专利摘要

本发明公开了从牛瘤胃液宏基因组文库中获得的一种新的木糖异构酶核苷酸序列，还提供了该核苷酸序列编码的氨基酸序列。本发明还涉及含有该核苷酸序列的载体及转化体。当该木糖异构酶被表达时，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力，木酮糖进一步被宿主细胞代谢。因此，宿主细胞能够以木糖作为碳源生长。新来源的木糖异构酶在酿酒酵母内高活性表达，且该酶为嗜温性酶，最适酶活温度为60℃。本发明还涉及木糖异构酶可作为模式蛋白在理论研究上的应用，及在燃料乙醇、高果糖浆等实际生产上的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的编码木糖异构酶的核酸分子及其编码的木糖异构酶。本发明涉及木糖异构酶酶学性质的研究。本发明涉及木糖异构酶在酶基因工程技术领域的应用。本发明还涉及用编码木糖异构酶的核酸序列转化的宿主细胞。

背景技术

石油价格的持续上涨和温室效应引起的全球变暖，使得人们越来越重视可再生能源的开发和利用。生物质能便是一种重要的可再生能源，以生物质为原料生产燃料乙醇具有广阔的发展空间。长期以来，人们利用淀粉和糖类发酵生产乙醇。这些原料成本较高，大大限制了生物质燃料乙醇产业的发展。在全球每年光合作用生产的高达1500亿吨～2000亿吨的生物质中80％以上为木质纤维素类物质，它十分廉价且容易获得，因此以木质纤维素为原料生产燃料乙醇，具有重要的实践意义。木质纤维素是纤维素、半纤维素和木质素等的聚合物。利用酸解或酶解的方法可将木质纤维素转化为大量的五碳糖(木糖和阿拉伯糖)和六碳糖(葡萄糖、半乳糖和甘露糖)。木糖在大多数木质纤维素水解物中是含量仅次于葡萄糖的一种单糖，可达30％。分析表明，充分利用木质纤维素原料中的木糖发酵生产乙醇能使乙醇产量在原有基础上提高25％(Nigam et al.，J Appl Microbiol，2001，90(2)：208-215)。但是，大部分能够进行乙醇发酵的酿酒酵母(Saccharomyce cerevisise)不能够以木糖作为碳源。所以，如何通过对已有菌株进行改造使其能高效利用木糖产乙醇已成为使木质纤维素资源得以充分利用的关键问题之一。

自然界利用木糖的酵母菌同化木糖的最初两步反应是在木糖还原酶(xylose reductase，XR)及木糖醇脱氢酶(xylitoldehydrogenase，XDH)催化下完成的。木糖首先在XR的催化下，还原成木糖醇，随后由XDH氧化成木酮糖( et al.，Appl Environ Microbiol，2001，67：5668-5674)。在大多数细菌，如E.coli和Bacillus等中，木糖通过木糖异构酶(XI)直接转化为木酮糖( et al.，Appl Environ Microbiol，2001，67：5668-5674)。然后，木酮糖在木酮糖激酶(XK)的作用下转变成5-磷酸木酮糖，进入磷酸戊糖途径。酿酒酵母(Saccharomyce cerevisise)具有高的酒精产量和产率，对抑制因子以及发酵过程中的不利因素的高耐受性，对高浓度酒精的耐受以及非致病性等优良特性。但由于缺乏木糖代谢的最初两个酶XR和XDH而不能代谢木糖。为了使酿酒酵母具有发酵木糖的能力，将依赖NAD(P)H的XR及依赖NAD+的毕赤酵母XDH克隆到其中，得到能够发酵木糖生产酒精的重组菌(Walfridsson et al.，Appl Environ Microbiol，1995，61：4184-4190；Sedlak et al.，Appl Biochem Biotechnol，2004，113-116：403-416)。但同时带来的问题是：XR对NADPH的亲和性远远大于NADH，这就导致在XDH催化的木糖醇氧化成木酮糖的过程中，辅因子的不平衡，其直接后果就是副产物木糖醇的积累和甘油等的生成，从而影响终产物酒精的产量。木糖异构酶因不需要辅助因子，因此它再次受到研究者们的注意(Kuyper et al.，FEMS Yeast Research，2004，4：655-664)。

