专利摘要

本发明涉及一株中间克吕沃尔菌(Kluyveraintermedia)ZJB‑17004及其应用，其对催化N‑苯乙酰‑DL‑氨基酸生产L‑氨基酸对映体选择性值达到98％，对催化2‑N‑苯乙酰基‑4‑[羟基(甲基)磷酰基]‑DL‑丁酸制备2‑氨基‑4‑[羟基(甲基)磷酰基]‑L‑丁酸对映体选择性值达到99％。

权利要求

1.中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)ZJB-17004，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 2018033，保藏日期2018年1月15日，地址：中国·武汉·武汉大学，430072。

2.一种权利要求1所述中间克吕沃尔菌ZJB-17004在催化2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸制备2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用以中间克吕沃尔菌ZJB-17004经发酵培养获得湿菌体为催化剂，以2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸为底物，以缓冲液为反应介质构成pH8.5的反应体系，在25-55℃，100-200rpm条件下进行转化反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为10-200g/L，底物初始加入终浓度为10-500mM。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液用二氯甲烷萃取，将水层调pH至1.0-5.0，以1-6.0Bv/h的速度上样进行离子交换层析，先用去离子水洗涤，再用0.2-4.5M的氨水以0.5-3.0Bv/h进行洗脱，收集含目标组分的洗脱液，减压蒸馏至膏状，用甲醇溶解重结晶，取晶体干燥，得到2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸。

6.一种权利要求1所述中间克吕沃尔菌ZJB-17004在催化N-苯乙酰-DL-氨基酸制备N-苯乙酰-L-氨基酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用以中间克吕沃尔菌ZJB-17004经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以N-苯乙酰-DL-氨基酸为底物，以缓冲液为反应介质构成pH8.5的转化体系，在25-55℃，100-200rpm条件下进行转化反应，反应结束后，反应液经分离纯化，得到N-苯乙酰-L-氨基酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述转化体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为20-300g/L，所述底物初始加入终浓度为50-500mM。

9.如权利要求7所述应用，其特征在于所述N-苯乙酰-DL-氨基酸为下列之一：N-苯乙酰-DL-丙氨酸、N-苯乙酰-DL-丝氨酸、N-苯乙酰-DL-谷氨酸、N-苯乙酰-DL-酪氨酸、N-苯乙酰-DL-苏氨酸、N-苯乙酰-DL-缬氨酸、N-苯乙酰-DL-天冬氨酸、N-苯乙酰-DL-甲硫氨酸、N-苯乙酰-DL-亮氨酸、N-苯乙酰-DL-异亮氨酸、N-苯乙酰-DL-苯丙氨酸。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述湿菌体如下方法制备：(1)斜面培养：将中间克吕沃尔菌ZJB-17004接种至斜面培养基，在30℃培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HPO4 3.2g/L，K2HPO41.5g/L，Na2EDTA 0.06g/L，MnSO4 0.002g/L，MgSO4 0.001g/L，ZnSO40.002 g/L，FeSO40.01g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.8；

(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HPO43.2g/L，K2HPO41.5g/L，Na2EDTA 0.06g/L，MnSO4 0.002g/L，MgSO4 0.001g/L，ZnSO40.002g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.8；

(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h后，在12000g下离心10min，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HPO4 3.2g/L，K2HPO4 1.5g/L，Na2EDTA 0.06g/L，MnSO4 0.002g/L，MgSO4 0.001g/L，ZnSO4 0.002g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.8。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株产酰胺水解酶的菌株——中间克吕沃尔菌(Kluyveraintermedia)ZJB-17004，及其在催化N-苯乙酰基氨基酸制备手性氨基酸与催化氨基酸衍生物的N-苯乙酰基取代物制备手性氨基酸衍生物中的应用。

(二)背景技术

L-草铵膦化学名称为：4-[羟基(甲基)膦酰基]-L-高丙氨酸，是L-谷氨酸的一种结构类似物，能抑制谷氨酰胺合成酶(GS)活性，使植物体内氨积累，高浓度氨气积累阻断植物光呼吸作用，叶绿体结构的破坏以及基质的囊泡化，同时氨基酸合成受阻，导致细胞膜受损和细胞死亡，从而杀灭杂草。其具有广谱性，是世界第二大转基因作物耐受除草剂。

目前L-草铵膦合成方法有化学合成法和生物合成法。化学法主要通过以下4种方式构建L-草铵膦的手性中心：1)利用手性辅助试剂，手性诱导构建手性中心；2)以天然氨基酸为手性源，转化得到L-草铵膦；3)由手性催化剂催化的不对称合成反应；4)手性拆分外消旋体。但是化学法合成L-草铵膦工序多，收率较低，手性试剂成本高昂，且产生的三废量大，处理比较困难。生物法则具有严格的立体选择性，温和的反应条件、较高的收率和易于分离纯化等优势，因此，生物法生产L-草铵膦技术具有十分重要的产业化开发价值。

