专利摘要

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类水溶性的柠檬苦素衍生物(I)和(II)及其制备方法。药效学试验结果证明，本发明的化合物具有治疗炎症、类风湿性关节炎和疼痛等功效。

权利要求

1.通式I或II的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R代表

R¹代表H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂OH或OH；X代表CH₂、O、NH、N-CH₃或N-COCH₃；

R²、R³各自独立地代表H或C₁～C₆的烷基；

R⁴代表H、CH₃、F、Cl或Br；

m＝1～5。

2.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中R代表 R¹代表H或CH₃，X代表CH₂、O、NH或N-CH₃，m＝1～4。

3.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中R代表 R²、R³各自独立地代表C₁～C₃的烷基，m＝1～4。

4.权利要求1的通式I化合物的制备方法，包括：

其中R、m的定义同权利要求1。

5.权利要求1中通式II化合物的制备方法，包括：

其中R、m的定义同权利要求1。

6.权利要求1、2或3的化合物或其药学上可接受的盐，其中药学上可接受的盐是通式I或II化合物与下列酸所成的盐：氯化氢、溴化氢、硫酸、磷酸、碳酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸或阿魏酸。

7.一种药物组合物，其中含有权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。

8.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的用途。

9.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗类风湿性关节炎疾病的药物中的用途。

10.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐在制备镇痛药物中的用途。

说明书

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一类水溶性的柠檬苦素衍生物，它们的制备方法，以及含有这些化合物的药物组合物及其在治疗疼痛和炎症方面的用途。

背景技术

疼痛已被现代医学列为继体温、脉搏、呼吸、血压之后的第五大生命体征。疼痛如不及时有效处理，将严重影响日常的生活质量和社会安定。尽管镇痛药的研究有了长足的进步，但无论是用于轻、中度疼痛的非甾体解热镇痛抗炎药，还是用于中、重度疼痛的止痛剂，都有着各自的副作用和局限性，有的还面临潜在的滥用问题。

类风湿关节炎是一种常见的关节炎症，发病原因还不是很明确，它是一种慢性病，是以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。目前临床治疗类风湿性关节炎的主要药物包括非甾体抗炎药、免疫抑制剂、生物制剂和小分子靶向药。其中非甾体抗炎药可缓解症状，但药效较弱，胃肠道副作用大；免疫抑制剂如甲氨蝶呤药效明确，作用持久，但起效缓慢，毒性大，不良反应多且难以耐受，需长期进行血药浓度监测；生物制剂如阿达木单抗疗效明确，但价格昂贵，难以普及；小分子靶向药如托法替尼2012年批准上市，但随着临床应用的深入和范围扩大，众多安全性问题逐渐显现，产品标签亦有安全黑框警告，主要为增加肿瘤、感染风险。因此，寻找安全、有效、副作用小的镇痛和抗炎药物具有重大的现实意义和社会意义。

柠檬苦素类似物是高度氧化的四环三萜类化合物，广泛存在于柑橘类等芸香科和楝科植物家族中。迄今已分离得到大约300多种柠檬苦素类似物，柠檬苦素(limonin)是这类化合物中的代表。研究发现柠檬苦素化合物在镇痛、抗炎、抗癌、抗菌等方面具有作用，但是由于其作用不够强，水溶性差，生物利用度低，影响了其临床应用。

发明内容

本发明公开了通式I和II的化合物，经药理实验证明，本发明的化合物具有较好的镇痛、抗炎活性。因此，本发明的通式I和II的化合物可用于临床缓解疼痛和消除炎症的作用。

其中：

R代表

R¹代表H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂OH或OH。

X代表CH₂、O、NH、N-CH₃或N-COCH₃。

R²、R³各自独立地代表H或C₁～C₆的烷基。

R⁴代表H、CH₃、F、Cl或Br。

m＝1～5。

R优选代表 R¹优选代表H或CH₃，X优选代表CH₂、O、NH或N-CH₃，m优选＝1～4。

R还优选代表 R²、R³优选各自独立地代表C₁～C₃的烷基，m＝1～4。

通式I和II的化合物可与药学上可接受的酸形成酸加成盐，所述酸包括氯化氢、溴化氢、硫酸、磷酸、碳酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸或阿魏酸。

本发明通式I的化合物及其药学上可接受的酸加成盐(I.A)可用下列方法制备：

其中：

由化合物III(柠檬苦素)经酰化制备化合物IV的过程，所用的酰化剂为氯乙酰氯、3-氯丙酰氯、4-氯丁酰氯、5-氯戊酰氯或6-氯己酰氯，酰化剂也可以是乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、戊酸酐或己酸酐；催化剂为三氯化铝或氯化锌；溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯苯、硝基苯。

由化合物IV经取代制备化合物I的过程，所用的胺为 其中R¹选自H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂OH或OH，X选自CH₂、O、NH、N-CH₃或N-COCH₃，R²、R³选自H或C₁～C₆的烷基，R⁴选自H、CH₃、F、Cl或Br；缚酸剂为碳酸钾、碳酸钠、三乙胺或反应物胺本身；溶剂为四氢呋喃、乙腈、丙酮、乙酸乙酯，或任意两者的混合溶剂。

由化合物I与酸A成盐制备酸加成盐I·A的过程，所用的酸A为氯化氢、溴化氢、硫酸、磷酸、碳酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸或阿魏酸；溶剂为乙酸乙酯、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醇、甲醇或异丙醇，或任意两者的混合溶剂。

