专利摘要

本发明公开了结构式（I）所示的化合物，其中，R’为氢或C1～C18的烷基，R’’为C1～C18的烷基。本发明是一种可比率型检测G4 DNA的荧光探针，该探针通过共聚焦显微镜和超高分辨显微镜，成功实现了在活细胞或固定后细胞中对G4 DNA和溶酶体的同时检测，尤其是实现了重要癌靶标分子G4 DNA在活细胞中的原位、实时、超清晰成像。

权利要求

1.结构式（I）所示的化合物，

其中，R’为氢或C1～C18的烷基，R’’为C1～C18的烷基。

2.根据权利要求1所示的化合物，其特征在于：R’为氢或C1～C6的烷基，R’’为C1～C6的烷基。

3.权利要求1所示化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

化合物（A）与化合物（B）发生缩合反应得到结构式（I）所示的化合物，反应式如下：

。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：反应温度为60～115 °C，使用醇、乙腈、芳香烃作为溶剂，在有机胺类催化下，通过缩合反应得到化合物（I）。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：所述的醇选自甲醇、乙醇、异丙醇；芳香烃选自甲苯、苯；有机胺选自六氢吡啶、三乙胺、吡啶。

6.权利要求1所示化合物（I）在检测G-四链体 DNA中的应用。

7.权利要求1所示化合物（I）在细胞内同时检测溶酶体和G-四链体DNA的应用。

8.权利要求1所示化合物（I）在细胞荧光成像中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及螺吡喃类衍生物及在检测G-四链体 DNA和溶酶体中的应用，属于化学生物学传感器技术领域。

背景技术

长期以来，科学家们展开了大量针对癌症治疗的研究，旨在杀死、杀伤肿瘤细胞，同时又不影响正常细胞。近年来，随着癌症生物学的发展，越来越精确的靶向治疗方法被发现，其中，G-四链体（G4）DNA和溶酶体成为最新的精准抗癌靶标。

G4 DNA是一种非传统的核酸结构，是由富含串联重复鸟嘌呤（G）的DNA折叠形成的高级结构，已被证实可稳定存在于人体活细胞中（Biffi G, Tannahill D, McCafferty J,et al. Nature Chemistry, 2013, 5, 182）。它们不仅具有独特的结构，而且有着丰富的生物学功能。生物信息学表明，在人体基因组中大约含有~ 400000个可形成G4 DNA的序列，并位于基因组许多重要的生物学功能区域。但是这些序列在肿瘤抑制基因中很少，反而在促进肿瘤发生或增殖的原癌基因中比例很高，如一些重要的原癌基因的启动子区，包括C-myc、C-kit、KRAS、bcl-2和VEGF等基因序列中。2016年，剑桥大学的研究团队通过对癌变前的人类细胞系进行研究，检测到了差不多一万个G4。该项研究指出G4主要位于调控基因开关的DNA区域，特别是与癌症有关的基因，因此，G4 DNA现已成为癌症诊疗研究的新型靶标（Hänsel-Hertsch R, Beraldi D, Lensing S V, et al. Nature Genetics, 2016, 48,1267）。溶酶体一直以来都被误认为是细胞的“垃圾桶”，但我们现在知道这一结构更像是细胞的“胃”。通过溶酶体，大分子可由水解酶进行降解，这些酶包括各种负责蛋白降解的蛋白酶，降解后细胞也能获得相应的营养成分。而且溶酶体参与了多种细胞生命过程，如物质代谢、细胞膜循环、细胞凋亡以及信号转导等。在肿瘤细胞中的溶酶体体积比在正常细胞中更大。一项近期的研究表明，溶酶体也可作为理想的药物靶标，用于选择性摧毁癌细胞（Petersen N H T, Olsen O D, Groth-Pedersen L, et al. Cancer Cell, 2013, 24,379）。

将细胞中溶酶体和G4 DNA这两种靶标物可视化，不仅有助于理解溶酶体参与生命活动的分子机制, 而且对癌症的早期精准筛查具有重要的指导意义。近年来，分别靶向溶酶体和G4 DNA的分子光学探针已有报道，但目前为止，还受限于以下两点：1、未能实现比率型检测G4 DNA；2、未能实现在细胞中同时检测溶酶体和G4 DNA两种标靶物。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型螺吡喃衍生物QIN及其制备方法。