生物法生产L-草铵膦根据作用底物不同有蛋白酶水解双丙氨膦、通过磷酸二酯酶I、酰胺酶I和谷氨酰胺酶分步协同作用保持光学活性水解L-3-乙酰氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺、α-胰凝乳蛋白酶的拆分双丙氨膦乙酯、脱乙酰基酶拆分N-乙酰-草铵膦、酰胺酶拆分2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺、酯水解酶水解L-草铵膦-N-羧酸酐、腈水合酶水解草铵膦含腈底物、转氨酶催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸等。

目前合成L-草铵膦的化学方法主要有：1)手性辅助剂诱导法，以(S)-2-羟基-3-蒎酮为手性辅助剂制备，产率为51％，e.e.值为79％；以D-缬氨酸甲酯为手性辅助剂，需要-78℃低温反应，产率为51％，e.e.值为93.5％。2)天然氨基酸手性源法，以L谷氨酸为手性源，e.e.值为99.4％；L-蛋氨酸为手性源，总收率为42.3％，e.e.值为93.5％，需要用到剧毒碘甲烷。3)不对称合成法，不对称催化加氢——催化剂用量大且三甲基硅氰价格昂贵；不对称Strecker反应——用到剧毒氰化物；不对称Michael加成——催化剂用量大，且产品收率和e.e.值低。4)外消旋体拆分法，此方法最高收率86％，e.e.值最高99％，但拆分后D-草铵膦未转化，浪费原料。

用酰胺水解酶选择性催化拆分2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸制备L-草铵膦的重要有效成分2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸，为实现工业化路线的L-草铵膦合成提供了依据。

手性氨基酸及其衍生物在医药开发中的作用越来越大，目前的医药开发对手性纯度的要求越来越高。手性氨基酸生产工艺有化学拆分和酶法拆分等工艺。其中酶法拆分因为其条件温和，特异性强，污染小，较化学拆分有明显优势。其中酰胺水解酶选择性催化拆分N-苯乙酰基氨基酸生产手性氨基酸具有广阔的应用前景。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种能够产生酰胺水解酶的菌株——中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)ZJB-17004，及其在催化N-苯乙酰-DL-氨基酸衍生物(2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸)制备L-草铵膦的重要有效成分L-氨基酸衍生物(2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸)或催化N-苯乙酰-DL-氨基酸制备L-氨基酸中的应用，为化学-酶法生产L-草铵膦有效成分及L-氨基酸提供了新的酶源，促进了绿色化学催化的发展。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一株产酰胺水解酶菌株——中间克吕沃尔菌(Kluyveraintermedia)ZJB-17004，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M2018033，保藏日期2018年1月15日，地址：中国.武汉.武汉大学，430072。该菌株由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得，经检测具有催化合成L-草铵膦的能力。

第二方面，本发明提供一种所述中间克吕沃尔菌ZJB-17004在微生物催化拆分N-苯乙酰-DL-氨基酸衍生物(优选2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸)制备L-草铵膦的重要有效成分L-氨基酸衍生物(优选2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸)中的应用，所述应用为：以中间克吕沃尔菌ZJB-17004经发酵培养后的湿菌体为催化剂，以N-苯乙酰-DL-氨基酸衍生物(优选2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸)为底物，以缓冲液(优选氨水)为反应介质构成pH值为8.5的反应体系，在25-55℃，100-200rpm(优选30-40℃、150rpm)条件下进行转化反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到L-氨基酸衍生物(优选2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸)。所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为10-200g/L，优选50g/L，所述底物初始加入终浓度为10-500mM，优选100mM。所述反应体系还可以由中间克吕沃尔菌ZJB-17004经发酵培养获得的发酵液和底物构成，pH8.5；其中发酵液中湿菌体在整个反应体系中的终浓度10-200g/L，优选50g/L，底物在反应体系中的终浓度10-500mM，优选100mM。

所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液用二氯甲烷萃取，将水层调pH至1.0-5.0(优选2.5)，以1-6.0Bv/h(优选4Bv/h)的速度上样进行离子交换层析，先用去离子水洗涤，再用0.2-4.5M(优选1M)的氨水以0.5-3.0Bv/h(优选2Bv/h)进行洗脱，用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸检测洗脱液，滤纸变紫表明洗脱液含有2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸，收集含目标组分的洗脱液，减压蒸馏至膏状，用甲醇溶解重结晶，取晶体干燥，得到L-氨基酸衍生物(优选2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸)。