本发明通式II的化合物及其药学上可接受的酸加成盐(II.A)可用下列方法制备：

其中：

由化合物V(脱氧柠檬苦素，desoxylimonin)经酰化制备化合物VI的过程，所用的酰化剂为氯乙酰氯、3-氯丙酰氯、4-氯丁酰氯、5-氯戊酰氯或6-氯己酰氯，酰化剂也可以是乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、戊酸酐或己酸酐；催化剂为三氯化铝或氯化锌；溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯苯、硝基苯。

由化合物VI经取代制备化合物II的过程，所用的胺为 其中R¹选自H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂OH或OH，X选自CH₂、O、NH、N-CH₃或N-COCH₃，R²、R³选自H或C₁～C₆的烷基，R⁴选自H、CH₃、F、Cl或Br；缚酸剂为碳酸钾、碳酸钠、三乙胺或反应物胺本身；溶剂为四氢呋喃、乙腈、丙酮、乙酸乙酯，或任意两者的混合溶剂。

由化合物II与酸A成盐制备酸加成盐II·A的过程，所用的酸A为氯化氢、溴化氢、硫酸、磷酸、碳酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸或阿魏酸；溶剂为乙酸乙酯、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醇、甲醇或异丙醇，或任意两者的混合溶剂。

本发明在于提供一种药物组合物，其包括本发明的化合物I或II或其盐I·A或II·A和药学上可接受的载体。

本发明所述的化合物或其盐可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、冻干粉针、针剂，可以加入香料、甜味剂、液体或固体填料或稀释剂等常用药用辅料。

本发明所述的化合物在临床上的给药方式可以采用口服、注射、外用等方式。

本发明同时包括通式I或II的化合物的立体异构体、水合物、溶剂合物或结晶，它们与化合物具有同样的药理药效。在制备治疗疼痛或炎症药物中的应用。

本发明部分化合物如下：

下面是本发明部分化合物的药理实验及结果：

为了给药方便，药理实验采用I和II类化合物的盐酸盐。

药效学实验证明，本发明化合物具有抗炎和镇痛效果。下面是部分药效学试验及结果：(1)小鼠醋酸扭体实验

试验方法：

ICR小鼠，雌雄各半，18～22g，随机分为模型组、阿司匹林组、柠檬苦素组、脱氧柠檬苦素组、本发明化合物组，每组8只。各组灌胃给药1小时后腹腔注射0.7％乙酸0.1mL/10g，模型组腹腔注射0.7％乙酸0.1mL/10g，立即观察并记录15分钟内小鼠扭体次数。结果见表1和表2。

扭体次数抑制率＝(模型组扭体次数均值-给药组扭体次数均值)/模型组扭体次数均值*100％

表1柠檬苦素衍生物对小鼠醋酸扭体次数的影响

注：^*P<0.05，^**P<0.01vs模型组。

表2脱氧柠檬苦素衍生物对小鼠醋酸扭体次数的影响

注：^*P<0.05，^**P<0.01vs模型组。

小鼠醋酸扭体实验结果表明，腹腔注射0.7％醋酸0.1ml/10g后可引起小鼠的腹腔疼痛，出现扭体反应，本发明部分化合物对小鼠的扭体反应具有明显抑制作用。改造后的化合物的镇痛活性较柠檬苦素或脱氧柠檬苦素均有所提高，总体是柠檬苦素系列衍生物活性高于脱氧柠檬苦素系列衍生物，且在柠檬苦素系列衍生物中碳链长的化合物活性优于碳链短的化合物，其中化合物I-5·HCl、I-6·HCl、I-7·HCl镇痛活性远高于柠檬苦素。

(2)小鼠缩尾实验

试验方法：

ICR雄性小鼠，18～22g，随机分为模型组、阿司匹林组、柠檬苦素组、脱氧柠檬苦素组、本发明化合物各受试药组，每组8只。将小鼠尾尖端3cm浸入48℃恒温水浴锅中，以缩尾反射(鼠尾回缩出水面)为痛反应指标，记录鼠尾放入水浴至受热引起缩尾反射的时间(秒)作为痛反应阈值。给药前测两次缩尾反射时间取其平均值作为基础痛域。各给药组分别灌胃后，测定各组灌胃后30分钟，60分钟，90分钟，120分钟小鼠的缩尾潜伏期的变化，超过25秒无反应者，痛阈按25秒计。结果如图1、图2和图3。

小鼠缩尾实验结果显示在测试的时间点内本发明的部分化合物能提升小鼠缩尾反应中的痛域，表现出一定的镇痛活性。总体上柠檬苦素系列化合物的作用强于脱氧柠檬苦素系列，且化合物中碳链长度为4个碳时活性较高，与小鼠醋酸扭体实验中所得结论基本一致。

(3)小鼠耳肿胀实验

实验方法：

ICR雄性小鼠，18～22g，随机分成模型组、萘普生组、柠檬苦素组、本发明化合物组，每组8只。各组灌胃给药90分钟后在小鼠右耳涂二甲苯25ul致炎，30分钟后拉颈处死，用8mm打孔器对双耳打孔，取耳称重，计算肿胀率(％)和肿胀抑制率(％)。结果见表3和表4。

