专利摘要

本发明公开了对S‑敌草胺具有专一转化功能的菌株、酰胺水解酶、编码基因及其应用。一株降解敌草胺的菌株Sphingobiumsp.B2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年10月16号，保藏编号为CCTCCNO:M2018684。一种对S‑敌草胺具有专一性选择功能的酰胺水解酶基因snaH，核苷酸序列为：SEQIDN0.1，其编码的蛋白序列如SEQIDN0.2所示。本发明提供的SnaH纯酶能在1h内完全降解0.4mM的S‑敌草胺，而对R‑敌草胺没有任何降解作用，可用于酶法拆分敌草胺外消旋体，生产光学纯的R‑敌草胺，也可用于去除环境中S‑敌草胺污染，具有非常重要的理论价值和应用前景。

权利要求

1.一株对S-敌草胺具有专一转化功能的菌株Sphingobium sp. B2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年10月16号，保藏编号为CCTCC NO:M2018684。

2.权利要求1所述的菌株Sphingobium sp. B2在降解S-敌草胺或对Rac-敌草胺进行光学拆分得到R-敌草胺中的应用。

3.一种酰胺水解酶基因snaH，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。

4.权利要求3所述的酰胺水解酶基因snaH编码的酰胺水解酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。

5.含有权利要求3所述的酰胺水解酶基因的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于将权利要求3所述的酰胺水解酶基因snaH插入pET-28a (+)的NdeI和XhoI位点之间，并保留N端的组氨酸标签纯化蛋白所得。

7.含有权利要求3所述的酰胺水解酶基因snaH的基因工程菌。

8.权利要求3所述的酰胺水解酶基因snaH在降解S-敌草胺中的应用。

9.权利要求4所述的酰胺水解酶在去除环境中S-敌草胺或在手性拆分外消旋体敌草胺生产光学纯R-敌草胺中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术、应用于污染环境微生物修复技术和手性农药酶学拆分领域， 涉及一种专一性去除敌草胺外消旋体中活性低、毒性大的S-敌草胺的菌株、酰胺水解酶、编码 基因及其应用。

背景技术

手性异构体是指实物与镜像不能重叠、存在着一对互为镜像关系而又不能重合的对映 异构体。目前具有手性异构体的农药在全球农药市场中约占28％，而我国手性农药占比更高， 达到40％。由于生物体对手性异构体的识别差异、异构体与靶标位点匹配性差异等，手性异构 体在生物活性、毒理学及环境行为等方面也存在差异，有时甚至表现出截然相反的生理效应。 因此，手性农药的污染风险和安全使用越来越受到关注，制备光学纯手性农药正日益受到工业 界的重视。

敌草胺((RS)-N,N-二乙基-2-(α-萘氧基)丙酰胺，又名草萘胺)是一种重要的酰胺类高效、 广谱性、选择性芽前土壤除草剂，具有R型和S型两种手性异构体，目前市场上销售使用的 敌草胺均为外消旋体(R型和S型两种手性异构体等比例混合物)。敌草胺除草机理是阻断细 胞周期中G1和G2蛋白形成，抑制DNA合成及细胞有丝分裂，从而使根生长受影响，心叶卷 曲最后死亡。敌草胺进入田间后，其在土壤中的半衰期长达两个月，如使用不当会对后茬作物 产生药害。敌草胺对幼虾的急性中毒试验表明其安全浓度为0.389mg/L，而农业上一般使用浓 度在3-6.66mg/L范围，可能会通过食物链对人畜产生不良影响。此外，敌草胺具有较大的水 溶性(73mg/L，25℃)，残留在土壤中的敌草胺容易进入地表水或地下水，是一种潜在的水污染 物。

最新研究表明，R-敌草胺在0.05mg/L浓度下对稗草根生长抑制效果是S-敌草胺的9.4 倍，而S-敌草胺(EC20值小于0.1mg/L)对铜绿微囊藻的毒性却显著高于R-敌草胺(EC20值为0.1-1mg/L)。目前国内市场上使用的敌草胺均为外消旋体，不可避免地导致毒性高且除 草活性低的S-敌草胺在环境中大量残留。利用化学方法合成光学纯敌草胺或拆分外消旋体存在 难度大、成本高、污染重、环境不友好等缺陷。因此，利用对敌草胺手性异构体具有专一性识 别的酶进行敌草胺外消旋体的拆分，获得光学纯的R-型敌草胺具有重要的创新性和应用前景。 然而，关于对敌草胺具有手性异构体立体选择性菌株、酶和基因还未见报道。