本发明的另一个目的是将上述螺吡喃衍生物QIN作为荧光探针应用于G4 DNA的比率型检测，以及在细胞内对溶酶体和G4 DNA的同时检测和成像。

结构式（I）所示化合物，

其中，R’为氢或C1～C18的烷基，R’’为C1～C18的烷基；R’ 优选为氢或C1～C6的烷基，R’’优选为C1～C6的烷基。

上述化合物（I）的制备方法：化合物（A）与化合物（B）发生缩合反应得到化合物（I），反应式如下：

上述反应温度为60～115 °C，使用醇、乙腈、芳香烃作为溶剂，在有机胺类催化下，通过缩合反应得到化合物（I）。所述的醇选自甲醇、乙醇、异丙醇；芳香烃选自甲苯、苯；有机胺选自六氢吡啶、三乙胺、吡啶。

本发明化合物（I）可应用在检测G-四链体 DNA。

本发明化合物（I）可应用在细胞内同时检测溶酶体和G-四链体DNA。

本发明化合物（I）可应用在细胞荧光成像。

本发明在没有光或酸碱刺激下，G4 DNA也能够调控螺吡喃染料的开关和变色。G4DNA主要存在于细胞核内，而溶酶体作为细胞中的一种常见细胞器，位于细胞质区域，内含多种水解酶，其内环境的pH小于5.0，利用这种酸性环境的条件实现螺吡喃染料的变色。基于以上发现，本发明开发了可比率型检测G4 DNA的荧光探针化合物（I），并借助共聚焦显微镜和超高分辨显微镜，成功实现了这类分子在细胞（活细胞或固定后细胞）中对G4 DNA（核内）和溶酶体（核外）的同时比率型检测和成像。

本发明的优点：

（1）首次开发了可比率型检测G4 DNA的荧光探针，因为比率型检测不受底物和探针浓度、外部环境和仪器条件变化等影响，可有效避免检测时的背景干扰和假阳性，从而实现对G4 DNA和溶酶体的精准检测；

（2）该探针通过共聚焦显微镜和超高分辨显微镜，成功实现了在细胞（活细胞或固定后细胞）中对G4 DNA（核内）和溶酶体（核外）的同时检测，尤其是实现了重要癌靶标分子G4DNA在活细胞中的原位、实时、超清晰成像。