肿胀率(％)＝(右耳重量-左耳重量)/左耳重量*100％

肿胀抑制率(％)＝(模型组肿胀率-受试药组肿胀率)/模型组肿胀率*100％

表3柠檬苦素衍生物对小鼠耳肿胀的影响

注：^*P<0.05，^**P<0.01vs模型组。

表4脱氧柠檬苦素衍生物对小鼠耳肿胀的影响

注：^*P<0.05，^**P<0.01vs模型组。

小鼠耳肿胀实验结果显示本发明的化合物对小鼠耳肿胀具有显著的抑制作用。构效关系与小鼠醋酸扭体实验及小鼠热缩尾实验结果基本一致。其中化合物I-5·HCl、I-6·HCl表现出较强的抗炎活性，且高于阳性对照萘普生和柠檬苦素。

(4)大鼠佐剂关节炎实验

根据小鼠醋酸扭体实验，小鼠热水缩尾实验及小鼠耳肿胀实验结果，我们选择化合物I-5·HCl和I-6·HCl进行了大鼠佐剂关节炎实验，对化合物活性进行进一步验证与研究。

实验方法：

雄性wistar大鼠90只，适应性饲养3天后，随机分为9组，每组10只，即空白组、模型组、I-5·HCl 200mg/kg组、I-5·HCl 100mg/kg组、I-5·HCl 50mg/kg组、I-6·HCl 200mg/kg组、I-6·HCl 100mg/kg组、I-6·HCl 50mg/kg组、托法替尼5mg/kg组。造模前，灭活卡介苗与不完全弗氏佐剂充分混合，配成含灭活卡介苗10mg/ml的完全弗氏佐剂(CFA)。除空白组外其余组各只大鼠右后足足趾注射0.1ml CFA致炎。造模第21天开始各组大鼠灌胃给药，连续给药14天。每隔一段时间，对各大鼠的右足踝测肿胀情况及体重变化，第15天各组大鼠眼眶采血，用于检测TNF-α和IL-6。结果如下：

①足趾肿胀抑制率

各组大鼠给予受试化合物后每三天测量一次其右足踝肿胀情况，计算肿胀抑制率，结果见表5。

肿胀抑制百分率＝(给药前平均肿胀率-给药后平均肿胀率)/模型组平均肿胀率×100％

表5 I-5·HCl和I-6·HCl对大鼠原发侧足趾肿胀的影响(n＝8)

从足趾肿胀抑制率结果看出，两个化合物对大鼠原发侧足肿均具有抑制活性，且随剂量的升高，抑制活性也升高，表明其具有一定的剂量依赖性。从结果也可以看出化合物I-6·HCl的活性略高于化合物I-5·HCl。

②对大鼠体重的影响

给予受试化合物后每隔两天测量一次大鼠体重，观察大鼠体重的变化，结果如图4。

从图中可以看出，大鼠在给药前期时体重变化较小，从第五天往后体重均呈上升趋势，说明在化合物起效后大鼠的身体状况好转，进一步验证了化合物具有缓解炎症疼痛的效果。

③对大鼠临床评分的影响

在本实验中化合物对大鼠临床评分影响主要是通过大鼠全身评分及大鼠关节炎指数来表现，评分或指数越高说明临床状态越差，结果如图5和图6。

图中显示在给予受试化合物后大鼠的全身评分及关节炎指数均有所下降，说明大鼠临床状态好转，进一步验证本发明化合物具有镇痛抗炎活性。

④血清中TNF-α和IL-6含量测定

给予受试化合物第15天各组大鼠眼眶采血，检测TNF-α和IL-6，结果如表6。

表6血清中TNF-α和IL-6含量测定

注：^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001vs模型组，^△p<0.05，^△△p<0.01，^△△△p<0.001vs空白组

从结果中看出在给药后大鼠血清中的TNF-α和IL-6含量均有下降，提示这两个炎症因子可能是化合物发挥镇痛抗炎活性的重要介质。具体机制有待进一步研究。

(5)小鼠热板实验

利用小鼠热板实验考察同种化合物以不同方式给药时镇痛活性的差异。

实验方法：

ICR雌性小鼠90只，将恒温水浴箱加热到55(±0.5)℃，将雌性小鼠置于热板上，以其足部接触热板到开始舔后足的时间为热板法痛阈(HPPT)，剔除HPPT大于30s或小于5s的动物，选择符合标准的70只雌性小鼠按体重随机分为7组，分别为模型对照组、柠檬苦素100mg/kg剂量组、I-5·HCl灌胃给药100mg/kg剂量组、I-5·HCl静脉给药10mg/kg剂量组、I-6·HCl灌胃给药100mg/kg剂量组、I-6·HCl静脉给药10mg/kg剂量组。以给药前三次热板法HPPT的平均值为基础痛阈，对超过60s无反应者则中止刺激，以60s痛反应计时，给药后30min开始记录痛阈时间。痛阈提高率(％)＝(给药后痛阈-基础痛阈)/基础痛阈×100％，结果如表7。