木糖异构酶(Xylose isomerase，XI)(EC5.3.1.5)可以催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，微生物体内的糖代谢工程起着重要的作用；在体外亦能催化D-葡萄糖到D-果糖的异构化反应，所以又称为葡萄糖异构酶。在基础研究方面，由于该酶的结构非常稳定，是研究蛋白质结构与功能关系较好的模型之一(Bhosale et al.，Protein Eng Des Sel，12004，17(12)：861-869)。更重要的是，木糖异构酶所具有的极其重要的工业应用价值，使它和蛋白酶及淀粉酶并称为重要的工业用酶(田沈等微生物学通报，2007，34(2)：355-358；Bhosale et al.，Microbiol Rev，1996，60(2)：280-300)而引起科学家们的关注，并对其开展了较为广泛的研究。从上个世纪70年代以来，木糖异构酶的应用主要集中在高果糖浆生产和燃料乙醇产生两个方面。然而，近几年，科学家研究发现，在一定条件下木糖异构酶可以转化生产许多制药工业重要的原料稀有糖，如核糖、甘露糖、阿拉伯糖、来苏糖等(Karimaki et al.，Protein Eng Des Se，12004，17(12)：861-869)。这些发现为木糖异构酶的研究注入新的活力。

据报道，虽然多种细菌来源的木糖异构酶基因都曾被插入到酿酒酵母中，但是常见嗜温性原核生物的XI在酿酒酵母中不能表达有活性的XI。在目前已公布的约450个木糖异构酶氨基酸序列中，两种来自嗜热细菌的XI在酿酒酵母中表达产物在85℃下具有1U/mg的木糖异构酶特异活性，但是，在酿酒酵母的生理温度(30℃)仅仅保留这种活性的极少部分。其他来源的能够在酿酒酵母中活性表达的木糖异构酶基因来源包括真菌Piromyces sp-E2，Orpinomyces sp-Ukk1，Cyllamyces aberensis和细菌Clostridium phytofermentans，Clostridium difficile，Bacteroides fragilis，Fusobacterium-mortiferum及Ciona intestinalis。其中，仅仅有真菌Piromyces sp-E2，细菌Clostridium phytofermentans来源的木糖异构酶在酿酒酵母中得到较高活性表达，尤其是前者的活性更高。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种新来源的嗜温性木糖异构酶，及编码该酶的基因，以及表达该酶的宿主细胞。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种编码木糖异构酶的核酸分子，其序列为以下核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个核苷酸的具有至少40％序列一致性的同源序列；

(3)在严格条件下，与(1)或(2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

(4)由于遗传密码子的简并性区别于(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。

一种木糖异构酶，其序列为以下氨基酸序列之一：

(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个氨基酸的具有至少40％序列一致性的同源序列。

本发明的编码木糖异构酶的核苷酸编码的氨基酸不包括选自以下各组的氨基酸序列：

(1)Piromyces sp-E2木糖异构酶在WO 03/062340中公开的序列；

(2)Bacteroides thetaiotaomicron木糖异构酶在WO 04/099381和WO 06/009434中公开的序列；

(3)Cyllamyces aberensis木糖异构酶在WO 04/099381中公开的序列；

(4)Orpinomyces sp-Ukk1木糖异构酶在Madhavan et al.(2008，supra)中公开的序列；

(5)Clostridium difficile，Fusobacterium-mortiferum及Ciona intestinalis的木糖异构酶在WO 2010/074577中公开的序列。

本发明的编码木糖异构酶的核苷酸编码的氨基酸序列，其序列不包括选自以下各组的氨基酸序列：序列一致性高于选自以下各组的氨基酸序列的99，98，97，96，95，94，93，92，91，90，89，88，87，86，85，84，83，82，81，80，79，78，77，76，75，74，73，72，71或70％的氨基酸序列。

(1)Piromyces sp-E2木糖异构酶在WO 03/062340中公开的序列；

(2)Bacteroides thetaiotaomicron木糖异构酶在WO 04/099381和WO 06/009434中公开的序列；

(3)Cyllamyces aberensis木糖异构酶在WO 04/099381中公开的序列；

(4)Orpinomyces sp-Ukk1木糖异构酶在Madhavan et al.(2008，supra)中公开的序列；

(5)Clostridium difficile，Fusobacterium-mortiferum及Ciona intestinalis的木糖异构酶在WO 2010/074577中公开的序列。

所述木糖异构酶在化工、食品和医疗等领域的应用。

本发明的木糖异构酶具有的极其重要的工业应用价值，其应用主要集中在高果糖浆生产和燃料乙醇产生两个方面。在一定条件下木糖异构酶还可以转化生产许多制药工业重要的原料稀有糖，如核糖、甘露糖、阿拉伯糖、来苏糖等。在基础研究方面，由于该酶的结构非常稳定，是研究蛋白质结构与功能关系较好的模型之一。

