专利摘要

本发明涉及生物技术领域，具体公开了酵母基因组中YEL013W基因和YER042W基因的新应用，通过敲除这两个基因，可以实现生产类胡萝卜素的酵母菌株在产量上的显著提高，为改造微生物工程菌提供明确的基因靶点。

权利要求

1.YEL013W基因，或YEL013W基因+ YEL014C基因或 YEL013W基因+ YEL014C基因+YER042W基因在提高酵母菌株类胡萝卜素产量或改造生产类胡萝卜素的酵母菌株中的应用；所述酵母菌株为整合crtE，crtI和crtYB三个基因具备生产类胡萝卜素能力的酿酒酵母菌株，所述类胡萝卜素为番茄红素和β-胡萝卜素。

2.根据权利要求1所示应用，其特征在于，所述酿酒酵母菌株为合成型synIII染色体酿酒酵母或合成型synV染色体酿酒酵母。

3.YEL013W基因+ YEL014C基因+YER042W基因在提高酵母菌株β-胡萝卜素产量或改造生产β-胡萝卜素的酵母菌株中的应用；所述酵母菌株为整合crtE，crtI和crtYB三个基因具备生产β-胡萝卜素的酿酒酵母菌株。

4.一种改造生产类胡萝卜素的酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，将crtE，crtI和crtYB三个基因整合到酿酒酵母中，使之具备生产类胡萝卜素能力，敲除生产类胡萝卜素的酵母基因组中的YEL013W基因，或者敲除YEL013W基因+ YEL014C基因，或敲除 YEL013W基因+ YEL014C基因+YER042W基因，所述类胡萝卜素为番茄红素和β-胡萝卜素，或为β-胡萝卜素；敲除YEL013W基因，或者敲除YEL013W基因+ YEL014C基因，或敲除 YEL013W基因+YEL014C基因+YER042W基因可提高番茄红素和β-胡萝卜素总产量；敲除YEL013W基因+YEL014C基因+YER042W基因可提高β-胡萝卜素总产量。

5.一种重组的生产类胡萝卜素的酿酒酵母，其特征在于，整合有外源crtE，crtI和crtYB三个基因，敲除了YEL013W基因，或者敲除YEL013W基因+ YEL014C基因，或敲除YEL013W基因+ YEL014C基因+YER042W基因，所述类胡萝卜素为番茄红素和β-胡萝卜素，或为β-胡萝卜素；敲除YEL013W基因，或者敲除YEL013W基因+ YEL014C基因，或敲除 YEL013W基因+ YEL014C基因+YER042W基因可提高番茄红素和β-胡萝卜素总产量；敲除YEL013W基因+ YEL014C基因+YER042W基因可提高β-胡萝卜素总产量。

6.一种生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，敲除整合了crtE，crtI和crtYB三个基因具备生产类胡萝卜素能力的酿酒酵母基因组中的YEL013W基因，或者敲除了YEL013W基因+YEL014C基因，或敲除 YEL013W基因+ YEL014C基因+YER042W基因，然后进行发酵，收集发酵培养物，提取类胡萝卜素；

所述类胡萝卜素为番茄红素和β-胡萝卜素，或为β-胡萝卜素；敲除YEL013W基因，或者敲除YEL013W基因+ YEL014C基因，或敲除 YEL013W基因+ YEL014C基因+YER042W基因可提高番茄红素和β-胡萝卜素总产量；敲除YEL013W基因+ YEL014C基因+YER042W基因基因可提高β-胡萝卜素总产量。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及YEL013W基因和YER042W基因的应用。

背景技术

近年来，随着基因组测序的能力不断提升，已经能够解析出过去难以发现的普遍存在的基因组重排现象。20世纪研究发现的基因组变异主要形式是单核苷酸多态性(SNP)和异染色质多态性(HP)。然而，近几年研究发现，在微生物(如耶尔森氏菌、酵母)、植物(如青草、水稻)、动物(如七鳃鳗、小鼠)、人类基因组中普遍发现了基因组重排现象，尤其是，基因组内大量结构变异(SV)(包括片段缺失、重复、水平迁移、相互易位、倒位等)是包含更多信息变化的更高频遗传变异方式，这为基因组通过重排推动生命进化提供了关键性证据。天然基因组重排与性状改变之间存在普遍联系，为我们研究生命进化与新功能产生提供了重要蓝本。

天然基因组重排和变异时间跨度较大，功能定向进化可控性低。如果能够知晓基因组中各基因与性状改变之间的具体关系，则能够有针对性地人为改造基因组，实现微生物、动物性状改变朝向对人类有利的方向。例如在微生物发酵生产化学品领域，有针对性的改造微生物基因，能够提高微生物工程菌化学品产量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供YEL013W基因和/或YER042W基因在提高酵母菌类胡萝卜素产量中的应用以及改造酵母菌株中的应用；

本发明的另外一个目的在于提供一种改造酵母菌株的方法以及改造后的菌株，使得改造后的酵母菌株的类胡萝卜素产量产量得到提高；

本发明的另外一个目的在于提供一种生产类胡萝卜素的方法，使得所述方法的类胡萝卜素产量得到提高。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

YEL013W基因和/或YER042W基因在提高酵母菌株类胡萝卜素产量或改造生产类胡萝卜素的酵母菌株中的应用。

YEL013W基因和YER042W基因是所有酵母基因组中的两段基因，其中YEL013W(Vac8p)是磷酸化和棕榈酰化的液泡膜蛋白，之前的研究表明YEL013W缺失细胞的液泡呈多角形，甚至碎裂成小囊泡，胞质至液泡运输途径受到严重损害。YEL013W的缺失被证明会影响酵母中自噬途径的调节。