表7 I-5·HCl和I-6·HCl小鼠热板镇痛实验

注：^*P<0.05，^**P<0.01vs模型组，^△P<0.05，^△△P<0.01vs组内基础痛阈，^◇P<0.05，^◇◇P<0.01vs萘普生组

本实验中，我们采取了灌胃与静脉注射两种给药方式，从实验结果可以看出，静脉给药10mg/kg剂量的镇痛活性强于相应的口服100mg/kg剂量的镇痛活性。

柠檬苦素不溶水，而本发明的化合物加酸成盐后可溶于水中。

附图说明

图1是本发明柠檬苦素衍生物I-1～I-6盐酸盐对小鼠缩尾的作用

图2是本发明柠檬苦素衍生物I-7～I-9、I-12～I-13盐酸盐对小鼠的缩尾作用

图3是本发明脱氧柠檬苦素衍生物II-2～II-3、II-5～II-6盐酸盐对小鼠的缩尾作用

图4是本发明化合物I-5·HCl和I-6·HCl对大鼠体重的影响

图5是本发明化合物I-5·HCl和I-6·HCl对大鼠全身评分的影响

图6是本发明化合物I-5·HCl和I-6·HCl对大鼠关节炎指数的影响

具体实施方式

实施例1

23-(2-(哌啶-1-基)乙酰基)柠檬苦素(I-1)的制备

23-氯乙酰基柠檬苦素(IV-1)

250mL三颈瓶中加入柠檬苦素(8g,17mmol)和二氯甲烷(125mL)，搅拌下降温至0℃，分批加入三氯化铝(10.2g,76.5mmol)，加毕，保温搅拌20分钟，滴加氯乙酰氯(2.2g,19.5mmol)与二氯甲烷(5mL)的混合溶液，滴毕，保持0～-5℃反应1小时，再于室温继续搅拌反应3小时，停止反应，将反应液慢慢倒入100mL冰水中，分取二氯甲烷层，水层用二氯甲烷萃取两次(100mL×2)，合并有机层，用1mol/L氢氧化钠水溶液洗三次(100mL×3)，饱和食盐水洗涤两次(100mL×2)，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸除溶剂。粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝180:1)纯化，得浅绿色固体(IV-1)2.8g，收率30.2％，m.p.>200℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.62(s,1H),7.24(s,1H),5.50(s,1H),4.77(d,J＝13.1Hz,1H),4.55(s,2H),4.46(d,J＝13.0Hz,1H),4.03(s,2H),2.99(dd,J＝17.0,3.7Hz,1H),2.93–2.79(m,1H),2.68(d,J＝15.7Hz,1H),2.58–2.40(m,2H),2.22(d,J＝13.0Hz,1H),1.98–1.75(m,3H),1.59–1.51(m,1H),1.29(s,3H),1.18(s,3H),1.14(s,3H),1.08(s,3H).ESI-MS(m/z):569.2[M+Na]⁺

23-(2-(哌啶-1-基)乙酰基)柠檬苦素(I-1)

100mL三颈瓶中加入四氢呋喃(30mL)、碳酸钾(0.66g,4.78mmol)、碘化钾(0.03g,0.18mmol)、哌啶(0.92g,10.8mmol)，室温搅拌20分钟，滴加IV-1(1.97g,3.6mmol)溶于四氢呋喃(30mL)的溶液，滴毕，室温继续反应5小时，TLC检测(二氯甲烷:甲醇＝25:1)反应完全，减压蒸除溶剂。残留物加入20mL水，析出固体，抽滤，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝80:1)纯化，得淡黄色固体(I-1)1.1g，收率51.3％,128℃(炭化)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.57(s,1H),7.31(s,1H),5.49(s,1H),4.78(d,J＝13.4Hz,1H),4.47(d,J＝13.2Hz,1H),4.03(s,2H),3.63(s,2H),2.99(dd,J＝16.8,3.5Hz,1H),2.94–2.82(m,1H),2.69(d,J＝16.4Hz,1H),2.63–2.36(m,6H),2.23(d,J＝13.0Hz,1H),1.94–1.78(m,3H),1.69–1.41(m,7H),1.30(s,3H),1.19(s,3H),1.16(s,3H),1.08(s,3H).ESI-MS(m/z):596.3[M+H]⁺

将I-1(1.0g,1.68mmol)溶解在乙酸乙酯(40mL)中，冰浴搅拌下缓慢滴加饱和HCl的乙酸乙酯溶液至pH 2左右，析出淡黄色固体，继续搅拌1小时，抽滤，所得固体用20mL乙酸乙酯打浆，抽滤，干燥得淡黄色固体(I-1·HCl)0.9g，收率85％，m.p.>200℃。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ10.04(s,1H),8.20(s,1H),7.69(s,1H),5.58(s,1H),4.91(d,J＝12.9Hz,1H),4.74(s,2H),4.48(d,J＝13.1Hz,1H),4.16(s,1H),4.08(s,1H),3.43–3.29(m,4H),3.17–3.05(m,1H),2.75(d,J＝16.6Hz,1H),2.65–2.51(m,2H),2.45–2.38(m,1H),2.27(d,J＝12.1Hz,1H),1.99–1.57(m,9H),1.45–1.32(m,1H),1.17(s,3H),1.08(s,3H),1.00(s,6H).