一种重组载体，其含上述的编码木糖异构酶的核酸分子的完整编码阅读框序列。

一种重组细胞，其宿主细胞为细菌、酵母或丝状真菌，优选具有厌氧乙醇发酵能力的酵母；宿主细胞内含有上述的重组载体，编码木糖异构酶的核苷酸序列被可操作地连接于宿主细胞中引起木糖异构酶充分表达的启动子，从而赋予了宿主胞将木糖异构化木酮糖的能力。

所述宿主细胞优选含有主动糖酵解、戊糖磷酸途径和含有木酮糖激酶活性使得从木糖异构得到的木酮糖可以被代谢为丙酮酸的宿主细胞。

所述宿主细胞优选含有将丙酮酸转化为期望的分解代谢物如乙醇、乙烯或乳酸的酶的宿主细胞。

所述宿主细胞优选具有厌氧乙醇发酵能力的酵母；

所述宿主细胞还优选对乙醇和有机酸如乙酸、乳酸或蚁酸及糖分解代谢物如糠醛和羟甲基糠醛具有耐受能力的宿主细胞。

上述宿主细胞的这些特征或活性之一可以是天然存在于宿主细胞或通过遗传修饰被引入或改进。

所述宿主细胞包含一种遗传修饰，该遗传修饰降低非特异性醛糖还原酶活性。

所述宿主细胞具有将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸的能力。

所述宿主细胞包含一种或多种遗传修饰，该遗传修饰产生选自如下一组的特征：

(1)增加木糖转运到宿主细胞内；

(2)木酮糖激酶活性增强；

(3)戊糖磷酸途径的流量增加；

(4)对分解代谢物阻遏的敏感性降低；

(5)对乙醇、渗透性或有机酸的耐受力增强；

(6)副产物生成下降；

(7)细胞电子链传递和氧化呼吸链阻断。

所述副产物被理解为是指含碳分子而不是期望的发酵产物，包括如木糖醇、甘油或乙酸。

所述遗传修饰由过度表达内源基因、表达异源基因或其组合组成，且所述基因选自下列基因：己糖或戊糖转运蛋白基因、木酮糖激酶基因、来自戊糖磷酸途径的酶的基因、糖酵解酶的基因或/和乙醇发酵相关的酶的基因。

所述宿主细胞表达一种或多种酶，所述的酶赋予宿主细胞产生乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或/和头孢菌素等系列代谢产物的能力。

一种利用上述重组细胞生产发酵产物的方法：宿主细胞发酵含有木糖原料或/和葡萄糖原料的培养基，然后分离纯化发酵产物，所述发酵产物为乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或/和头孢菌素。

上述被转化的宿主细胞异构木糖为木酮糖的能力是直接将木糖异构化为木酮糖，不同于木糖通过木糖醇过度两步转化为木酮糖，其分别由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化。

本发明的编码木糖异构酶的核苷酸序列以活性形式在被转化的宿主细胞中表达，因此，核苷酸序列在宿主细胞中表达生成具有特定活性的木糖异构酶。在被转化的宿主细胞中表达的木糖异构酶特异性活性在此定义为宿主细胞的无细胞溶解产物如酵母的无细胞溶解产物中的每mg蛋白的木糖异构酶活性单位量。木糖异构酶活性的确定、蛋白含量和无细胞溶解产物的制备在下述实施例2中描述。新木糖异构酶在酿酒酵母中高活性表达。30℃下，采用XI-SDH一步法测定木糖异构酶酶活(Kuyper et al.，FEMS Yeast Research，2003，4：69-78)，该酶酶活为1.3U/mg，高于Piromyces sp-E2来源的木糖异构酶酶活1.1U/mg(Kuyper et al.，FEMS Yeast Research，2003，4：69-78)。但是新来源的木糖异构酶是一种嗜温性木糖异构酶，最适酶活温度在60℃(图3)。

附图说明

图1：验证重组细胞中含有木糖异构酶基因RuXI。以反提重组酵母质粒为模板，特异性引物BamHI-GXI-F，SbfI-GXI-R(表1)扩增RuXI。M：Marker，1kbDNA ladder 1：RuXI；

图2：验证重组细胞中含有木糖异构酶基因RuXI。将反提质粒反转到大肠杆菌DH5α中，提取质粒，BamHI和SbfI双酶切验证结果。M：Marker，1kbDNA ladder 1：约1.3kb为RuXI，约6kb的为线性载体pJFE3；

