滥用等因素使肝病发病率不断升高，导致我国肝炎、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等疾病的较高发病率，严重威胁人类健康。到目前为止，一些保肝药物的药效不能让人满意，我们仍然缺乏高效、无明显毒副作用的保肝药物，而天然药物的保肝活性研究却显现了广阔的运用前景。因此，开发活性更佳、治疗效果更好的肝病治疗药物是研究人员亟需解决的问题。
灵芝是我国著名的中药，有上千年的药用历史，被用来治疗各种疾病。经过现代植物化学方法的研究，从灵芝属各种真菌中发现了400多种三萜类化合物，它们主要为C30、C27、C25和C24羊毛甾烷型三萜，这些三萜具有保肝、抗炎、细胞毒性、抗病毒和α葡萄糖苷酶抑制等活性。
灵芝属真菌赤芝(Ganoderma lucidum)具有增益心气、调节免疫抗衰老、清除自由基、抗肿瘤等作用，该真菌目前主要含有多糖、三萜和杂萜等化学成分，其中的赤芝多糖具有较强的抗氧化活性，赤芝能够将无机硒转化为有机硒而具有较强的抗氧化活性，赤芝中的富硒蛋白能抑制肝癌HepG2细胞的扩散和发展，有一定抗肝癌的作用。本发明旨在从赤芝中分离得到具有保肝活性的化合物，为保肝药物的开发提供新的途径与思路。
发明内容
本发明的第一目的是提供赤芝中两种具有保肝活性的三萜化合物，本发明的第二目的是提供所述两种三萜化合物的制备方法，本发明的第三目的是提供所述两种三萜化合物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述两种三萜化合物即化合物I和化合物II的结构式分别如I和II所示，化合物I的分子式为C31H48O7，命名为三萜甲基灵芝酸C，英文名为methyl ganoderate C；所述化合物II的分子式为C30H42O7，命名为3β,7β-二羟基-11,15,23-三羰基-羊毛甾烷-8,16-二烯-26-羧酸，英文名为3β,7β-dihydroxy-11,15,23-trioxo-lanost-8,16-dien-26-oicacid。
所述三萜化合物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)有机溶剂超声提取：把赤芝子实体晒干，粉碎至60-100目，在室温下用第一有机溶剂浸泡后超声提取2-4次，每次20-40分钟，合并提取液，浓缩后得到赤芝浸膏a。
(2)有机溶剂萃取：将所述浸膏a倒入分液漏斗中，加入浸膏重量1-3倍的水和第二有机溶剂，搅拌均匀后摇动，充分静置，待溶液分液后取有机溶剂层，反复3次，合并有机溶剂层，减压蒸馏得到赤芝浸膏b；
(3)正相色谱法分离：将所述浸膏b用硅胶柱层析分离，用体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/丙酮进行梯度洗脱，经薄层色谱和紫外光谱分析检测后合并相似组分得到6个组分A-F；
(4)MCI柱色谱脱色：取组分D用MCI柱色谱脱色，用43％-89％甲醇水溶液为洗脱剂，用薄层色谱和紫外光谱分析检测后合并相似的组分，得到组分D1-D5；
(5)正相柱色谱分离：将组分D4用硅胶柱层析分离，用体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/丙酮进行梯度洗脱，然后用薄层色谱分析合并相似组分收集得到组分到D4a-D4f；
(6)半制备HPLC纯化：将组分D4c经半制备HPLC分离纯化，即得化合物I和化合物II。
所述两种三萜化合物的应用为在制备肝脏保护药物中的用途，所述三萜化合物的药物剂型为片剂、胶囊剂、口服液、口含片、颗粒剂、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
本发明的有益效果为：
本发明首次从赤芝中分离得到两种具有保肝活性的三萜化合物，即三萜甲基灵芝酸C和3β,7β-二羟基-11,15,23-三羰基-羊毛甾烷-8,16-二烯-26-羧酸，为这两个三萜化合物的制备提供了新的制备途径，本制备方法操作简单，获得的三萜甲基灵芝酸C及3β,7β-二羟基-11,15,23-三羰基-羊毛甾烷-8,16-二烯-26-羧酸纯度均高达95％-97％；另外，本发明首次发现三萜甲基灵芝酸C和3β,7β-二羟基-11,15,23-三羰基-羊毛甾烷-8,16-二烯-26-羧酸具有较好的保肝活性，通过保肝活性筛选，三萜甲基灵芝酸C和3β,7β-二羟基-11,15,23-三羰基-羊毛甾烷-8,16-二烯-26-羧酸的体外保肝活性高于阳性对照双环醇42％的成活率，对人类肝细胞HL-7702成活率分别为44％和46％，具有较好的肝保护作用，可作为保肝药物的先导性化合物用于保肝药物制剂的研发，在保肝药物研究领域开发有很好的应用前景，也为此类三萜化合物类物质的提取以及药用研究提供了基础及新思路。
附图说明
图1为本发明实施例1中化合物I的
图2为本发明实施例1中化合物I的DEPT谱图；
图3为本发明实施例1中化合物II的