第三方面，本发明还提供一种所述中间克吕沃尔菌ZJB-17004在催化N-苯乙酰-DL-氨基酸制备L-氨基酸的应用，所述的应用以中间克吕沃尔菌ZJB-17004经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以N-苯乙酰-DL-氨基酸为底物，以缓冲液(优选氨水)为反应介质构成pH8.5的转化体系，在25-55℃，100-200rpm(优选30-40℃、150rpm)条件下进行转化反应，反应结束后，反应液经分离纯化，得到L-氨基酸。所述转化体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为20-300g/L(优选20-60g/L)，所述底物初始加入终浓度为50-500mM(优选100mM)。所述N-苯乙酰-DL-氨基酸为下列之一：N-苯乙酰-DL-丙氨酸、N-苯乙酰-DL-丝氨酸、N-苯乙酰-DL-谷氨酸、N-苯乙酰-DL-酪氨酸、N-苯乙酰-DL-苏氨酸、N-苯乙酰-DL-缬氨酸、N-苯乙酰-DL-天冬氨酸、N-苯乙酰-DL-甲硫氨酸、N-苯乙酰-DL-亮氨酸、N-苯乙酰-DL-异亮氨酸、N-苯乙酰-DL-苯丙氨酸。所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液用二氯甲烷萃取，将水层调pH至1.0-5.0(优选2.5)，以1-6.0Bv/h(优选4Bv/h)的速度上样进行离子交换层析，先用去离子水洗涤，再用0.2-4.5M(优选1M)的氨水以0.5-3.0Bv/h(优选2Bv/h)进行洗脱，用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸检测洗脱液，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有L-氨基酸，收集含目标组分的洗脱液，减压蒸馏至膏状，用甲醇溶解重结晶，取晶体干燥，得到L-氨基酸。

所述N-苯乙酰-DL-氨基酸按如下方法制备：氨基酸和NaOH加入蒸馏水中，4℃冰浴条件下充分搅拌至溶液无色透明，滴加苯乙酰氯，滴加完成后，继续4℃冰浴条件反应2h，再常温(25-30℃)搅拌反应5h至溶液呈无色透明，加HCl调节pH至1.5-5.5(优选2-4)，析出固体，抽滤烘干，得到N-苯乙酰-DL-氨基酸；所述氨基酸与NaOH摩尔比为1：1～7(优选1:1.5-2.5)；所述氨基酸与苯乙酰氯摩尔比为1：0.1～2(优选1:0.5-1.0)，所述蒸馏水体积用量以氨基酸质量计为3-10ml/g；所述氨基酸为下列之一：丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、苏氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸。

本发明所述中间克吕沃尔菌ZJB-17004经发酵获得的湿菌体按如下方法制备：

(1)斜面培养：

将中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)ZJB-17004接种至斜面培养基，在30℃培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度为：乳糖1-12g/L，蛋白胨1-10g/L，Na2HPO40.5-5.3g/L，K2HPO4 0.5-6.0g/L，Na2EDTA 0.01-0.3g/L，MnSO4

0.0001-0.001g/L，MgSO4 0.001-0.002g/L，ZnSO4 0.001-0.01g/L，FeSO4 0.001-0.03g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.5-7.5；优选斜面培养基终浓度组成为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HPO4 3.2g/L，K2HPO4 1.5g/L，Na2EDTA0.06g/L，MnSO4 0.002g/L，MgSO4 0.001g/L，ZnSO40.002g/L，FeSO4 0.01g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.8。

(2)种子培养

从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：乳糖1-12g/L，蛋白胨1-10g/L，Na2HPO4 0.5-5.3g/L，K2HPO40.5-6.0g/L，Na2EDTA 0.01-0.3g/L，MnSO4 0.0001-0.001g/L，MgSO40.001-0.002g/L，ZnSO40.001-0.01g/L，FeSO4 0.001-0.03g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.5-7.5；优选种子培养基终浓度组成为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HPO4 3.2g/L，K2HPO4 1.5g/L，Na2EDTA 0.06g/L，MnSO4 0.002g/L，MgSO4 0.001g/L，ZnSO40.002g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.8。

(3)发酵培养

将种子液以体积浓度1～10％(优选1％)的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h后，在12000g下离心10min，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为：乳糖1-12g/L，蛋白胨1-10g/L，Na2HPO4 0.5-5.3g/L，K2HPO40.5-6.0g/L，Na2EDTA 0.01-0.3g/L，MnSO4 0.0001-0.001g/L，MgSO4 0.001-0.002g/L，ZnSO4 0.001-0.01g/L，FeSO40.001-0.03g/L,溶剂为去离子水，pH值为6.5-7.5；优选发酵培养基终浓度组成为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HPO4 3.2g/L，K2HPO4 1.5g/L，Na2EDTA 0.06g/L，MnSO4 0.002g/L，MgSO40.001g/L，ZnSO40.002g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.8。