实施例2

23-(2-(吗啉-4-基)乙酰基)柠檬苦素(I-2)的制备

以化合物IV-1(2.0g,3.65mmol)和吗啉(0.95g,10.90mmol)为原料，操作过程同I-1，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝90:1)纯化，得浅黄色固体(I-2)1.2g，收率54.9％，146℃(炭化)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.59(s,1H),7.26(s,1H),5.51(s,1H),4.79(d,J＝13.1Hz,1H),4.49(d,J＝13.2Hz,1H),4.06(s,2H),3.85–3.73(m,4H),3.70(s,2H),3.00(dd,J＝16.8,3.7Hz,1H),2.95–2.79(m,1H),2.78–2.57(m,5H),2.57–2.42(m,2H),2.24(dd,J＝15.8,3.1Hz,1H),1.91–1.78(m,3H),1.62–1.46(m,1H),1.32(s,3H),1.20(s,3H),1.17(s,3H),1.10(s,3H).ESI-MS(m/z):598.3[M+H]⁺

以化合物I-2(1.0g,1.67mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得浅黄色固体(I-2·HCl)0.87g，收率83％，m.p.>200℃。

实施例3

23-(2-(哌嗪-1-基)乙酰基)柠檬苦素(I-3)的制备

以化合物IV-1(2.0g,3.65mmol)和N-叔丁氧羰基哌嗪(2.73g,14.6mmol)为原料，操作过程同I-1，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝150:1)纯化，得1.46g淡黄色中间体。将该中间体溶于甲醇(20mL)，冰浴搅拌下滴加饱和HCl的甲醇溶液(20mL)，滴毕，室温反应2小时，TLC检测(展开剂：二氯甲烷:甲醇＝25:1)反应完全，0～5℃放置1小时，抽滤得淡黄色固体(I-3)0.9g，两步合计收率41.2％，140℃(炭化)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.57(s,1H),7.25(s,1H),5.49(s,1H),4.77(d,J＝12.7Hz,1H),4.47(d,J＝13.4Hz,1H),4.03(s,2H),3.68(s,2H),3.06(s,4H),2.97(dd,J＝16.8,3.9Hz,1H),2.93–2.81(m,1H),2.78–2.62(m,4H),2.60–2.41(m,3H),2.23(d,J＝12.4Hz,1H),2.03–1.76(m,3H),1.62–1.45(m,1H),1.29(s,3H),1.18(s,3H),1.15(s,3H),1.08(s,3H),0.90–0.82(m,1H).ESI-MS(m/z):597.3[M+H]⁺

以化合物I-3(0.8g,1.34mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得浅黄色固体(I-3·HCl)0.69g，收率81.4％，m.p.>200℃。

实施例4

23-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰基)柠檬苦素(I-4)的制备

以化合物IV-1(2.0g,3.65mmol)和N-甲基哌嗪(1.64g,16.42mmol)为原料，操作过程同I-1，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝100:1)纯化，得黄色固体(I-4)0.85g，收率38.2％，180℃(炭化)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.56(s,1H),7.23(s,1H),5.48(s,1H),4.77(d,J＝12.9Hz,1H),4.46(d,J＝13.3Hz,1H),4.02(s,2H),3.67(s,2H),2.98(d,J＝16.0Hz,1H),2.92–2.80(m,1H),2.75–2.41(m,9H),2.32(s,3H),2.26–2.04(m,3H),1.97–1.75(m,3H),1.61–1.44(m,1H),1.29(s,3H),1.17(s,3H),1.14(s,3H),1.07(s,3H).ESI-MS(m/z):611.3[M+H]⁺

以化合物I-4(0.8g,1.31mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得浅黄色固体(I-4·HCl)0.68g，收率80.3％，m.p.>200℃。

实施例5

23-(4-(哌啶-1-基)丁酰基)柠檬苦素(I-5)的制备

23-(4-氯丁酰基)柠檬苦素(IV-2)

1000ml三颈瓶中加入柠檬苦素(40.0g,85.01mmol)和二氯甲烷(500mL)，搅拌下降温至0℃，分批加入三氯化铝(51.0g,382.5mmol)，加毕，保温搅拌20min，滴加4-氯丁酰氯(14.4g,102.0mmol)与二氯甲烷(15mL)的混合溶液，滴毕，保持0～-5℃反应1小时，再于室温继续搅拌反应2小时，停止反应，将反应液慢慢倒入500mL冰水中，分取二氯甲烷层，水层用二氯甲烷萃取两次(300mL×2)，合并有机层，用1mol/L氢氧化钠水溶液洗三次(300mL×3)，饱和食盐水洗涤两次(300mL×2)，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸除溶剂。粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝160:1)纯化，得浅绿色固体(IV-2)20.5g，收率42％，m.p.160～163℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.58(s,1H),7.13(s,1H),5.50(s,1H),4.78(d,J＝12.9Hz,1H),4.47(d,J＝13.1Hz,1H),4.03(s,2H),3.65(t,J＝6.2Hz,2H),3.03(t,J＝7.0Hz,2H),2.99–2.80(m,2H),2.68(d,J＝16.7Hz,1H),2.59–2.42(m,2H),2.30–2.11(m,3H),1.97–1.76(m,3H),1.54(s,1H),1.30(s,3H),1.19(s,3H),1.15(s,3H),1.08(s,3H).ESI-MS(m/z):597.2[M+Na]⁺

23-(4-(哌啶-1-基)丁酰基)柠檬苦素(I-5)