图4为本发明实施例1中化合物II的DEPT谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明赤芝中两种具有保肝活性的三萜化合物，所述两种三萜化合物即化合物I和化合物II的结构式分别如I和II所示：
所述两种三萜化合物的制备方法为：以赤芝的子实体为原料，用溶剂提取、萃取，经MCI脱色后再用正相柱色谱分离，最后用半制备HPLC分离得到化合物I和化合物II。
所述方法具体包括以下步骤：
(1)有机溶剂超声提取：把赤芝子实体晒干，粉碎至60-100目，在室温下用第一有机溶剂浸泡后超声提取2-4次，每次20-40分钟，合并提取液，浓缩后得到赤芝浸膏a。
(2)有机溶剂萃取：将所述浸膏a倒入分液漏斗中，加入浸膏重量1-3倍的水和第二有机溶剂，搅拌均匀后摇动，充分静置，待溶液分液后取有机溶剂层，反复3次，合并有机溶剂层，减压蒸馏得到赤芝浸膏b；
(3)正相色谱法分离：将所述浸膏b用硅胶柱层析分离，用体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/丙酮进行梯度洗脱，经薄层色谱和紫外光谱分析检测后合并相似组分得到6个组分A-F；
(4)MCI柱色谱脱色：取组分D用MCI柱色谱脱色，用43％-89％甲醇水溶液为洗脱剂，用薄层色谱和紫外光谱分析检测后合并相似的组分，得到组分D1-D5；
(5)正相柱色谱分离：将组分D4用硅胶柱层析分离，用体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/丙酮进行梯度洗脱，然后用薄层色谱分析合并相似组分收集得到组分到D4a-D4f；
(6)半制备HPLC纯化：将组分D4c经半制备HPLC分离纯化，即得化合物I和化合物II。
所述步骤1中，第一有机溶剂为85％-99％的乙醇或85％-99％的甲醇。
所述步骤2中，第二有机溶剂为85％-99％的二氯甲烷或85％-99％的乙酸乙酯。
所述步骤6中，所述半制备HPLC采用的流动相是45％-89％的甲醇/水溶液或34％-85％的乙腈/水溶液，半制备柱是9.4×250mm，10μm的Zorbax SB-C18，DAD检测器波长为204nm、210nm、254nm和306nm，流速为1-5mL/min，进样量为22-1000μL。
所述步骤3中，硅胶柱的装柱方法如下：将浸膏b用85％-99％的二氯甲烷溶解后搅拌均匀，加入样品量1-3倍量的80-100目的硅胶晾干，用样品量12-39倍的100-200目的硅胶安装色谱柱。
所述步骤5中，硅胶柱的装柱方法如下：将组分D4用85％-99％的乙酸乙酯溶解后和样品量1-3倍量的80-100目硅胶搅拌均匀，晾干后用样品量12-39倍的100-200目的硅胶安装色谱柱。
所述两种三萜化合物的应用为在制备肝脏保护药物中的用途，所述三萜化合物的药物剂型为片剂、胶囊剂、口服液、口含片、颗粒剂、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
本发明所述的灵芝属大型真菌赤芝(拉丁名：Ganoderma lucidum)，不受地区和品种限制，均可以实现本发明。
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将产自云南西双版纳傣族自治州的赤芝(Ganoderma lucidum)8Kg晒干后粉碎到60目，用92％的工业乙醇在室温下超声提取3次，每次30分钟，浓缩乙醇溶液得到浸膏0.7Kg。
把浸膏倒入分液漏斗，加水1.2L，搅拌均匀后加入1.2L乙酸乙酯，震荡，然后充分静置，等待水和有机溶剂分层后抽出乙酸乙酯，反复该过程3次，合并乙酸乙酯萃取溶液，减压蒸馏后得到赤芝浸膏0.4Kg。把480mL乙酸乙酯加入浸膏后溶解浸膏，再加入0.8Kg的硅胶(80-100目)搅拌均匀，在室温下干燥。称取8Kg硅胶(100-200目)安装硅胶柱色谱，用石油醚：丙酮(体积比为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1)为洗脱剂进行梯度洗脱，得到A-F一共6个组分。取组分D(149g)用46％-90％甲醇水溶液为洗脱剂的MCI柱色谱脱色，得到组分D1-D5。组分D4(84g)加入120mL的乙酸乙酯溶解，用115g 80目的硅胶搅拌均匀，室温干燥后用2.7Kg100目的硅胶安装正相硅胶柱色谱，用体积比分别为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚/丙酮作为洗脱剂进行梯度洗脱，得到D4a-D4f一共6个组分。组分D4c(8.8g)用半制备高效液相色谱分离纯化组分，仪器参数为：Zorbax SB-C18(10μm，9.4×250mm)半制备柱，DAD检测器波长为204nm、210nm、254nm和306nm，流动相为甲醇/水溶液，流速为5mL/min，进样量为800μL。其中，化合物Ⅰ采用68％甲醇/水溶液为流动相，收集每次进样后色谱峰保留时间为13.9min时所对应的洗脱液，蒸干后得到299.0mg纯度为95％的3β,7β-二羟基-11,15,23-三羰基-羊毛甾烷-8,16-二烯-26-羧酸；化合物ⅠI采用66％甲醇/水溶液为流动相，收集每次进样后色谱峰保留时间为15.4min时所对应的洗脱液，蒸干后得到273.0mg纯度为95％的甲基灵芝酸C。