本发明所述pH值为8.5的缓冲液构成为：柠檬酸缓冲液(100mM,pH 4.0-6.0)，磷酸缓冲液(100mM,pH 6.0–8.0)，Tris-HCl(100mM,pH 7.0–9.0)，硼酸缓冲液(100mM,pH 9.0–10.5)，氨水缓冲液(以氨水调节底物溶液pH为7.0–10.0)，罗二氏缓冲液(100mM,pH10.5–12.0)；优选缓冲液组成为：以氨水调节底物溶液pH为8.5。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株能够产生酰胺水解酶的菌株--中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)ZJB-17004，本发明还提供了利用中间克吕沃尔菌ZJB-17004经发酵培养获得湿菌体做为生物催化剂催化2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸制备L-草铵膦的重要有效成分2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸的方法，对2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]丁酸转化率达到49.5％，产物L-草铵膦达到e.e.％＝99.9％，本发明还提供了利用中间克吕沃尔菌ZJB-17004经发酵培养获得湿菌体做为生物催化剂催化N-苯乙酰-DL-氨基酸制备L-氨基酸的方法，其转化率能达到49％，产物手性氨基酸可达到e.e.％＝99-99.9％，拆分制备过程绿色高效，菌株易于培养收集应用，催化反应条件温和，具有重要的应用前景。

(四)附图说明：

图1为高通量筛选方法下OPA/NAC-草铵膦的浓度标准曲线。

图2为柱前衍生化反相高效液相色谱下2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸和2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-D-丁酸的液相结果图谱。

图3为筛选所得菌株中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)ZJB-17004的电镜观察结果。

(五)具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：本发明所述超纯水为UP水，是指电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水。本发明所述氨水是含氨25％～28％的水溶液。本发明所述常温为25-30℃。本发明实施例所述冰浴均为4℃。本发明2％茚三酮溶液配制方法为：将2g茚三酮与0.08g氯化亚锡溶于100mL超纯水中，然后搅拌过滤，取滤液避光保存。

实施例1：中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)ZJB-17004的筛选

1、初筛

本发明从全国各地取土样，共取土样80份。筛选的具体方法：称取1g土样置于10mL0.85％的生理盐水中，摇晃后静置，取上清液至富集培养基中，于30℃，150r/min振荡培养2-3天。取1mL富集液加入50mL新鲜富集培养基中，如此重复3次后进行分离纯化。

选用溴百里香酚蓝滤纸作为指示滤纸检测能够降解底物的菌落。其原理为：含目的酶的菌落利用降解底物后，会产生酸性副产物(苯乙酸、乙酸、甲酸、苯甲酸)，从而使指示滤纸局部的pH值发生改变。指示剂溴百里香酚蓝变色范围为5.8-7.6(黄-蓝)，因此能利用含氯有机物的菌落周围呈现黄色，而不能利用的则菌落周围平板颜色仍为青绿色。

将富集液用无菌0.85％生理盐水逐级稀释10个梯度，选取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10五个梯度的稀释液各取0.1mL均匀涂布在平板筛选培养基上，30℃恒温培养48h。将浸湿含有10％的溴百里酚蓝的无菌滤纸(指示滤纸)平铺于平板上，挑取指示滤纸上显示为黄色的对应的菌落接种到含有生长培养基的96孔板中，放入30℃、180rpm摇床恒温培养，期间检测OD600的吸光值，绘制生长曲线，当菌株生长到对数期时候，转接300μl新鲜发酵培养基，接种96孔板后剩下的菌液密封保藏于4℃冰箱，作为菌种备用。转接后的含发酵培养基96孔板于30℃、180rpm摇床恒温培养48h，使其充分生长与产酶，获得菌悬液。

2、OPA/NAC高通量筛选

将底物2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸溶于氨水，加入1ml步骤1制备的菌悬液，用氨水调节溶液pH值至8.5，构成10mL反应体系，使底物终浓度为50mM，于30℃、180rpm摇床恒温反应24h。所得转化液分别用超纯水对应稀释10倍，4℃冰浴，用OPA/NAC高通量筛选方法进行检测，筛选出相对荧光值较高的菌株。