附图说明

图1为荧光探针QIN-1在缓冲溶液中对C-myc G4 DNA不同浓度的荧光光谱；

图2为荧光探针QIN-1在缓冲溶液中对C-myc G4 DNA不同浓度的工作曲线图；

图3为荧光探针QIN-1在缓冲溶液中对G4 DNA、单链DNA、双链DNA的选择性柱状图；

图4为荧光探针QIN-1在缓冲溶液中对C-myc G4 DNA不同浓度的紫外光谱；

图5为荧光探针QIN-1在缓冲溶液中与C-myc G4 DNA圆二色谱；

图6为荧光探针QIN-1在活的正常细胞和癌细胞中的荧光成像图；

图7为荧光探针QIN-1在固定后HepG2细胞中DNA酶和RNA酶验证实验荧光成像图；

图8为荧光探针QIN-1在固定后U-2 OS细胞中DNA酶和RNA酶验证实验荧光成像图；

图9为荧光探针QIN-1在U-2 OS活细胞中的超分辨荧光成像图；

图10为荧光探针QIN-1在固定后U-2 OS细胞中DNA酶和RNA酶验证实验的超分辨荧光成像图。

具体实施方式

下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1荧光探针QIN-1的制备

在干燥的25 mL圆底烧瓶中，加入0.0717 g (0.33 mmol) 8-羟基久洛尼定-9-甲醛，0.0993 g (0.33 mmol) 1, 2, 3, 3-四甲基-3H-吲哚碘盐，30 μL哌啶和10 mL乙醇。回流9h。冷却，有粉红色固体析出，抽滤，乙醚洗涤滤饼，干燥得产物，即为荧光探针QIN-1，产量为0.0850g，产率为69%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.14 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.05 (d,J =8 Hz, 1H), 6.80 (t, J =8.0 Hz, 1H), 6.70 (d, J =12.0 Hz, 1H), 6.49 (t, J =8.0 Hz, 2H), 5.37 (d, J =8.0 Hz, 1H), 3.08 (t, J =4.0 Hz, 2H), 3.02 (t, J =4.0 Hz, 2H),2.68 (s, 5H), 2.39 – 2.35 (m, 2H), 1.96 – 1.90 (m, 2H), 1.83 –1.77 (m, 2H), 1.28 (s, 3H), 1.15 (s, 3H);13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 150.07,148.60, 144.05, 137.46, 129.47, 127.19, 124.22, 121.32, 118.56, 113.42,112.88, 107.85, 107.17, 106.60, 104.18, 51.03, 50.14, 49.67, 28.93, 27.04,25.85, 22.33, 21.41, 20.41, 20.34; HRMS (ESI) calcd. for C25H29N2O (M+H)+:373.2274, Found: 373.2271; FT-IR (KBr, cm-1): 3424, 3046, 2926, 1720, 1611,1492, 1360, 1308, 1265, 1153, 1022, 952, 917, 883, 802, 737, 682, 551, 473.

荧光探针QIN-1对C-myc G4 DNA不同浓度的荧光光谱测试：在5 mL的比色管中加入50μL 10-3 M的QIN-1母液，1 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7.6, 20 mM KCl），再用超纯水稀释至5 mL刻度。取250μL 10-5 M的QIN-1加入微量比色皿中，向其中分别加入体积为0, 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25μL的10-3 M C-myc G4 DNA溶液，测定各组的荧光光谱，如图1所示。由图1可知，随着C-myc G4 DNA浓度增大，QIN-1在长波长610 nm处的荧光强度逐渐增强，说明QIN-1在C-myc G4 DNA的作用下发生了开环。

荧光探针QIN-1对C-myc G4 DNA不同浓度的工作曲线测定：由QIN-1对C-myc G4DNA不同浓度的荧光光谱得到在610 nm处荧光响应强度随C-myc G4 DNA浓度工作曲线图，如图2所示。由图2可知，当体系中逐渐加入C-myc G4 DNA 时，610 nm处的荧光强度与C-mycG4 DNA浓度呈现良好的线性关系，线性方程为y = 156.62 x + 96.066，相关系数为0.9913。

荧光探针QIN-1在G4 、单链DNA、双链DNA中选择性荧光光谱测试：在5 mL的比色管中加入50μL 10-3 M的QIN-1母液，1 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7.6, 20 mM KCl），再用超纯水稀释至5mL刻度。取250 μL 10-5 M的QIN-1加入微量比色皿中，再向其中分别加入25 μL的100 µM C-myc DNA、C-kit DNA、bcl2、22AG、HIV-PRO-1、ss-DNA1、ss-DNA2、ss-DNA3、ss-DNA4、ds-DNA1、ds-DNA2、ct-DNA，测定各组的荧光光谱，如图3所示。由图3可知，QIN-1与G4作用后，在610 nm处均出现发射峰，荧光强度均有较明显地增加，而与单、双链DNA作用后并无明显变化。当加入C-myc G4 DNA时，该波长处的强度变化最大，说明QIN-1对C-myc G4DNA的检测具有良好的选择性。

荧光探针QIN-1对C-myc G4 DNA不同浓度的紫外光谱测试：在5 mL的比色管中加入50 μL 10-3 M的QIN-1母液，1 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7.6, 20 mM KCl），再用超纯水稀释至5 mL的刻度。取250 μL 10-5 M的QIN-1加入微量比色皿中，向其中依次加入体积为0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 μL的10-3 M C-myc G4 DNA溶液，测定相应的紫外-可见吸收光谱，如图4所示。由图4可知QIN-1在561 nm和525 nm有吸收峰，随着C-myc G4 DNA浓度的增加，QIN-1在561 nm处的吸收峰出现了明显的减色效应，而525 nm处的肩峰则越来越不明显。