获得敌草胺降解菌株和降解基因在制备光学纯R-敌草胺，提高药效、减少S-敌草胺残 留的环境污染的技术研发中具有以下作用和功能：1.通过现代酶催化和转化技术，优化敌草 胺生产工艺，去除敌草胺中低效、高毒的S-敌草胺异构体，提高药效并减少环境污染。2.通 过现代微生物发酵技术将敌草胺降解菌株和酶蛋白制成降解菌剂或酶制剂应用于S-敌草胺污 染环境的修复与去除。因此，手性农药中低效、高毒异构体的微生物专一性降解和手性农药拆 分具有非常重要的理论和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种对S-敌草胺具有立体选择性的菌株Sphingobiumsp.strain B2、 酰胺水解酶基因snaH及其编码的蛋白质及其应用，该菌株以及酰胺水解酶能专一性地降解除 草效果低、环境毒性高的S-敌草胺，因此，该菌株以及酰胺水解酶可应用于敌草胺生产工艺， 专一性地去除S-敌草胺，获得低毒、高除草活性的光学纯的R-敌草胺。也可通过发酵工艺生 产降解菌剂或酶制剂应用于S-敌草胺污染环境的修复与去除。

本发明的另一目的是提供降解S-敌草胺的菌株Sphingobium sp.B2及其在生物修复S- 敌草胺环境污染中的应用。

一株降解敌草胺的菌株Sphingobium sp.B2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日 期为2018年10月16号，保藏编号为CCTCC NO:M2018684。

一种对S-敌草胺具有专一性选择功能的酰胺水解酶基因snaH，核苷酸序列为：SEQID N0.1。

本发明所述的酰胺水解酶基因编码的酰胺水解酶，氨基酸序列为：SEQ ID N0.2。

含有所述的酰胺水解酶基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体，优选是将所述的酰胺水解酶基因snaH插入pET-28a(+)的NdeI 和XhoI位点之间，并保留N端的组氨酸标签纯化蛋白。

含有所述的酰胺水解酶基因snaH的基因工程菌。

所述的基因工程菌的表达菌株优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明所述的酰胺水解酶在降解和转化S-敌草胺中的应用。

本发明所述的酰胺水解酶在去除环境中S-敌草胺的应用。

本发明所述的重组表达载体在降解S-敌草胺中的应用。

本发明所述的酰胺水解酶在手性拆分外消旋体敌草胺生产光学纯R-敌草胺中的应用。

本发明的有益效果如下：

1.本发明从土壤中筛选分离到一株能专一性降解S-敌草胺的菌株Sphingobiumsp.B2。 通过基因组测序和基因比对方法成功克隆到酰胺水解酶基因snaH，在GenBank比对结果表明 该基因为一个新的基因，是首个公开的能专一性降解S-敌草胺的基因，该基因全长(从起始密 码子到终止密码子)为1377bp，编码458个氨基酸。

3.本发明提供的SnaH纯酶能在1h内完全降解0.4mM的S-敌草胺，而对R-敌草胺没有任何降解作用，可用于酶法拆分敌草胺外消旋体，生产光学纯的R-敌草胺，也可用于去除环境中S-敌草胺污染，具有非常重要的理论价值和应用前景。

附图说明

图1Sphingobium sp.strain B2降解外消旋敌草胺(Rac-NAP)，R-敌草胺(R-NAP)和 S-敌草胺(S-NAP)的降解曲线。

图2酰胺水解酶SnaH降解Rac-敌草胺，R-敌草胺，S-敌草胺的HPLC图谱。

图3酰胺水解酶基因snaH在BL21(pET-28a(+))中的表达策略图。

图4酰胺水解酶SnaH的SDS-PAGE图。M：蛋白marker，1：IPTG诱导的BL21(SnaH) 粗酶，2：粗酶穿透液，3：50mM咪唑洗脱液，4：100mM咪唑洗脱液，5：150mM咪唑洗 脱液，6：200mM咪唑洗脱液，7：250mM咪唑洗脱液，8：300mM咪唑洗脱液。