OPA/NAC高通量筛选方法：用排枪吸取稀释后的冰浴反应液40μl至96孔荧光检测板，加入冰浴后的A液，酶标仪中振荡30s，再加入100μl超纯水，再次振荡30s，在λex＝340nm；λem＝455nm，测定荧光强度值，所得荧光强度值与2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸标准曲线对比即可得到样品中所含2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸的浓度，继而可以计算出2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸的产量，得到菌株催化拆分2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸制备L-草铵膦的重要有效成分2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸的转化率。

所述A液：N-乙酰-L-半胱氨酸(0.448g)与邻苯二甲醛(0.185g)溶于10mL无水乙醇，冰浴条件下加入硼酸缓冲液(140mM，pH 9.5)定容至50mL，冰浴条件下保存，可保存3天，所A液中N-乙酰-L-半胱氨酸终浓度0.313mol/L，邻苯二甲醛终浓度0.138mol/L。

所述2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸标准曲线制作方法：用超纯水配制5g/L的2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸标准溶液，稀释成3个浓度梯度：0.01～0.1g/L(0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1g/L)、0.1～1.0g/L(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L)、1.0～5.0g/L(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L)，用排枪分别吸取不同浓度梯度的标准溶液40μl至96孔微孔荧光检测板，分别加入40μl配制好的冰浴保存的A液，在酶标仪中振荡30s，再分别加入100μl超纯水，再振荡30s，在，在λex＝340nm；λem＝455nm，测定荧光强度值，以所得荧光强度值为纵坐标，对应标品浓度为横坐标，制作标准曲线。共制得3个浓度范围的标准曲线，可知在样品浓度为0.01～0.1g/L时候线性良好(如图1)，R2＝0.9978,表明此法有很高的准确性和适用性。

3、高效液相色谱复筛

将步骤2筛选出菌株接种到斜面培养基，30℃培养48h后，于4℃冰箱保存。

将保存于斜面上的菌株接种至种子培养基中，在30℃培养24h。将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h。在12000g下离心5min，收集湿菌体。取湿菌体，加入底物2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸和氨水，用氨水调节溶液pH 8.5，构成10mL反应体系，湿菌体终浓度50g/L，底物终浓度50mM，置于30℃水浴摇床转化24h。取1mL转化液，离心分离后取上清液进行HPLC分析，最终得到一株催化活力较高的野生菌株，并将此菌株记为菌株ZJB-17004。

高效液相色谱(HPLC)复筛方法为：将上述转化液离心取上清，用超纯水稀释10倍后，取200μl至干净1.5mL EP管，加入衍生化试剂200μl，在30℃反应5min后，加入600μl超纯水混匀后，用针筒滤膜(0.22μm)过滤后，放入HPLC进行检测，得到反应液中2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-丁酸的浓度。

所述衍生化试剂：0.1g邻苯二甲醛、0.12g N-苯乙酰-L-半胱氨酸，用10mL无水乙醇溶解后，用硼酸缓冲液(100mM，pH 9.8)的定容至50mL。

所述HPLC条件：美国戴安U3000高效液相色谱仪并配备荧光检测器；戴安C18硅羟基填料柱(250mm×4.6mm)；流动相为含10％纯甲醇的乙酸铵(50mM pH 4.7)溶液，柱温控制在35℃，荧光激发波长λex＝350nm、发射波长λem＝450nm，进样量为10μl。在此条件下，2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸和2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-D-丁酸的出峰时间为7.800min、9.290min(如图2)。

富集培养基组成：2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸1g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠1g/L，K2HPO4·3H2O 0.8g/L，KH2PO4 3.3g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，溶剂为去离子水，pH为7。

平板筛选培养基组成：2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸1g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠1g/L，K2HPO4·3H2O 0.8g/L，KH2PO4 3.3g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH为7。

生长培养基组成：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，溶剂为去离子水。斜面培养基、种子培养基、发酵培养基组成同实施例3。实施例2：菌株ZJB-17004鉴定

1、形态学鉴定：

本发明实施例1筛选得到的菌株ZJB-17004在固体培养基上，37℃培养24小时后形成圆形或近圆形，质地软，表面较光滑，扁平，边缘整齐，有光泽不透明的乳白色菌落，直径2-4mm。革兰氏染色观察：粉红色短杆状，无芽孢。固体培养基组成：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水。

2、生理生化鉴定：

利用Biolog(GENⅢ)自动微生物鉴定系统对菌株ZJB-17004进行了94种表型测试，包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测：将菌株接种于BUG平板培养基(BIOLOG UNIVERSAL GROWTH AGAR)，33℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(IF-A)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至91％T/IF-A。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在BiologGENⅢ微孔鉴定板的各孔中，每孔100μL。将微孔鉴定板放在33℃培养箱中，分别在培养12h、24h、36h、48h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。