实施例2
将产自湖北襄阳的赤芝(Ganoderma lucidum)子实体13Kg晒干，粉碎到80目，用90％的工业甲醇室温下超声提取2次，每次20分钟，浓缩甲醇溶液得到浸膏1.2Kg。
把浸膏倒入分液漏斗，加入1.5L水和1.5L二氯甲烷，搅拌均匀，振摇后静置，分层后收集二氯甲烷萃取液，反复3次，合并二氯甲烷萃取液，减压浓缩得到赤芝浸膏0.6Kg。浸膏用600mL的二氯甲烷溶解后加入1.2Kg 90目的硅胶搅拌均匀，室温下干燥，用18Kg 150目的硅胶装柱的正相柱色谱分离，用体积比分别为1:0，9:1，7:1，4:1，2:1，1:1和0:1的石油醚：丙酮作为洗脱剂系统洗脱，得到得到A-F一共6个组分。取组分D(330g)用MCI柱色谱脱色，用43％-89％的甲醇水溶液作洗脱剂，脱色后得到组分D1-D5。组分D4(124g)加入170mL二氯甲烷溶解，用180g 90目的硅胶搅拌均匀，室温干燥后用3.0Kg150目的硅胶装柱色谱，用体积比分别为1:0，9:1，6:1，3:1，2:1，1:1和0:1的石油醚：丙酮作为洗脱剂洗脱，得到D4a-D4f一共6个组分。组分D4c(19.3g)用半制备高效液相色谱分离纯化组分，仪器参数为：Zorbax SB-C18(10μm，9.4×250mm)半制备柱，DAD检测器波长为204nm、210nm、254nm和306nm，流动相是50％的乙腈水溶液，流速为3mL/min，进样量为700μL，分别收集每次进样后色谱峰保留时间为12.7min和14.4min的洗脱剂溶液，重复多次后合并蒸干后得到472mg纯度为97％的3β,7β-二羟基-11,15,23-三羰基-羊毛甾烷-8,16-二烯-26-羧酸和纯度为97％的450.0mg甲基灵芝酸C。
实施例3
实施例1制备的甲基灵芝酸C和3β,7β-二羟基-11,15,23-三羰基-羊毛甾烷-8,16-二烯-26-羧酸用核磁共振技术鉴定其结构，具体数据为：
甲基灵芝酸C：白色粉末，根据NMR数据推测其分子式为C31H48O7，不饱和度Ω＝8。
3β,7β-二羟基-11,15,23-三羰基-羊毛甾烷-8,16-二烯-26-羧酸：黄色针状结晶，根据NMR数据推测其分子式为C30H42O7，不饱和度Ω＝10。
1.18(3H,s,H-19),3.00(1H,dd,J＝6.9,13.6Hz,H-20),1.10(3H,d,J＝6.9Hz,H-21),2.83-2.90(2H,m,H-22),2.74(1H,dd,J＝5.9,17.5Hz,H-24a),2.83-2.90(1H,m,H-24b),2.83-2.90(1H,m,H-25),1.18(3H,d,J＝3.0Hz,H-27),1.00(3H,s,H-28),0.81(3H,s,H-29),1.52(3H,s,H-30)；
52.73(C-13),59.54(C-14),212.11(C-15),123.45(C-16),189.49(C-17),31.54(C-18),19.06(C-19),29.95(C-20),19.82(C-21),48.33(C-22),208.74(C-23),47.11(C-24),35.86(C-25),179.41(C-26),17.52(C-27),28.75(C-28),16.33(C-29),33.68(C-30)。
实施例4
将实施例1制备的甲基灵芝酸C和3β,7β-二羟基-11,15,23-三羰基-羊毛甾烷-8,16-二烯-26-羧酸按照实施例3的方法进行结构测定，对得到的三萜化合物进行体外保肝活性筛选，具体试验如下：
在5％CO2，37℃，pH＝7.2-7.4的条件下，用含100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素和10％胎牛血清的培养基中培养培养HL-7702细胞(人肝细胞)，在96孔板中接种0.1mL密度为1×10
结果表明，甲基灵芝酸C和3β,7β-二羟基-11,15,23-三羰基-羊毛甾烷-8,16-二烯-26-羧酸对人类肝细胞HL-7702的成活率高于阳性对照双环醇42％，分别为44％和46％，具有较好的肝保护作用，在保肝药物研究领域开发有很好的应用前景。
赤芝中两种具有保肝活性的三萜化合物的制备方法和应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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