图5酰胺水解酶SnaH降解S-敌草胺代谢产物的LC-MS/MS图谱。

图6酰胺水解酶SnaH手性拆分敌草胺外消旋体示意图。

生物材料保藏信息

敌草胺降解菌株B2，分类命名为Sphingobium sp.B2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 日期为2018年10月16号，保藏编号为CCTCC NO:M2018684，保藏地点为中国.武汉.武汉大 学。

具体实施方式

实施例1

1.1敌草胺降解菌株B2的分离筛选

从江苏南通生产敌草胺原药的某农药厂采集活性污泥。取活性污泥4.0g加入100mL 基础盐培养基中，加入终浓度为0.2mM的Rac-敌草胺，30℃，180rpm/min培养6天，以5％ (V/V)的接种量转接到新鲜无菌的基础盐培养基中，连续转接两次，利用紫外分光光度计和 高效液相色谱仪检测第三代富集液中敌草胺的含量及是否有新的代谢产物的生成。对有降解效 果的富集液进行梯度稀释,取10^-2至10^-5梯度稀释富集液各100μL，分别涂布于加有0.8mM Rac-敌草胺的1/10LB固体培养基上，30℃培养10d，挑取平板上的单菌落于LB试管中培养 至指数期，再将得到的菌液接种于加有Rac-敌草胺的基础盐液体培养基中，30℃，180rpm/min 培养6天，然后验证各单菌落是否具有敌草胺降解功能。

基础盐培养基(1L)配方为：1.0g NaCl，1.0g NH₄NO₃，1.5g K₂HPO₄，0.5g KH₂PO₄，0.2g MgSO₄，加去离子水至1L，pH 7.0。

LB培养基(1L)配方为：5.0g NaCl，5.0g酵母粉，10g蛋白胨，加入去离子水至 1L，pH 7.0。

1/10LB培养基(1L)配方为：0.5g NaCl，0.5g酵母粉，1g蛋白胨，加入加去离子 水至1L，pH 7.0。固体培养基加入18g琼脂粉。

通过连续富集培养分离筛选到一株敌草胺降解菌株，命名为B2。该菌在12内对Rac- 敌草胺降解率达到50％。

1.2敌草胺降解菌株B2的鉴定和生物学特性

菌株B2在固体LB培养基上生长，菌落呈黄色，不透明，圆形，边缘齐整，凸起，较 湿润，不易挑取。电镜照片显示菌体呈杆状，有鞭毛。以菌株B2的基因组DNA为模板，利 用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行扩增，得到长度约为1450bp的B2 16S基因序列，在EzBioCloud 16S数据库(https://www.ezbiocloud.net)中进行Blast，结果显示菌株B2与鞘氨醇 杆菌属(Sphingobium sp.)菌株的同源性最高，与Sphingobium xenophagum NBRC107872^T的 同源性为99.93％。另外，结合菌株的形态学和生理生化特征将B2鉴定为鞘氨醇杆菌属 (Sphingobium sp.)。

1.3菌株B2的降解特性

降解特性的研究：将菌株B2接种至100mL LB液体培养基中，30℃，180rpm/min， 培养至指数期，6000rpm/mim离心收集菌体，菌体用新鲜、无菌基础盐培养基洗涤2遍，重 悬于4ml基础盐培养基中，接种至100mL无机盐液体培养基中，调节OD₆₀₀约为1.0左右， 每个处理里分别加入0.2mM Rac-敌草胺，0.2mM R-敌草胺，0.2mM S-敌草胺，于30℃，180 rpm/min摇床振荡培养。每隔1h定时取样，绘制菌株的降解曲线。

定时取样培养液加入等体积的甲醇，振荡混匀后，12000rpm/min离心5min，样品用0.22μm尼龙滤膜过滤，高效液相色谱(HPLC)进行检测。HPLC色谱条件为：色谱柱为Syncronis C18(Thermo Fisher Scientific)反相柱，规格为250mm×4.6mm×5μm；流动相为甲醇：水： 乙酸(75:24:1[v/v/v]；柱温为30℃；流速为0.8mL·min^-1；检测波长为250nm；上样量为20μL。