菌株ZJB-17004经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株ZJB-17004可较强利用65种碳源，对其他2种碳源不能利用或利用能力较弱；菌株ZJB-17004对23种化学物质敏感。Biolog系统给出48h鉴定结果如表1和表2所示。

表1.菌株ZJB-17004对BiologGENⅢ板上71种碳源的利用能力

表2.菌株ZJB-17004对BiologGENⅢ板上23种化学物质的化学敏感性

3、分子生物学鉴定：

以菌株ZJB-17004的总DNA为模板，利用引物P1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和P2:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'扩增菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接后，委托上海生工对该菌16S rDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1所示)后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rDNA基因序列，并进行同源性比对。菌株ZJB-17004与Kluyvera intermedia菌株256同源性最高(homology，99％，basedon 16S ribosomal RNA gene)，根据微生物遗传学鉴定原则，基于16S rDNA同源性高于95％，鉴定菌基本属于对照菌。因此，本实验鉴定菌株ZJB-17004为中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)，拟命名为中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)ZJB-17004，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 2018033，保藏日期2018年1月15日，地址：中国.武汉.武汉大学，430072。

任何对核苷酸序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入所得的核苷酸序列，只要与该序列具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

实施例3：湿菌体的制备

(1)斜面培养：

将中间克吕沃尔菌ZJB-17004接种至斜面培养基，在30℃培养48h，获得斜面菌体；

所述斜面培养基终浓度为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HPO4 3.2g/L，K2HPO41.5g/L，Na2EDTA0.06g/L，MnSO4 0.002g/L，MgSO4 0.001g/L，ZnSO40.002g/L，FeSO4 0.01g/L，琼脂为20g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.8。

(2)种子培养

从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃培养24h，获得种子液；

所述种子培养基终浓度组成为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HPO4 3.2g/L，K2HPO41.5g/L，Na2EDTA 0.06g/L，MnSO4 0.002g/L，MgSO4 0.001g/L，ZnSO4 0.002g/L，FeSO40.01g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.8。

(3)发酵培养

将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h后，在12000g下离心10min，收集湿菌体；

所述发酵培养基终浓度组成为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HPO4 3.2g/L，K2HPO41.5g/L，Na2EDTA 0.06g/L，MnSO4 0.002g/L，MgSO4 0.001g/L，ZnSO40.002g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.8。

实施例4:以2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸为底物的生物转化反应

(1)将底物2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.3g，并用氨水调节pH 8.5，构成10mL反应体系，使底物终浓度为50mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至ep管中，离心分离后取上清液实施例1中所述方法进行HPLC分析检测。结果表明，ZJB-17004可使底物2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸转化得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸，转化率为49.9％，产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸的光学纯度为99.9％。

(2)将酶催化反应得到的含产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸的转化液进行分离，提取出产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸。

1)萃取：

将得到的转化液加入分液漏斗，同时加入等体积的二氯甲烷，摇晃后静置3h，从分液漏斗下端放出有机层，从上端倒出水相层。得到水相层为含有产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸的水溶液。

2)用阴离子交换树脂进行产物分离

①树脂预处理

离子交换树脂201×7用50℃温水浸泡，使树脂充分膨胀并除去细小颗粒(倾斜或者浮选法)；先用1.0M的NaOH水溶液浸泡3h，用去离子水洗至中性，再用1.0M的HCl水溶液浸泡3h后用去离子水洗至中性，然后用1.0M的NaOH水溶液浸泡3h，转化为OH-形式，最后用去离子水洗至中性备用。

②装柱

采用湿法装柱(内径1.5cm，高40cm)，先在离子交换柱内先加入13cm高度的去离子水，再取30mL湿树脂201×7装入玻璃杯，加入50mL去离子水，慢慢搅拌，悬浮状的树脂倒入离子交换柱中，让其自然沉降，使其在柱子内分泌均匀，不应有明显的分界线及气泡产生等。

③上样，洗脱

将步骤1)所得的水溶液调至pH 2.5，以上柱流速4.0Bv/h进行上样，每隔一段时间取出流出液进行液相检测，当吸附达到最高值时，先用去离子水洗涤，再用1.0M的氨水进行洗脱，洗脱速度为2.0Bv/h，用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫色表明洗脱液含有目标物质2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸，收集目标组分洗脱液，每隔一段时间检测其中所含有的2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸的含量。洗脱完毕后用去离子水洗涤离子交换柱，并将树脂转化成OH-用于下一次分离。

④纯化

洗脱液减压蒸馏得到黄色粘稠物质，加入甲醇溶解，冰浴下搅拌重结晶得到白色固体，过滤即得产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸。

以步骤(1)反应条件制备的转化液1L经上述方法分离纯化后，得到2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸固体4.9g，产物得率98.9％，光学纯度为99.9％。