荧光探针QIN-1与C-myc G4 DNA的圆二色谱测试：配制总体积为400 μL的C-mycG4 DNA和QIN-1溶液，其中固定待测样品中C-myc G4 DNA的终浓度为5 μM，用QIN-1进行滴定测试，即QIN-1的浓度分别为0、5、10、15、20、25 μM，如图5所示。由图5可知，QIN-1在该条件下不改变G4 C-kit DNA的平行结构，当QIN-1的浓度逐渐增加时，265 nm处的峰越来越正，而240 nm处的峰越来越负。

荧光探针QIN-1细胞中G4 DNA和溶酶体荧光成像研究：分别在正常细胞MRC-5（人胚肺成纤维细胞）和HPASMC（人肺动脉平滑肌细胞），癌细胞HepG2（人肝癌细胞）、SMMC-7721（人肝癌细胞）、A375（人皮肤黑色素瘤细胞）、MCF-7（人乳腺癌细胞）、PC-3（人前列腺癌细胞）和U-2 OS（人骨肉瘤细胞）中加入75 nM的溶酶体标记物（LysoTracker Green DND-26）培养10 min，PBS清洗三次细胞后，加入100 µM的QIN-1，孵育10 min，PBS清洗三次细胞后，采用激光共聚焦拍摄荧光成像图片（激发波长为405 nm、488 nm和516 nm，收集435-485nm、500-545 nm、570-640 nm波长范围），得到荧光成像图6。向种有癌细胞HepG2和U-2 OS的三个培养皿中加入1 mL多聚甲醛，固定10 min，PBS清洗三次细胞后，分别加入QIN-1（100 µM）、QIN-1（100 µM）和DNA酶（100 units·mL-1）、QIN-1（100 µM）和RNA酶（100 units·mL-1），其中QIN-1孵育10 min，之后加入的DNA酶和RNA酶孵育30 min，PBS清洗三次细胞后，在相同条件下拍摄荧光成像图片，得到荧光成像图7和8。如图6、7和8所示，QIN-1在活的正常细胞和癌细胞核外均能定位溶酶体，并且复染率高达90%以上；在癌细胞的核内则出现红斑，并通过DNA酶和RNA酶实验，验证了核内的红斑即为G4 所处的位置，说明QIN-1可以实现活细胞中实时、原位、同时检测G4 DNA和溶酶体。

荧光探针QIN-1细胞中G4 DNA和溶酶体超分辨荧光成像研究：在种有U-2 OS细胞培养皿中，加入5 µg·mL-1的Hoechst 33342，孵育20 min，PBS清洗三次细胞后，再加入100µM的QIN-1，孵育10 min，PBS清洗三次细胞后，采用结构化照明超分辨显微镜，拍摄超分辨荧光成像图片（激发波长为405 nm、488 nm和516 nm，收集435-485 nm、500-545 nm、570-640 nm波长范围），得到荧光成像图9。向种有癌细胞U-2 OS的三个培养皿中加入1 mL多聚甲醛，固定10 min，PBS清洗三次细胞后，再加入5 µg·mL-1的DAPI，孵育5 min，PBS清洗三次细胞后，再分别加入QIN-1（100 µM）、QIN-1（100 µM）和DNA酶（100 units·mL-1）、QIN-1（100µM）和RNA酶（100 units·mL-1），其中QIN-1孵育10 min，之后加入的DNA酶和RNA酶孵育30min，PBS清洗三次细胞后，在相同条件下拍摄超分辨荧光成像图片，得到荧光成像图10。如图9和10所示，QIN-1在活的和固定后的U-2 OS细胞核外，能够定位溶酶体；而在核内则出现红斑，并通过DNA酶和RNA酶实验，验证了核内的红斑即为G4 所处的位置。

序列表

<110> 西北大学

<120> 螺吡喃类衍生物及在检测G-四链体 DNA和溶酶体中的应用

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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螺吡喃类衍生物及在检测G-四链体DNA和溶酶体中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。