专利摘要

本发明公开了一种采用高纤维素水解液耐受性大肠杆菌生产生物基化学品的方法。具体地说，本发明提供了一株耐受性木质纤维素水解液的可用于生产生物基化学品的宿主大肠杆菌菌株。该菌株具有很好的木质纤维素水解液耐受性，能够高效的直接利用木质纤维素水解液，通过代谢工程改造生产生物基化学品及生物基化学品。 CGMCCNo.8028 2013.08.15

权利要求

1.一种高纤维素水解液耐受性大肠杆菌，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8028。

2.如权利要求1所述大肠杆菌，其特征在于，该菌株在木质纤维素水解液作为碳源的培养基里生长。

3.如权利要求1所述大肠杆菌，其特征在于，所述木质纤维素水解液培养基通过如下方法获得：1L烧杯中加入450mL蒸馏水和下各成份将其溶解于水中NH₄Cl 0.3～0.5g，Na₂HPO₄ 2～3g，KH₂PO₄ 1～2g，用1M NaOH调整pH到7.4并将整体积调整至450～550mL灭菌，获得培养基成分A；制备以下溶液各100mL：1M MgSO₄.7H₂O；20%(w/v)木质纤维素烯酸水解液；1M CaCl₂；40%的葡萄糖水溶液；在无菌情况下把1mL MgSO₄ 7H₂O(1M)和1mL氯化钙(1M)，40～60mL木质纤维素烯酸水解液添加到培养基成分A中，配置成纤维素水解液培养基。

4.权利要求1所述大肠杆菌用于发酵生产生物基化学品。

5.如权利要求4所述方法，其特征在于，是将外源基因导入权利要求1所述大肠杆菌，重组大肠杆菌以纤维素水解液为碳源发酵生产生物基化学品。

6.如权利要求4所述方法，其特征在于，是将与异戊二烯合成有关基因导入权利要求1所述大肠杆菌，重组大肠杆菌以纤维素水解液为碳源发酵生产异戊二烯。

7.如权利要求5所述方法，其特征在于，是将携带异戊二烯合成酶的质粒pACY dute-1导入权利要求1所述大肠杆菌，重组大肠杆菌以纤维素水解液为碳源发酵生产异戊二烯。

8.如权利要求4所述方法，其特征在于，是将与甲羟戊酸合成有关的基因导入权利要求1所述大肠杆菌，重组大肠杆菌以纤维素水解液为碳源发酵生产甲羟戊酸。

9.如权利要求4所述方法，其特征在于，是将来源于鼠尾草的桧烯合成酶基因导入权利要求1所述大肠杆菌，重组大肠杆菌以纤维素水解液为碳源发酵生产桧烯。

10.如权利要求4-9所述任一方法，其特征在于，所述木质纤维素水解液培养基通过如下方法获得：1L烧杯中加入450mL蒸馏水和下各成份将其溶解于水中NH₄Cl 0.3～0.5g，Na₂HPO₄ 2～3g，KH₂PO₄ 1～2g，用1M NaOH调整pH到7.4并将整体积调整至450～550mL灭菌，获得培养基成分A；制备以下溶液各100mL：1M MgSO₄.7H₂O；20%(w/v)木质纤维素烯酸水解液；1M CaCl₂；40%的葡萄糖水溶液；在无菌情况下把1mL MgSO₄7H₂O(1M)和1mL氯化钙(1M)，40～60mL木质纤维素烯酸水解液添加到培养基成分A中，配置成纤维素水解液培养基。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高纤维素水解液耐受性大肠杆菌及其发酵生产生物基化学品的方法。