图3：酿酒酵母转化子的新木糖异构酶最适酶活温度测定；

图4：酿酒酵母转化子在含有20g/L葡萄糖、20g/L木糖作为碳源的培养基中的生长曲线；

图5：酿酒酵母转化子在含有20g/L木糖作为唯一碳源的培养基中的生长曲线；

图6：酿酒酵母转化子在含有20g/L木糖作为唯一碳源的培养基中的限氧乙醇发酵结果分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1克隆来自牛瘤胃液宏基因组文库的木糖异构酶的DNA序列

木糖异构酶保守区域间的部分糖异构酶的DNA序列的克隆：

以构建好的牛瘤胃液宏基因组文库为模板，以简并引物XIcF和XIcR(表1)为引物，PCR扩增，得到大约400bp的片段，将清晰的条带纯化并连接到T载体上，任意挑取22个采用通用引物验证的克隆送去测序。测序结果表明：22个克隆的DNA插入片段的序列全属于木糖异构酶的特有序列。其中21个克隆的DNA插入片段的序列为大肠杆菌的木糖异构酶基因保守序列，只有一个克隆的DNA插入片段属于新来源的木糖异构酶基因保守序列。该片段命名为2PXI-3，374bp。

表1所用的引物序列

木糖异构酶的5’和3’DNA序列的克隆：

根据载体pBK-CMV序列和2PXI-3序列，设计七个特异性引物：pBK-F，pBK-R，pBK-R1，2PXI-F，2PXI-R，2PXI-F2，2PXI-R2(表1)。以牛瘤胃液宏基因组文库为模板，沿目的片段两侧分别进行PCR扩增。由引物pBK-R1，2PXI-F扩增得到基因的3’DNA片段FT1；由引物pBK-F，2PXI-R扩增得到基因的5’DNA片段PR。

木糖异构酶全长DNA序列的克隆：

将xylA基因5’序列和3’序列拼接，设计特异性引物BamHI-GXI-F，SbfI-GXI-R表1)。以牛瘤胃液宏基因组文库为模板，PCR扩增得到1320bp xylA基因，命名为RuXI，如SEQ ID NO.1所示。

实施例2在酵母中表达新来源的木糖异构酶RuXI

构建酵母表达载体：

木糖异构酶RuXI的DNA和pfu聚合酶用于PCR反应中。用木糖异构酶基因的5’和3’的序列设计引物，还含有SbfI和BamHI限制性酶切位点。PCR产物被克隆到pJFE3载体中，得到重组质粒pJFE3-RuXI。

构建含有木糖异构酶基因的重组酿酒酵母：

将具有木糖异构酶基因的质粒pJFE3-RuXI转化到酿酒酵母中。宿主酿酒酵母菌主要特征为：超表达XKS1和PPP途径的RPE1 RKI1 TAL1 TKL1；敲除醛糖还原酶基因GRE3；且经过特殊修饰，宿主酿酒酵母的呼吸途径被阻断。转化子在SC-URA平板上筛选，未被转化的细胞不能在这些平板上生长。

从重组酿酒酵母转化子中提取质粒验证重组细胞中表达的木糖异构酶为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列：

采用试剂盒提取重组酵母菌中质粒，可以通过两方面验证重组细胞中表达的木糖异构酶为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列：(1)以所提质粒为模板，特异性引物BamHI-GXI-F，SbfI-GXI-R(表1)扩增RuXI，(2)用所提质粒转化大肠杆菌DH5α中，提取质粒，BamHI和SbfI双酶切。同时将提取的质粒进行测序，确定目的基因的序列。

结果：

从重组酿酒酵母中提取的质粒测序结果表明：目的基因序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列一致，该质粒PCR(图1)及酶切验证(图2)的结果也表明：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列已被转入到酿酒酵母中，即重组细胞中表达的木糖异构酶为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

表达：

被转化的酵母细胞在30℃下，初始OD＝0.2左右，在葡萄糖培养基中生长12h。回收细胞。用玻璃珠(0.10-0.11mm)和裂解缓冲液(100mM Tris-HCl+蛋白酶抑制剂)溶解细胞。用机械震荡细胞破碎仪裂解细胞，破胞后，离心混合物(11,000xg，4℃，10min)。