实验结果表明菌株B2能在7h内将0.2mM S-敌草胺完全降解，而Rac-敌草胺降解率在50％左右，在实验的3天时间内未发现能降解R-敌草胺(图1，图2)。

实施例2

S-敌草胺降解基因snaH的克隆及功能验证

2.1细菌基因组总DNA的测序分析

2.1.1细菌基因组总DNA的提取及测序结果分析

菌株B2全基因组总DNA采用CTAB法进行提取，基因组总DNA溶于无菌超纯水中 送深圳华大基因股份有限公司进行细菌基因组完成图测序。菌株B2全基因组完成图信息为：全基因组碱基数为4078932bp，其中包含1个染色体与6个质粒，G+C含量为62.41％。在基 因组预测分析结果中，以酰胺水解酶为关键词进行检索，找到11个注释为酰胺水解酶的orf，在NCBI上比较分析各个orf，对其中3个酰胺水解酶进一步功能验证。

2.1.2推测的酰胺水解酶基因的异源表达及功能验证

以菌株B2基因组DNA作为模板，设计引物用来扩增推测的酰胺水解酶基因片段。所用引物如下表：

表1功能验证实验所使用的引物

扩增体系：

扩增程序

a.95℃预变性3min；

b.95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1.0min 24sec，进行30个循环。

c.72℃终延伸5min，冷却到室温。

提取的pET28a(+)质粒用NdeΙ和Xho I双酶切。

酶切体系：

上述反应体系于37℃水域酶切4h，用胶纯化试剂盒纯化。

将上述已线性化的表达载体pET28a(+)与扩增片段通过ClonExpress II OneStep cloning kit试剂盒进行连接。

重组反应体系：

50℃水域反应10min，立即置于冰上冷却。

将上述重组产物转化至BL21(DE3)中，构建重组表达菌株(图3)。各重组表达菌株在 LB液体培养基中培养至OD₆₀₀约为0.6左右，加入1mM IPTG于16℃，150rpm/min诱导12 小时，12000rpm/min离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎15min，12000rpm/min离心30min，收集上清(即重组表达菌株粗酶)，验证各重组表达菌株粗酶对S-敌草胺 的降解能力。

通过酶活力验证，有一个重组菌株粗酶能够降解S-敌草胺，将该基因命名为snaH，其 对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的酰胺水解酶氨基酸序列如SEQ IDNO.2所 示。

2.2snaH在E.coli BL21(DE3-pET-28a(+)-snaH)中的表达及纯化

重组表达菌株转接到20mL液体LB(含50mg/L Kan)中，待菌株长至指数期，再将 培养液转接(接种量4％，v/v)至100mL LB(含50mg/L Kan)液体培养基中培养至OD₆₀₀为 0.6左右，加1mM IPTG，16℃诱导12h，12000rpm/min离心10min，收集菌体，用PBS缓 冲液重悬菌体，超声破碎15min，离心30min，收集上清，用镍离子亲和层析柱对SnaH进行 纯化，SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化效果，条带大小和理论预测的大小相一致(图4)。

2.3SnaH降解Rac-敌草胺、S-敌草胺的活力测定

酶活反应体系(1mL)：(pH7.4)PBS缓冲液，Rac-敌草胺(或S-敌草胺，设0.1,0.15,0.2,0.25,0.3, 0.35及0.4mM 7种浓度)，SnaH纯酶(图4纯化所得)，30℃反应10min，每个反应以加入酶 开始计时，10min后于沸水中放置1min，终止反应。反应液冷却后加入等体积甲醇，充分混 匀，12000rpm/min离心5min，过0.22μm尼龙膜滤器，HPLC检测产物的生成量。一个酶活 力单位定义为：在pH7.4，温度30℃条件下，每分钟催化底物生成1μmol产物所需的酶量。