背景技术

随着生物化工技术的发展，大量的生物基化学品的代谢途径在大肠杆菌宿主内构建，以实现该化学品的生物合成，并因为生物基化学品的高附加值受到了生物化工学家的青睐。然而，如何有效的降低其原料成本成为了限制生物基化学品化工产业的一个瓶颈。发酵过程中主要原料糖类的价格成为限制其成本的一个主要因素。在木质纤维素稀酸水解技术能够有效的降低发酵原料的成本，但是产物中会形成多种发酵抑制剂,如糠醛、羟甲基糠醛、乙酸、酚类化合物等。由于这些抑制剂对微生物的抑制作用,使利用大肠杆菌进行生物基化学品的发酵受到严重限制,解决大肠杆菌的木质纤维素稀酸水解液的不耐受性是生物化工学家研究的又一关键问题。

微生物的水解液不耐受性主要表现在，在接种后的开始阶段反应出现明显的延迟期，而且还发现了细胞的部分死亡。针对微生物的生物质水解液不耐受性开展的工作主要包括菌株选育和菌株的驯化。以筛选获得的细菌Thermoanaerobacter mathranii strain A3MI发酵麦草水解液发酵过程显示麦草水解液中的发酵抑制物质对T.mathraoii strain A3MI的发酵能力没有明显的抑制作用,但是T.mathraoii strain A3MI只能发酵麦草半纤维素水解液中的单糖。此外，选育菌株菌株具有遗传背景不清楚的缺点，很难较好的用于生物基化学品的代谢工程改造。此外，通过对菌种进行驯化，获得提高对水解液中发酵抑制物的耐受的菌株的方法，但该方法耗时较长，所得菌种不稳定，并且容易退化。此外也有通过基因工程改造提高大肠杆菌宿主对生物质水解产物的不耐受性，并应用于发酵生物乙醇的报道。此类工程菌株，并且只能针对某种有毒化合物，不能有效的解决木质素烯酸水解液中有毒化合物种类繁多（糠醛、羟甲基糠醛、乙酸、酚类化合物）的问题。

虽然大肠杆菌遗传背景较清楚，但是现有生物基化学品的生产行业中成本较低的木质纤维素水解液中含有能够抑制工程大肠杆菌有毒物质，而通过驯化手段获得的宿主菌菌株不稳定容易退化，通过基因工程改造获得的宿主菌又含有外源质粒不容易操作，采用诱变的方法获得一株纤维素稀酸水解液耐受性的菌株是一种可行的方法。

发明内容

本发明提供了一种具有木质纤维素水解液高耐受性的大肠杆菌。

该菌株qibebt-3已于2013年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8028，建议分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所述的高耐受木质纤维水解液的菌株大肠杆菌是通过诱变普通大肠杆菌的方法筛选获得的。

本发明涉及的耐受纤维素水解液的大肠杆菌具有如下生物学特征：

该菌株在LB固体平板培养基上菌落特点是表面光滑。

上述LB培养基的配方：蛋白胨9～11g/L，酵母粉4.5～5.5g/L，氯化钠1～4g/L,pH7.0～7.5,112℃灭菌30分钟。

本发明涉及的木质纤维素水解液耐受性菌株能够在以木质纤维素水解液为唯一碳源的培养基中生长，并可通过分子生物学改造用于发酵生产生物基化学品。

木质纤维素水解液培养基通过如下方法获得：1L烧杯中加入450mL蒸馏水和下各成份将其溶解于水中NH₄Cl 0.3～0.5g，Na₂HPO₄ 2～3g，KH₂PO₄ 1～2g用1M NaOH调整pH到7.4并将整体积调整至450～550mL灭菌，获得培养基成分A；制备以下溶液各100mL:1M MgSO₄.7H₂O；20%(w/v)木质纤维素烯酸水解液；1M CaCl₂；40%的葡萄糖水溶液。

在无菌情况下把1mL MgSO₄ 7H₂O(1M)和1mL氯化钙(1M),40～60mL木质纤维素烯酸水解液添加到培养基成分A中，配置成纤维素水解液培养基。

另外，在无菌情况下把1mL MgSO₄ 7H₂O(1M)和1mL氯化钙(1M),20～30mL葡萄糖水溶液添加到培养基成分A中，配置成含葡萄糖培养基。

纤维素水解液制备方法：纤维素水解液的制备：利用20～40目的秸秆粉碎物按照40～60g/L用蒸馏水浸泡，添加0.5～1.5%的硫酸中，90～100℃水解2～4小时，过滤除去剩余物，离心除残渣后，利用NaOH调节pH值和浓度至含糖量至18～22%后，用做发酵用的碳源。