实施例5以2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸为底物的生物转化反应

将底物2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.5g，用氨水调节pH 8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为100mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法分离纯化后，得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸9.3g，产物得率93.9％，光学纯度为99.9％。

实施例6：以2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸为底物的生物转化反应

将底物2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.6g，用氨水调节pH 8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为200mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法分离纯化后，得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸19.2g，产物得率96.4％，光学纯度为99.9％。

实施例7：以2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸为底物的生物转化反应

将底物2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体2g，用氨水调节pH 8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为200mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h，取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法分离纯化后，得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸19.4g，产物得率97.4％，光学纯度为99.9％。

实施例8：以2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸为底物的生物转化反应

将底物2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.5g，用氨水调节pH 8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为50mM，置于40℃水浴摇床，150rpm转化24h，取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法分离纯化后，得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸4.87g，产物得率98.4％，光学纯度为99.9％。

实施例9：以2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸为底物的生物转化反应

将底物2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体2g，用氨水调节pH 8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为200mM，置于50℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法分离纯化后，得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸19.4g，产物得率97.4％，光学纯度为99.9％。

实施例10：以N-苯乙酰基DL-丙氨酸为底物的生物转化反应

6.0g丙氨酸和4.6g NaOH加入30ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液无色透明，滴加5.0g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈淡黄色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h至溶液呈无色透明，加HCl调节pH至2.0左右，析出白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为N-苯乙酰-DL-丙氨酸13g。

将底物N-苯乙酰-DL-丙氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.6g，用氨水调节pH 8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为100mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.8％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物L-丙氨酸4.25g，产物得率95.5％，光学纯度为99.9％。

实施例11：以N-苯乙酰基DL-苏氨酸为底物的生物转化反应

6.0g苏氨酸和4.6g NaOH加入30ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液无色透明，滴加5.0g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈淡黄色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h至溶液呈无色透明，加HCl调节pH至2.0左右，析出白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为N-苯乙酰-DL-苏氨酸10.35g。

将底物N-苯乙酰-DL-苏氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体3g，用氨水调pH 8.5，构成100mL反应体系，其中底物加入终浓度为100mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.5％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物L-苏氨酸5.54g，产物得率93.1％，光学纯度为99.9％。

实施例12：以N-苯乙酰基DL-酪氨酸为底物的生物转化反应

3.619g DL-酪氨酸和1.8g NaOH加入25ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液透亮，滴加2.875g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈乳白色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加HCl调节pH至2.0左右，析出大量白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为N-苯乙酰-DL-酪氨酸5.5g。

将底物N-苯乙酰-DL-酪氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.3g，用氨水调节pH 8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为100mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.0％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物L-酪氨酸8.72g，产物得率96.3％，光学纯度为99.9％。

实施例13：以N-苯乙酰基DL-苯丙氨酸为底物的生物转化反应

3.3g DL-苯丙氨酸和1.8g NaOH加入25ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌，溶液透亮，滴加2.875g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈乳白色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加HCl调节pH至4.0左右，析出大量白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为N-苯乙酰-DL-苯丙氨酸5.2g。

将底物N-苯乙酰-DL-苯丙氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.4g，用氨水调节pH 8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为100mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.2％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物L-苯丙氨酸7.82g，产物得率94.7％，光学纯度为99.9％。

实施例14：以N-苯乙酰基DL-亮氨酸为底物的生物转化反应

3.92g亮氨酸和3.2g NaOH加入30ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液透亮，滴加6.2g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈淡黄色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加HCl调节pH至2.0左右，析出大量白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为N-苯乙酰-DL-亮氨酸7.43g。

将底物N-苯乙酰-DL-亮氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.6g，用氨水调节pH 8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为100mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.4％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物L-亮氨酸5.94g，产物得率90.6％，光学纯度为99.9％。

实施例15：以N-苯乙酰基DL-异亮氨酸为底物的生物转化反应

7.84g异亮氨酸和6.4g NaOH加入60ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌，溶液透亮，滴加5.78g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈淡黄色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加HCl调节PH至2.0左右，溶液变为无色透明，析出少量白色固体,抽滤烘干得到白色固体即为N-苯乙酰-DL-异亮氨酸7.28g。

将底物N-苯乙酰-DL-异亮氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.5g，用氨水调节pH 8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为100mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.5％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物L-异亮氨酸6.12g，产物得率93.4％，光学纯度为99.9％。

实施例16：以N-苯乙酰基DL-丝氨酸为底物的生物转化反应

6.0g丝氨酸和4.6g NaOH加入20ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液无色透明，滴加5.2g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈淡黄色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，溶液呈无色透明，加HCl调节PH至2.0左右，析出白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为N-苯乙酰-DL-丝氨酸11g。