酶学试验表明SnaH对Rac-敌草胺的比酶活为179.2U/mg，对S-敌草胺的比活力为227.4 U/mg。

2.4S-敌草胺降解代谢产物的确定

2.3中的Rac-敌草胺和S-敌草胺的酶反应液处理样品，运用HPLC-MS/MS对代谢产物 的分析和鉴定。HPLC条件为：UltiMate 3000RSLC(Thermo Fisher Scientific，美国)，色谱柱 为Kinetex C18(100mm×2.1mm,粒径为2.6μm)，流动相条件为：0-3min，甲醇：水：乙酸 为30：69：1(v/v/v)，3-15min，流动相梯度增加至甲醇：水：乙酸为75：24：1(v/v/v)， 并且维持15min不变，之后流动相甲醇，水，乙酸比例降至30：69：1(v/v/v)并维持5min 不变。检测波长为230nm，进样量为10μL。质谱分析仪为TripleTOF 5600(AB SCIEX，美国)， 分析离子源为正离子检测模式。

HPLC-MS/MS的质谱图表明，其产物的一级质谱图(见图5)显示其有m/z为217.0859的负离子峰。因此，根据酰胺水解酶的降解特性，以及代谢产物的鉴定结果表明降解S-敌草胺 的生化反应是断酰胺键生成S-2-(1-萘氧基)丙酸(图6)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 对S-敌草胺具有专一转化功能的菌株、酰胺水解酶、编码基因及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1377

<212> DNA

<213> 为鞘氨醇杆菌属(Sphingobium sp. )

<400> 1

gtgacccaaa ccgcaattac tggcgcgacc ctgatcgacg ggaatggcgg ttcgccgatc 60

ccggacgcag tcgtcctgtt cgaaggagac cgttttgtcg gtgcaggcgc acgcaacgga 120

tcgacgcttc ccgagggggc gacgcaagtc gacgcatccg gaaagtttct aattccgggg 180

ctgattaact cgaacgtgca tcttctcgac gcgtggactt tcatgatcgg aacggggaca 240

gtggagtatc tcgcccgttt cgagggtcgg ctgcacgagg tgatcgagga ggccgcccag 300

attgctctgg ccaacggcat gaccaccgtt ttcgatacct acaacgccct tcagcccgtg 360

ctgtttgcgc gcgatcgtat cgcatcgggc gaagcgctcg gcgctcggat ctatgcggcc 420

ggcaacatcg tcggcatggg cggccctttc tctgccgact tctcgaagaa ggcgcgcgaa 480

acaagcagcc agaccttctg tgaccgcatg gatgccatgt tcgaggccgg cgtcggccgc 540

aggctagcgg cattgccgcc cgaagaggtg cgtctcatca ttcgcgacta tctcagcaag 600

ggagtcgacc ttctcaaatt tgcgatcagc gatcatattg tgctcgaata tatgaatccg 660

cacctcacat tttcggcgcg cgtacagcgc gtgatcgccg aagagacatg ggcggccgga 720

aagccgctcc tcagccatac gacctcgctc gaaagcctca acgatgccgt gacgctcggg 780

gtcgatgcga tgatgcatac aagtatgacg gcgggagttc cgattcccga tgatatcatc 840

gagcagatca tcaaaaagac ggtgtgggcg gaaatccagc cggttcatga cgagtatcag 900

catcatctcg agacgagcgg cggaatgatg gcgggctacg ccggcggcgt gcaccgcgag 960

aatattcagc ggctcatcgc ggcgggcgca cccattcttc tcggcaccga tgccgggtgt 1020

atggaccccg actgcctcgc agacatgagc gagggcgacc ggcacgagcg cccatggtcg 1080

atcggcggcg atcatttcca ttggttccgt gcaatgcggc agctcggcat gaagccgatg 1140

gacatgctgc aggcggcgac gaagaacatc gcgcgagcct acaagaagga agccgatctc 1200

ggcaccgttg aggccgggaa atttgcggac ttcctgatcc tcgatgccaa tccgctcgac 1260

gacgaggaca attacaagcg cattcacgct atctaccaag gtggccgcaa ggtcgatcgg 1320

tccgcgttgc cggtcaagcg actggtcacc gaatatcccc gctgcgagcc tgcctga 1377

<210> 2

<211> 458

<212> PRT

<213> 为鞘氨醇杆菌属(Sphingobium sp. )