100ml三颈瓶中加入IV-2(2g,3.48mmol)，乙腈(50mL)，哌啶(1.78g,20.88mmol)和碘化钾(0.1g,0.6mmol)，加热回流反应48h，TLC(二氯甲烷:甲醇＝25:1)检测反应完全，减压蒸除溶剂。残留物加入50mL水，析出黄色固体，抽滤，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)纯化，得浅褐色固体(I-5)0.74g，收率34％，150℃(炭化)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.56(s,1H),7.13(s,1H),5.47(s,1H),4.76(d,J＝13.1Hz,1H),4.46(d,J＝13.1Hz,1H),4.03(d,J＝9.1Hz,2H),3.08–2.96(m,2H),2.95–2.80(m,3H),2.78–2.56(m,6H),2.52(d,J＝11.2Hz,1H),2.44(d,J＝14.5Hz,1H),2.22(d,J＝13.5Hz,1H),2.11–1.98(m,2H),1.96–1.76(m,3H),1.76–1.63(m,4H),1.61–1.42(m,3H),1.28(s,3H),1.16(s,3H),1.13(s,3H),1.06(s,3H).ESI-MS(m/z):624.3[M+H]⁺

以化合物I-5(0.65g,1.04mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得白色固体(I-5·HCl)0.51g，收率74％，m.p.190～193℃。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ9.94(s,1H),8.05(s,1H),7.49(s,1H),5.54(s,1H),4.92(d,J＝12.6Hz,1H),4.48(d,J＝13.1Hz,1H),4.14(s,1H),4.08(s,1H),3.38–3.30(m,2H),3.20–3.05(m,1H),3.05–2.91(m,4H),2.90–2.79(m,2H),2.76(d,J＝16.7Hz,1H),2.66–2.52(m,2H),2.45–2.39(m,1H),2.27(d,J＝14.4Hz,1H),2.04–1.91(m,2H),1.87–1.61(m,9H),1.43–1.32(m,1H),1.17(s,3H),1.09(s,3H),1.00(d,J＝3.3Hz,6H).

实施例6

23-(4-(吗啉-4-基)丁酰基)柠檬苦素(I-6)的制备

以化合物IV-2(2.0g,3.48mmol)和吗啉(1.52g,17.4mmol)为原料，操作过程同I-5，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝80:1)纯化，得浅褐色固体(I-6)1.43g，收率66％，144℃(炭化)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.55(s,1H),7.08(s,1H),5.49(s,1H),4.77(d,J＝13.0Hz,1H),4.46(d,J＝13.2Hz,1H),4.03(d,J＝7.7Hz,2H),3.68–3.52(m,4H),2.98(dd,J＝16.7,3.6Hz,1H),2.93–2.86(m,1H),2.82(t,J＝6.9Hz,2H),2.68(d,J＝17.2Hz,1H),2.57–2.47(m,2H),2.47–2.35(m,6H),2.26–2.18(m,1H),1.97–1.77(m,5H),1.58–1.48(m,1H),1.29(s,3H),1.18(s,3H),1.14(s,3H),1.07(s,3H).ESI-MS(m/z):626.3[M+H]⁺

以化合物I-6(1.3g,2.08mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得白色固体(I-6·HCl)1.18g，收率86％，200℃(炭化)。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ10.71(s,1H),8.05(s,1H),7.49(s,1H),5.54(s,1H),4.92(d,J＝13.5Hz,1H),4.48(d,J＝12.9Hz,1H),4.14(s,1H),4.08(s,1H),3.98–3.88(m,2H),3.82–3.70(m,2H),3.49–3.40(m,2H),3.15–3.02(m,4H),3.01–2.92(m,3H),2.75(d,J＝16.5Hz,1H),2.65–2.52(m,2H),2.45–2.40(m,1H),2.27(d,J＝11.7Hz,1H),2.04–1.91(m,2H),1.85–1.63(m,3H),1.31–1.22(m,1H),1.17(s,3H),1.09(s,3H),1.00(d,J＝3.4Hz,6H).

实施例7

23-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酰基)柠檬苦素(I-7)的制备

以化合物IV-2(2.0g,3.48mmol)和N-甲基哌嗪(1.74g,17.4mmol)为原料，操作过程同I-5，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝80:1)纯化，得浅褐色固体(I-7)1.0g，收率45％，146℃(炭化)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.55(s,1H),7.08(s,1H),5.49(s,1H),4.77(d,J＝13.1Hz,1H),4.46(d,J＝13.0Hz,1H),4.03(d,J＝4.5Hz,2H),2.99(dd,J＝16.8,3.7Hz,1H),2.93–2.85(m,1H),2.82(t,J＝7.0Hz,2H),2.75–2.63(m,2H),2.62–2.35(m,10H),2.31(s,3H),2.27–2.16(m,2H),1.98–1.74(m,5H),1.60–1.47(m,1H),1.30(s,3H),1.18(s,3H),1.15(s,3H),1.07(s,3H).ESI-MS(m/z):639.3[M+H]⁺

以化合物I-7(0.9g,1.4mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得白色固体(I-7·HCl)0.69g，收率73.1％，m.p.>200℃。

实施例8

23-(4-(吡咯-1-基)丁酰基)柠檬苦素(I-8)的制备

以化合物IV-2(2.0g,3.48mmol)和吡咯烷(1.24g,17.4mmol)为原料，操作过程同I-5，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)纯化，得褐色固体(I-8)0.91g，收率42.9％，m.p.154～156℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.59(s,1H),7.21(s,1H),5.49(s,1H),4.77(d,J＝13.1Hz,1H),4.46(d,J＝13.1Hz,1H),4.04(d,J＝9.2Hz,2H),3.11–2.78(m,10H),2.69(d,J＝16.0Hz,1H),2.56–2.42(m,2H),2.27–2.10(m,3H),2.06–1.96(m,4H),1.91–1.79(m,3H),1.61(s,1H),1.29(s,3H),1.18(s,3H),1.14(s,3H),1.06(s,3H).ESI-MS(m/z):610.4[M+H]⁺