YER042W(Mxr1p)是一种甲硫氨酸-S-亚砜还原酶，其参与了对氧化应激的反应，并将DMSO还原成DMS，其反应过程依赖NADH。在现有的研究中，这些基因都没有直接参与MVA途径，与合成类胡萝卜素无直接关系。

本发明意外发现，通过对具备进行YEL013W基因和/或YER042W基因的敲除，能够显著的提高该菌株的类胡萝卜素产量。具体地，

因此，本发明提出了上述应用。

其中，所述酵母菌株选择为具备生产类胡萝卜素能力的酿酒酵母；对于本身不具备生产类胡萝卜素能力的酿酒酵母，可根据本领域常规改造方法，将外源crtE，crtI和crtYB三个基因整合到该酿酒酵母中，构建了异源类胡萝卜素合成途径，使之具备生产类胡萝卜素能力。

在本发明具体实施方式中，所述酿酒酵母采用合成型synIII染色体酿酒酵母或合成型synV染色体酿酒酵母，通过构建异源类胡萝卜素合成途径，使两者具备生产类胡萝卜素能力。

在本发明中，所述类胡萝卜素优选为番茄红素和β-胡萝卜素两种或β-胡萝卜素一种。

在本发明中，对具备生产类胡萝卜素能力的合成型synV染色体酿酒酵母中YEL013W，YEL014C(用于对照)和YER042W这三个基因分别进行单独敲除和组合敲除，获得yJBN009(敲除YEL013W基因)，yJBN010(敲除YEL014C基因)，yJBN006(敲除YEL014C和YEL013W基因)，yJBN007(敲除YER042W基因)和yJBN008(敲除YEL014C、YEL013W和YER042W基因)五种试验菌株。结果显示，yJBN009，yJBN010，yJBN006，yJBN007和yJBN008的类胡萝卜素总产量分别是：10.97mg/L，18.94mg/L，9.63mg/L，16.05mg/L，12.73mg/L和17.56mg/L。和未敲除任何基因的菌株相比，yJBN009，yJBN006和yJBN008的产量均有显著提升，从而证明YEL013W靶点的删除可以提升类胡萝卜素的合成，此外还可以看出YER042W的删除在高产类胡萝卜素酵母中可以提高beta胡萝卜素的比例。

根据上述应用和优异的技术效果，本发明提出了一种改造生产类胡萝卜素的酵母菌株的方法，即敲除生产类胡萝卜素的酵母基因组中的YEL013W基因和/或YER042W基因。

同时提供一种重组的生产类胡萝卜素的酵母，该重组酵母敲除了YEL013W基因和/或YER042W基因。

此外，还提供了一种生产类胡萝卜素的方法，即敲除生产类胡萝卜素的酵母基因组中的YEL013W基因和/或YER042W基因，然后进行发酵，收集发酵培养物，提取类胡萝卜素。

其中，所述发酵采用含葡萄糖的YPD培养基，在30℃，250rpm摇床中发酵培养60小时；然后通过离心收集发酵培养物，并用丙酮从沉淀中提取类胡萝卜素。

由以上技术方案可知，本发明提供了酵母基因组中YEL013W基因和YER042W基因的新应用，通过敲除这两个基因，可以实现生产类胡萝卜素的酵母菌株在产量上的显著提高，为改造微生物工程菌提供明确的基因靶点。

附图说明

图1所示为敲除不同基因的酿酒酵母的类胡萝卜素(番茄红素+β-胡萝卜素)产量柱形图；其中，柱形图下方表格对应各菌株敲除基因的情形。

具体实施方式

本发明公开了YEL013W基因和YER042W基因的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：构建生产类胡萝卜素的酿酒酵母菌株

人工合成crtE，crtI和crtYB三个外源基因，构建异源类胡萝卜素合成途径crtE+crtI+crtYB，然后利用酵母同源重组机制，分别设计左端连接元件和右边连接元件，与异源类胡萝卜素合成路径一起酶切后凝胶回收，共同转化单倍体合成型synV染色体酿酒酵母。类胡萝卜素路径与Leu2营养标记一起整合到synV中的YEL063C/CAN1基因座中，获得酵母菌株yJBH000。

实施例2：基因敲除试验验证效果

对yJBH000中YEL013W，YEL014C(用于对照)和YER042W这三个基因分别进行单独敲除和组合敲除，获得yJBN009(敲除YEL013W基因)，yJBN010(敲除YEL014C基因)，yJBN006(敲除YEL014C和YEL013W基因)，yJBN007(敲除YER042W基因)和yJBN008(敲除YEL014C、YEL013W和YER042W基因)五种试验菌株。然后按照如下方法发酵生产：

取菌株接种到5mL YPD培养基中活化培养24小时，然后以OD600为0.1接种与40mL的YPD培养基(40g/L葡萄糖)，在30℃，250rpm摇床中发酵培养60小时。

离心收集2mL发酵培养物，并用1mL丙酮从沉淀中提取类胡萝卜素。通过HPLC分析样品。流动相由甲醇-乙腈-二氯甲烷(9：40：1v/v)组成，流速为30mL/min。

结果见图1，yJBN009，yJBN010，yJBN006，yJBN007和yJBN008的类胡萝卜素总产量分别是：10.97mg/L，18.94mg/L，9.63mg/L，16.05mg/L，12.73mg/L和17.56mg/L。和未敲除任何基因的yJBH000菌株相比，yJBN009，yJBN006和yJBN008的产量均有显著提升，从而证明YEL013W靶点的删除可以提升类胡萝卜素的合成，此外还可以看出YER042W的删除在高产类胡萝卜素酵母中可以提高beta胡萝卜素的比例。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

YEL013W基因和YER042W基因的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。