<400> 2

Met Thr Gln Thr Ala Ile Thr Gly Ala Thr Leu Ile Asp Gly Asn Gly

1 5 10 15

Gly Ser Pro Ile Pro Asp Ala Val Val Leu Phe Glu Gly Asp Arg Phe

20 25 30

Val Gly Ala Gly Ala Arg Asn Gly Ser Thr Leu Pro Glu Gly Ala Thr

35 40 45

Gln Val Asp Ala Ser Gly Lys Phe Leu Ile Pro Gly Leu Ile Asn Ser

50 55 60

Asn Val His Leu Leu Asp Ala Trp Thr Phe Met Ile Gly Thr Gly Thr

65 70 75 80

Val Glu Tyr Leu Ala Arg Phe Glu Gly Arg Leu His Glu Val Ile Glu

85 90 95

Glu Ala Ala Gln Ile Ala Leu Ala Asn Gly Met Thr Thr Val Phe Asp

100 105 110

Thr Tyr Asn Ala Leu Gln Pro Val Leu Phe Ala Arg Asp Arg Ile Ala

115 120 125

Ser Gly Glu Ala Leu Gly Ala Arg Ile Tyr Ala Ala Gly Asn Ile Val

130 135 140

Gly Met Gly Gly Pro Phe Ser Ala Asp Phe Ser Lys Lys Ala Arg Glu

145 150 155 160

Thr Ser Ser Gln Thr Phe Cys Asp Arg Met Asp Ala Met Phe Glu Ala

165 170 175

Gly Val Gly Arg Arg Leu Ala Ala Leu Pro Pro Glu Glu Val Arg Leu

180 185 190

Ile Ile Arg Asp Tyr Leu Ser Lys Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Ala

195 200 205

Ile Ser Asp His Ile Val Leu Glu Tyr Met Asn Pro His Leu Thr Phe

210 215 220

Ser Ala Arg Val Gln Arg Val Ile Ala Glu Glu Thr Trp Ala Ala Gly

225 230 235 240

Lys Pro Leu Leu Ser His Thr Thr Ser Leu Glu Ser Leu Asn Asp Ala

245 250 255

Val Thr Leu Gly Val Asp Ala Met Met His Thr Ser Met Thr Ala Gly

260 265 270

Val Pro Ile Pro Asp Asp Ile Ile Glu Gln Ile Ile Lys Lys Thr Val

275 280 285

Trp Ala Glu Ile Gln Pro Val His Asp Glu Tyr Gln His His Leu Glu

290 295 300

Thr Ser Gly Gly Met Met Ala Gly Tyr Ala Gly Gly Val His Arg Glu

305 310 315 320

Asn Ile Gln Arg Leu Ile Ala Ala Gly Ala Pro Ile Leu Leu Gly Thr

325 330 335

Asp Ala Gly Cys Met Asp Pro Asp Cys Leu Ala Asp Met Ser Glu Gly

340 345 350

Asp Arg His Glu Arg Pro Trp Ser Ile Gly Gly Asp His Phe His Trp

355 360 365

Phe Arg Ala Met Arg Gln Leu Gly Met Lys Pro Met Asp Met Leu Gln

370 375 380

Ala Ala Thr Lys Asn Ile Ala Arg Ala Tyr Lys Lys Glu Ala Asp Leu

385 390 395 400

Gly Thr Val Glu Ala Gly Lys Phe Ala Asp Phe Leu Ile Leu Asp Ala

405 410 415

Asn Pro Leu Asp Asp Glu Asp Asn Tyr Lys Arg Ile His Ala Ile Tyr

420 425 430

Gln Gly Gly Arg Lys Val Asp Arg Ser Ala Leu Pro Val Lys Arg Leu

435 440 445

Val Thr Glu Tyr Pro Arg Cys Glu Pro Ala

450 455

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgccgcgcg gcagccatat ggtgacccaa accgcaatta ctg 43

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggtggtgg tggtgctcga gtcaggcagg ctcgcagcg 39

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgccgcgcg gcagccatat ggtgaccctg ccctccccc 39

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtggtggtgg tggtgctcga gtcacgcgac caatcccag 39

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgccgcgcg gcagccatat gatgcttgat gaatatgcaa cactcg 46

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtggtggtgg tggtgctcga gtcagacctt gaatacgcgc tt 42

对S-敌草胺具有专一转化功能的菌株、酰胺水解酶、编码基因及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。