澄清的上清液采用XI-SDH(木糖异构酶偶联山梨醇脱氢酶)一步法测定木糖异构酶活性(100mM，pH7.5Tris-HCl，500mM xylose，10mMMgCl₂，粗酶液10μl，1U SDH，0.15mM NADH，在340nm下检测NADH被氧化的量，即在340nm下做时间扫描)(Kuyper et al.，FEMS Yeast Research，2003，4：69-78)。

由于木糖异构酶酶活测定方法中用到的山梨醇脱氢酶(SDH)需要合适的反应温度，因此，对木糖异构酶最适酶活温度的研究采用XI-SDH(木糖异构酶偶联山梨醇脱氢酶)两步法测定( et al.，European Journal of Biochemistry，2002，269(1)：157-163)。第一步反应：100mM，pH7.5Tris-HCl，500mM xylose，10mMMgCl₂，粗酶液10μl。50％三氯乙酸终止反应，2M碳酸钠中和反应。第二步反应：取上一步反应液100μl，100mM pH7.5Tris-HCl，1U SDH，0.3mM NADH，在340nm下检测NADH被氧化的量，即在340nm下做时间扫描)。在100mM pH7.5Tris-HCl，10mMMgCl₂条件下，测定木糖异构酶在20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃下的酶活变化(图3)。蛋白含量的测定参照Bradford(1976)的考马斯亮兰(Comassie Blue)法。

结论：本发明的木糖异构酶在酿酒酵母中高活性表达。本发明的木糖异构酶是一种嗜温性木糖异构酶，最适酶活温度在60℃(图3)。30℃下，采用XI-SDH一步法测定木糖异构酶酶活(Kuyper et al.，FEMS Yeast Research，2003，4：69-78)，该酶酶活为1.3U/mg，高于Piromyces sp-E2来源的木糖异构酶酶活1.1U/mg(这一数据来自于本发明筛选的木糖异构酶同一批次的测定实验，同时，该数据与文献Kuyper et al.，FEMS Yeast Research，2003，4：69-78报道的一致)。

实施例3被转化的酵母菌株在木糖上生长和发酵实验

培养基成分：

酿酒酵母在具有下列成分的SC培养基中生长：0.67(w/v)％酵母氮源(yeast nitrogen base)；除尿嘧啶以外的氨基酸及嘌呤、嘧啶混合物(CSM-URA)。对于平板，培养基中添加1.8％琼脂，调节pH至6.5-7.0。

生长实验：

宿主酵母菌株BSPX042(表型：ura3-251，超表达XKS1；超表达PPP途径的RPE1 RKI1 TAL1 TKL1；敲除醛糖还原酶基因GRE3；且经过特殊修饰，破坏呼吸途径，并经过驯化而得)，分别用空载体pJFE3和插入新来源的木糖异构酶基因的载体pJFE3-RuXI转化，分别得到重组菌BSGX000和BSGX001。将两重组菌株分别在2％葡萄糖，2％木糖为共同碳源及2％木糖为唯一碳源的SC液体培养基中生长。通过测定600nm下在分光光度计中光密度的升高来监控生长。

结果：

生长实验的结果在图4和图5中。在2％葡萄糖，2％木糖为共同碳源的SC液体培养基中，在葡萄糖消耗阶段，重组菌BSGX000和BSGX001生长趋势差不多，μmax均为0.31。

葡萄糖耗尽后，BSGX001较BSGX000生长良好(图4)。在2％木糖为唯一碳源的SC液体培养基中，不含木糖异构酶基因的重组菌BSGX000没有生长；含有木糖异构酶基因Ru的重组菌BSGX001生长较好，μmax为0.16(图5)。

实施例4被转化的酵母菌株以木糖为唯一碳源的限氧乙醇发酵实验

培养基成分：

SC液体培养基：0.67(w/v)％酵母氮源(yeast nitrogen base)；除尿嘧啶以外的氨基酸及嘌呤、嘧啶混合物(CSM-URA)；2％木糖。

重组菌BSGX001在2％木糖为唯一碳源的SC液体培养基中限氧发酵实验。在100mL限氧瓶内进行发酵，发酵时间为72h，HPLC分析发酵底物木糖及产物乙醇的变化。

结果：

含有本发明的木糖异构酶的重组菌BSGX001，在2％木糖为唯一碳源的SC液体培养基中限氧发酵，乙醇产率达到0.24克每克生物量每小时，糖醇转化率达到44％，基本没有副产物木糖醇生成(图6)。

一种编码木糖异构酶的核酸分子及其编码的木糖异构酶专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。