以化合物I-8(0.8g,1.31mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得浅黄色固体(I-8·HCl)0.55g，收率64.9％，190℃(炭化)。

实施例9

23-(4-(哌嗪-1-基)丁酰基)柠檬苦素(I-9)的制备

以化合物IV-2(2g,3.48mmol)和N-叔丁氧羰基哌嗪(5.21g,27.86mmol)为原料，操作过程同I-5，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝100:1)纯化，得黄色中间体0.92g。将该黄色中间体溶于甲醇(10mL)和二氯甲烷(10mL)的混合溶剂中，冰浴搅拌下滴加饱和HCl的甲醇溶液(10mL)，滴毕，室温反应5小时，TLC检测(二氯甲烷:甲醇＝20:1)反应完全，停止反应，调pH至中性，减压蒸除溶剂，用二氯甲烷(30mL)溶解残留物，加水(20mL)，分取二氯甲烷层，水层用二氯甲烷萃取两次(20mL×2)，合并有机层，饱和食盐水洗涤两次(20mL×2)，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸除溶剂。粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)纯化，得黄色固体(I-9)0.33g，两步合计收率15.2％，162℃(炭化)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.56(s,1H),7.08(s,1H),5.49(s,1H),4.77(d,J＝13.6Hz,1H),4.47(d,J＝11.6Hz,1H),4.07(d,J＝34.5Hz,2H),3.07–2.56(m,9H),2.55–2.30(m,8H),2.29–2.25(m,1H),2.01–1.79(m,5H),1.64–1.51(m,1H),1.30(s,3H),1.18(s,3H),1.15(s,3H),1.07(s,3H),0.88(brs,1H).ESI-MS(m/z):625.2[M+H]⁺

以化合物I-9(0.25g,0.4mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得浅黄色固体(I-9·HCl)0.23g，收率87.1％，m.p.>200℃。

实施例10

23-(4-(二正丙氨基)丁酰基)柠檬苦素(I-12)的制备

以化合物IV-2(2.0g,3.48mmol)和二正丙胺(2.11g,20.85mmol)为原料，操作过程同I-5，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝40:1)纯化，得浅黄色固体(I-12)0.36g，收率16.2％，148℃(炭化)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.55(s,1H),7.10(s,1H),5.48(s,1H),4.77(d,J＝13.1Hz,1H),4.46(d,J＝13.1Hz,1H),4.03(s,2H),2.98(dd,J＝16.8,3.7Hz,1H),2.93–2.79(m,3H),2.68(d,J＝16.6Hz,1H),2.61–2.39(m,8H),2.26–2.18(m,1H),2.02–1.77(m,5H),1.58–1.41(m,5H),1.29(s,3H),1.17(s,3H),1.14(s,3H),1.07(s,3H),0.87(t,J＝7.3Hz,6H).ESI-MS(m/z):640.3[M+H]⁺

以化合物I-12(0.3g,0.47mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得浅黄色固体(I-12·HCl)0.28g，收率88.5％，m.p.174～176℃。

实施例11

23-(4-(咪唑-1-基)丁酰基)柠檬苦素(I-13)的制备

以化合物IV-2(2.0g,3.48mmol)和咪唑(1.18g,17.3mmol)为原料，操作过程同I-5，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝50:1)纯化，得灰色固体(I-13)0.27g，收率12.8％，150℃(炭化)。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ8.02(s,1H),7.93(s,1H),7.44(s,1H),7.36(s,1H),6.97(s,1H),5.52(s,1H),4.91(d,J＝13.2Hz,1H),4.47(d,J＝12.4Hz,1H),4.11(s,2H),4.09–4.02(m,2H),3.19–3.05(m,1H),2.85–2.77(m,2H),2.76–2.70(m,1H),2.66–2.51(m,2H),2.45–2.39(m,1H),2.27(d,J＝11.7Hz,1H),2.09–1.95(m,2H),1.90–1.65(m,3H),1.28–1.22(m,1H),1.17(s,3H),1.08(s,3H),1.00(d,J＝4.3Hz,6H).ESI-MS(m/z):607.3[M+H]⁺

以化合物I-13(0.2g,0.33mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得灰白色固体(I-13·HCl)0.18g，收率85.1％，196℃(炭化)。

实施例13

23-(4-(哌啶-1-基)丁酰基)脱氧柠檬苦素(II-2)的制备

23-(4-氯丁酰基)脱氧柠檬苦素(VI)

250ml茄形瓶中加入脱氧柠檬苦素V(10g,22.02mmol)和二氯甲烷(140mL)，

搅拌下降温至-5℃，分批加入三氯化铝(14.69g,110.1mmol)，加毕，保温搅拌30min，滴加4-氯丁酰氯(4.04g,28.65mmol)，滴毕，保持0～-5℃反应1小时，于室温继续搅拌反应12小时，停止反应，将反应液慢慢倒入150ml冰水中，分取二氯甲烷层，水层用二氯甲烷萃取两次(100mL×2)，合并有机层，用1mol/L氢氧化钠水溶液洗三次(100mL×3)，饱和食盐水洗涤两次(100mL×2)，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸除溶剂。粗品用柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)纯化，得白色固体(VI)6.48g，收率52.7％，m.p.136-139℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.65(s,1H),7.19(s,1H),6.86(s,1H),5.03(s,1H),4.68(d,J＝13.3Hz,1H),4.57(d,J＝13.3Hz,1H),4.11(s,1H),3.65(t,J＝6.2Hz,2H),3.04(t,J＝7.1Hz,2H),2.97(dd,J＝12.6,4.1Hz,1H),2.90–2.76(m,1H),2.67–2.49(m,3H),2.31(d,J＝15.6Hz,1H),2.25–2.15(m,2H),2.15–2.06(m,1H),1.92–1.80(m,1H),1.61–1.50(m,2H),1.41(s,3H),1.30(s,3H),1.22(s,3H),1.19(s,3H).ESI-MS m/z:557.2[M-H]^-