上述木质纤维素水解液培养基的灭菌条件为115℃灭菌25～35分钟。

本发明有益效果如下：

1）该大肠杆菌能够利用木质纤维素水解液作为碳源快速生长。

2）该大肠杆菌能够在不受木质纤维素有毒物质的抑制下直接作为工程宿主菌合成生物基化学品。

3）不含有外源质粒，易于进行基因工程改造。

4）本发明提供的菌株生产的生物基化学品的生产方法条件温和、环境友好以及产品绿色天然等优点。

附图说明

图1诱变菌株的耐受性情况。

图2转入的产异戊二烯质粒图谱。

图3诱变菌株与对照菌株的产异戊二烯情况。

具体实施方式

实施例一：菌株诱变及筛选

用血球计数法测定悬液中的细胞数，用无菌水稀释至105～106个/mL。取5mL菌悬液于直径9cm平皿中，放入经70%乙醇消毒的转子，磁力搅拌。置30w紫外灯管下，距离约25cm，照射一定时间后（1s、2s、5s、15s、30s、60s），取0.1mL涂布于木质纤维素水解液选择性培养基平板37℃避光培养16—18h，计平板菌落数，计算致死率，绘制致死曲线。

木质纤维素水解液培养基通过如下方法获得：1L烧杯中加入450mL蒸馏水和下各成份将其溶解于水中NH₄Cl 0.3～0.5g，Na₂HPO₄ 2～3g，KH₂PO₄ 1～2g用1M NaOH调整pH到7.4并将整体积调整至450～550mL灭菌，获得培养基成分A；制备以下溶液各100mL:1M MgSO₄.7H₂O；20%(w/v)木质纤维素烯酸水解液；1M CaCl₂；40%的葡萄糖水溶液。

在无菌情况下把1mL MgSO₄ 7H₂O(1M)和1mL氯化钙(1M),40～60mL木质纤维素烯酸水解液添加到培养基成分A中，配置成纤维素水解液培养基。

另外，在无菌情况下把1mL MgSO₄ 7H₂O(1M)和1mL氯化钙(1M),20～30mL葡萄糖水溶液添加到培养基成分A中，配置成含葡萄糖培养基。

纤维素水解液制备方法：纤维素水解液的制备：利用20～40目的秸秆粉碎物按照40～60g/L用蒸馏水浸泡，添加0.5～1.5%的硫酸中，90～100℃水解2～4小时，过滤除去剩余物，离心除残渣后，利用NaOH调节pH值和浓度至含糖量至18～22%后，用做发酵用的碳源。

上述木质纤维素水解液培养基的灭菌条件为112℃灭菌30分钟。

经过紫外诱变，在平板上菌落生长较大的菌株为木质纤维素水解液耐受性菌株。

实施例二：菌株木质纤维素水解液耐受性的验证

木质纤维素烯酸水解液的制备：取干燥后的秸秆，经粉碎后40目过滤玉米秸秆粉碎物按照固液比5%，于1%的硫酸中100℃水解5小时，经过滤，调节pH后用作纤维素水解碳源，其成分主要为葡萄糖、木糖、糠醛，此外还含有少量羟甲基糠醛、乙酸、酚类化合物及利用氢氧化钠中和产生的硫酸钠盐。

挑取筛选获得的木质纤维素水解液耐受性菌株，利用未经过诱变的菌株，作为对照，接种于装有2mL LB培养基的试管中，生长到菌体密度为OD600大约1左右时接种于装有50mL以上述木质纤维素水解液3%作为唯一碳源的250mL的摇瓶中，120转每分钟的摇床中，37℃培养。