将底物N-苯乙酰-DL-丝氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.5g用氨水调节溶液pH为8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为100mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.2％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物L-丝氨酸4.86g，产物得率92.5％，光学纯度为99.9％。

实施例17：以N-苯乙酰基DL-甲硫氨酸为底物的生物转化反应

8.94g甲硫氨酸和7.2g NaOH加入120ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液透亮，滴加10.3g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈透明，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加HCl调节PH至2.0左右，析出大量白色固体，减压抽滤烘干得到N-苯乙酰-DL-甲硫氨酸14.8g。

将底物N-苯乙酰-DL-甲硫氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.45g，用氨水调节溶液pH为8.5构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为100mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.3％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物L-甲硫氨酸7.03g，产物得率94.4％，光学纯度为99.9％。

实施例18：以N-苯乙酰基DL-缬氨酸为底物的生物转化反应

9.36g缬氨酸和7.2g NaOH加入60ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液透亮，滴加14.24g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈微黄色，略有浑浊，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，溶液变无色透明，加HCl调节PH至2.0左右，析出大量白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为N-苯乙酰-DL-缬氨酸17.3g。

将底物N-苯乙酰-DL-缬氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.2g，用氨水调节溶液pH为8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为100mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至EP管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.2％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物L-缬氨酸5.6g，产物得率95.7％，光学纯度为99.9％。

实施例19：以N-苯乙酰基DL-谷氨酸为底物的生物转化反应

5g谷氨酸和4.6g NaOH加入30ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液透亮，滴加5.735g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈透明，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加HCl调节pH至2.0左右，溶液变浑浊，4℃冰箱冷藏过夜后析出大量白色固体，减压抽滤烘干得到N-苯乙酰-DL-谷氨酸8.1g。

将底物N-苯乙酰-DL-谷氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.4g，用氨水调节溶液pH为8.5，构成10mL反应体系，其中底物加入终浓度为100mM，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1mL转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行HPLC分析检测得转化率49.1％。同样反应条件下制备1L转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物L-谷氨酸7.12g，产物得率96.8％，光学纯度为99.9％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 中间克吕沃尔菌ZJB-17004及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1400

<212> DNA

<213> 中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)

<400> 1

cgccctcccg aaggttaagc tacctacttc ttttgcaccc actcccatgg tgtgacgggc 60

ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgtagcattc tgatctacga ttactagcga 120

ttccgacttc atggagtcga gttgcagact ccaatccgga ctacgacata ctttatgagg 180

tccgcttgct ctcgcgaggt cgcttctctt tgtatatgcc attgtagcac gtgtgtagcc 240

ctactcgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccagt ttatcactgg 300

cagtctcctt tgagttcccg gccgaaccgc tggcaacaaa ggataagggt tgcgctcgtt 360

gcgggactta acccaacatt tcacaacacg agctgacgac agccatgcag cacctgtctc 420

agagttcccg aaggcaccaa agcatctctg ctaagttctc tggatgtcaa gagtaggtaa 480

ggttcttcgc gttgcatcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540

attcatttga gttttaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtcgactta acgcgttagc 600

tccggaagcc acgcctcaag ggcacaacct ccaagtcgac atcgtttacg gcgtggacta 660

ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcac ctgagcgtca gtctttgtcc 720

agggggccgc cttcgccacc ggtattcctc cagatctcta cgcatttcac cgctacacct 780

ggaattctac ccccctctac aagactctag cctgccagtt tcgaatgcag ttcccaggtt 840

gagcccgggg atttcacatc cgacttgaca gaccgcctgc gtgcgcttta cgcccagtaa 900

ttccgattaa cgcttgcacc ctccgtatta ccgcggctgc tggcacggag ttagccggtg 960

cttcttctgc gagtaacgtc aatcgctgca gttattaact acagcgcctt cctcctcgct 1020

gaaagtactt tacaacccga aggccttctt catacacgcg gcatggctgc atcaggcttg 1080

cgcccattgt gcaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctggacc gtgtctcagt 1140

tccagtgtgg ctggtcatcc tctcagacca gctagggatc gtcgcctagg tgagccgtta 1200

ccccacctac tagctaatcc catctgggca catccgatgg tgtgaggccc gaaggtcccc 1260

cactttggtc ttgcgacgtt atgcggtatt agctaccgtt tccagtagtt atccccctcc 1320

atcgggcagt ttcccagaca ttactcaccc gtccgccact cgtcacccaa gagcaagctc 1380

tctgtgctac cgttcgactg 1400

中间克吕沃尔菌ZJB-17004及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。