23-(4-(哌啶-1-基)丁酰基)脱氧柠檬苦素(II-2)

以化合物VI(2.0g,3.58mmol)和哌啶(1.83g,21.5mmol)为原料，操作过程同I-5，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)纯化，得黄色固体(II-2)0.88g，收率40.5％，m.p.139～142℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.62(s,1H),7.13(s,1H),6.85(s,1H),5.02(s,1H),4.67(d,J＝13.4Hz,1H),4.56(d,J＝13.2Hz,1H),4.11(s,1H),2.95(d,J＝16.3Hz,1H),2.89–2.74(m,3H),2.70–2.46(m,3H),2.45–2.30(m,6H),2.30–2.19(m,1H),2.17–2.02(m,1H),1.99–1.90(m,2H),1.89–1.78(m,1H),1.72–1.55(m,2H),1.55–1.45(m,4H),1.40(s,5H),1.28(s,3H),1.20(s,3H),1.17(s,3H).ESI-MS m/z:608.4[M+H]⁺

以化合物II-2(0.8g,1.32mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得浅黄色固体(II-2·HCl)0.64g，收率75.5％，178℃(炭化)。

实施例14

23-(4-(吗啉-4-基)丁酰基)脱氧柠檬苦素(II-3)

以化合物VI(2.0g,3.58mmol)和吗啉(1.87g,21.5mmol)为原料，操作过程同I-5，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)纯化，得浅黄色固体(II-3)0.8g，收率36.7％，m.p.141～144℃。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.62(s,1H),7.13(s,1H),6.84(s,1H),5.02(s,1H),4.67(d,J＝13.3Hz,1H),4.56(d,J＝13.3Hz,1H),4.11(s,1H),3.58(s,4H),3.03–2.86(m,2H),2.86–2.76(m,2H),2.69–2.52(m,3H),2.52–2.35(m,6H),2.34–2.24(m,1H),2.17–2.02(m,1H),2.00–1.89(m,2H),1.88–1.78(m,1H),1.66–1.48(m,2H),1.39(s,3H),1.28(s,3H),1.20(s,3H),1.17(s,3H).ESI-MS m/z:632.3[M+Na]⁺

以化合物II-3(0.7g,1.15mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得浅黄色固体(II-3·HCl)0.62g，收率83.5％，198℃(炭化)。

实施例15

23-(4-(二正丙氨基)丁酰基)脱氧柠檬苦素(II-5)的制备

以化合物VI(2.0g,3.58mmol)和二正丙胺(2.17g,21.44mmol)为原料，操作过程同I-5，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)纯化，得灰褐色固体(II-5)0.44g，收率19.7％，m.p.126～128℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.64(s,1H),7.18(s,1H),6.84(s,1H),5.02(s,1H),4.67(d,J＝12.3Hz,1H),4.57(d,J＝12.4Hz,1H),4.11(s,1H),3.08–2.74(m,4H),2.72–2.41(m,9H),2.30(d,J＝15.2Hz,1H),2.20–2.06(m,1H),2.04–1.81(m,3H),1.71–1.46(m,6H),1.40(s,3H),1.28(s,3H),1.20(s,3H),1.17(s,3H),0.95–0.84(m,6H).ESI-MS m/z:624.4[M+H]⁺

以化合物II-5(0.35g,0.56mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得灰色固体(II-5·HCl)0.27g，收率72.9％，172℃(炭化)。

实施例16

23-(4-(咪唑-1-基)丁酰基)脱氧柠檬苦素(II-6)的制备

以化合物VI(2.0g,3.58mmol)和咪唑(1.22g,17.92mmol)为原料，操作过程同I-5，粗品用柱层析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)纯化，得黄色固体(II-6)0.26g，收率12.3％，m.p.132～135℃。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ8.04(s,1H),7.62(s,1H),7.45(s,1H),7.18(s,1H),6.88(s,1H),6.63(s,1H),5.19(s,1H),4.82(d,J＝11.7Hz,1H),4.61(d,J＝11.7Hz,1H),4.11(s,1H),4.06–3.89(m,2H),3.22–3.06(m,1H),2.89–2.73(m,2H),2.71–2.52(m,3H),2.44–2.25(m,2H),2.22–1.90(m,3H),1.87–1.43(m,3H),1.28(s,3H),1.16(s,3H),1.13(s,3H),1.00(s,3H).ESI-MS m/z:591.3[M+H]⁺

以化合物II-6(0.2g,0.34mmol)为原料，操作过程同I-1·HCl，得灰色固体(II-6·HCl)0.18g，收率84.8％，176℃(炭化)。

柠檬苦素衍生物、其制备方法及医药用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。