每隔1h，3h，5h，7h，9h，11h测定菌株的生长速度，对比与对照菌株在木质纤维素水解液作为碳源的培养基里生长速度。经验证，获得15株耐受性较好菌株，其中8号菌表现突出（图1）。图1为8号菌株与诱变前大肠杆菌在纤维素水解液中生长情况，其8号菌株生长情况明显好于诱变前大肠杆菌，OD值为诱变之前的4倍以上。

该8号菌株命名为qibebt-3已于2013年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8028，建议分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例三：利用纤维素水解液耐受性宿主菌合成生物基化学品

感受态菌株制备：

1.从37℃过夜(16-20h)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37℃下振荡培养过夜。

2.转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中.于37℃下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。

3.室温下，4000rpm离心5分钟收集对数期细胞。弃培养基，保留细胞沉淀。

4.加入10毫升冰冷的MgCl₂-CaCl₂溶液，并轻微打匀。

5.4℃下，4000rpm离心10分钟收集细胞。

6.弃MgCl₂-CaCl₂溶液，保留细胞沉淀。

7.加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl₂溶液，并轻微打匀。冰浴放置若干小时为最好。

8.此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70℃冰冻保藏。

工程菌转化：

1.向事先灭菌，并经冷处理的1.5mL聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。向每个转化管中加入含有异戊二烯合成酶的商业化质粒pACY dute-1（图2所示）混匀管中成份。于冰浴放置30～40分钟。

2.把转化管转移至放于42℃循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。

3.把试管迅速转移至冰浴2到3分钟。

4.向每只试管中加入500微升LB培养基。37℃放置45到90分钟，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。

5.转移适量体积（如果使用90毫米平板，一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有相应抗生素的LB-琼脂平板上。

6.室温放置平板直到其上液体被吸收。

7.于37℃倒置平板培养。转化克隆应该于12-16小时区间出现。

工程菌的发酵验证，

挑取工程菌，摇瓶发酵测定产物进行验证。

发酵方法：600mL的厌氧瓶中共含有100mL发酵液，其中含，5%的纤维素烯酸水解液,9.8g/L K₂HPO₄,5g/L牛肉浸膏,0.3g/L柠檬酸铁铵,2.1g/L一水柠檬酸,0.06g/L MgSO₄和1mL微量元素（(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.37g/L,ZnSO₄·7H₂O 0.29g/L,H₃BO₄ 2.47g/L,CuSO₄·5H₂O 0.25g/L,和MnCl₂·4H₂O 1.58g/L），培养4小时后利用IPTG进行诱导，密封，30℃培养24小时，取顶空气体1mL，利用气相测定。

检测方法：GC条件：分离柱型号RTX1701毛细管柱（30*0.32mm），载气恒流1mL/min，进样口温度250℃，柱温100℃，检测室温度260℃，FID检测器温度280℃。经检测在利用纤维素水解液作为碳源的产异戊二烯培养基中，诱变菌能够产生异戊二烯的量约为对照菌的8倍（图3），异戊二烯产量达到20mg/L。

实施例四：

将甲羟戊酸合成相关蛋白羟甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，可来源于动物、植物以及细菌等生物体，更优选为来自产气肠球菌（Enterococcus faecalis）的甲羟戊酸代谢途径的上游途径的相关蛋白的HMG-CoA合成酶基因mvaS（GI：9937382）和HMG-CoA还原酶基因mvaE（GI：9937382）。利用连接到商品化质粒pUCP 18连接到Eco RI和Hin dIII酶切位点。导入大肠杆菌，重组大肠杆菌以纤维素水解液为碳源发酵生产甲羟戊酸，产量35mg/L。

实施例五：

是将来源于鼠尾草的桧烯合成酶基因（SabS，GI：111182621）的基因，利用限制性内切酶Bgl II和Xho I连接到pACY dute-1质粒的第二个表达位点，导入大肠杆菌，重组大肠杆菌以纤维素水解液为碳源发酵生产桧稀，桧稀产量1.9mg/L。

一种采用高纤维素水解液耐受性大肠杆菌生产生物基化学品的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。