专利摘要
本发明属于甾体生物转化技术领域，具体涉及一株能有效降解植物甾醇侧链高产9α‑OH‑AD的偶发分枝杆菌及其应用。所述偶发分枝杆菌是一株经物理化学复合诱变获得的诱变菌株，其9α‑OH‑AD生成率最高可达97％；10g/L植物甾醇底物浓度下，9α‑OH‑AD生成率最为95.7％，是出发菌株的1.21倍，生物转化时间为72h，较出发菌株缩短24h，是目前现有技术中，以植物甾醇为底物生产9α‑OH‑AD转化率最高，转化时间最短的分枝杆菌，具有良好的工业化应用前景。
权利要求
1.一种生产9α-OH-AD的偶发分枝杆菌（
2.权利要求1所述偶发分枝杆菌ARL-91在发酵生产9α-OH-AD中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，菌种经种子培养后，按6-20 %的接种量接入含有终浓度5-10 g/L植物甾醇的发酵培养基，在28～30℃，140-200 r/min条件下发酵48-72 h。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成如下：硫酸铵1.8-2.2g/L，尿素0.15-0.3g/L，磷酸二氢钠0.7-1.0g/L，磷酸氢二钠0.5-0.7g/L，吐温80 0.1-0.3g/L，甘油8-10g/L、植物甾醇5-10g/L、甲基-β-环糊精15.8-39.5g/L，pH 6.5-8.0，在0.1～0.15 mpa压力下，120～122℃灭菌20 min。
说明书
技术领域：
本发明属于甾体生物转化技术领域，具体涉及一株能有效降解植物甾醇侧链高产9α-OH-AD的偶发分枝杆菌及其应用。
技术背景：
9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione，9α-OH-AD)是生产9α位上有卤素的皮质激素的重要前体，对机体起着非常重要的调节作用，许多甾体激素类药物都是以9α-OH-AD为起始原料进行生产的；利用9α-OH-AD可以合成氢化可的松、17α-羟基黄体酮、依普利酮、地塞米松、倍他米松、可的松、醋酸氟轻松、氟羟泼尼松龙等多种重要的甾体药物，具有重要的商业价值。
分枝杆菌、节杆菌及棒杆菌等很多微生物都能以植物甾醇作为碳源产生9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮等代谢中间体，通过微生物转化法生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮可以充分利用长期以来被用作废物的植物甾醇，摆脱了原材料来源对生产的制约，同时对保护自然资源和生态环境起到了很好的作用。但微生物对植物甾醇的转化过程仍存在很多限制因素，甾体化合物疏水性强，在水中的溶解度低；菌株转化能力普遍较低，高浓度底物投加量对转化过程的抑制等，因此提高菌株的转化能力，改善菌种对底物的耐受性进而提高投料浓度等都是甾体生物转化中要解决的关键问题。
为了提高微生物对植物甾醇的转化效力和产物产量，紫外、DES等物理和化学诱变及高浓度底物驯化培养方法常被用来选育优良菌株。吴宝华等用紫外照射和NTC复合诱变的方法处理节杆菌，经筛选获得一株ADD分解酶缺陷型菌株，能有效积累ADD，该菌株对豆甾醇的降解率达到95％，ADD产率达45％左右。杨英等分别采用紫外线照射、60Co、紫外线与60Co复合诱变处理出发菌株Mycobaterium sp.BD696，筛选得到一高转化率突变株，其AD产量较出发菌株提高39.2％，且没有结构类似物ADD产生。黄丽君等以一株降解植物甾醇产生雄烯二酮的分枝杆菌为研究对象，先后利用亚硝基胍(NTG)和N+注入技术对其进行诱变处理，最终选育出一株高产突变株Mycobaterium sp.N-2，其雄烯二酮生产能力较出发菌株提高了37.8％。Vidal等在含有14g/Lβ-谷甾醇的培养基中反复培养分枝杆菌Mycobateriumsp.MB-3683和Mycobaterium sp.B-11045，连续转接培养7次后，两株菌对谷甾醇的转化率分别提高了44％和21％。英国专利GB1530730公开的以亚硝基胍诱变处理偶发分枝杆菌ATCC6842选育出具有9α-羟基化酶的突变菌株偶发分枝杆菌Mycobacterium fortuitumNRRL B-8119，该突变菌株能够转化谷甾醇、胆固醇或豆甾醇生成9α-OH-AD，但转化周期长达336小时，且底物转化率极低，只能得到微量产物9α-OH-AD。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种可高产9α-OH-AD的偶发分枝杆菌及其应用，该菌株可以以植物甾醇为底物，有效降解植物甾醇侧链高产9α-OH-AD。植物甾醇的投加浓度可达10g/L，9α-OH-AD的转化率可达97％。
所述偶发分枝杆菌具体为偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)ARL-91，该菌株已于2018年11月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC NO.16771。
偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)ARL-91是一株经物理化学复合诱变获得的诱变菌株，其9α-OH-AD生成率最高可达97％；10g/L植物甾醇底物浓度下，9α-OH-AD生成率为95.7％，是出发菌株的1.21倍，生物转化时间为72h，较出发菌株缩短24h。
所述的偶发分枝杆菌ARL-91具有以下微生物学特征：
形态学特征为：
(1)细胞形态呈细长略弯曲的杆状，有时有分枝或出现丝状体，具有膨大或棒状末端；大小为6～10μm；
(2)菌落光滑、饱满、中间隆起、边缘不整齐、不透明，菌落呈淡灰色；
生理生化特征为：
培养时间：2～3天；好氧；最适生长pH值为pH6.8；最适生长温度为30℃；转化主要产物：9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)。
本发明还提供上述偶发分枝杆菌ARL-91在生产9α-OH-AD中的应用。
ARL-91发酵生产9α-OH-AD的方法具体如下：
菌种经种子培养后，按6-20％的接种量接入含有终浓度5-10g/L植物甾醇的发酵培养基，在28～30℃，140-200r/min条件下发酵48-72h，发酵结束后9α-OH-AD的生成率可达94-97％。
优选地，所述发酵培养基组成如下：硫酸铵1.8-2.2g/L，尿素0.15-0.3g/L，磷酸二氢钠0.7-1.0g/L，磷酸氢二钠0.5-0.7g/L，吐温80 0.1-0.3g/L，甘油8-10g/L、植物甾醇5-10g/L、甲基-β-环糊精15.8-39.5g/L，pH 6.5-8.0，在0.1～0.15mpa压力下，120～122℃灭菌20min。
有益效果：
本发明提供的偶发分枝杆菌是经物理化学复合诱变所得，诱变后其底物投加浓度可达10g/L，5-10g/L植物甾醇浓度下，发酵48-72h，发酵结束后9α-OH-AD的生成率可达94-97％。其中，10g/L植物甾醇浓度时，9α-OH-AD的转化率可达95.7％，9α-OH-AD的转化率较原始菌株提高21.2％，转化时间缩短24h左右，是目前现有技术中，以植物甾醇为底物生产9α-OH-AD转化率最高，转化时间最短的分枝杆菌，具有良好的工业化应用前景。
附图说明：
图1为实施例2突变菌株与出发菌株的9α-OH-AD生物转化过程曲线。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
实施例1：ARL-91的诱变筛选
偶发分枝杆菌的ARTP和LiCl复合诱变：
(1)用0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下出发菌株偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)(该菌株由申请人实验室保藏)斜面种子，使菌体OD600值控制在1.0±0.2。以3％的接种量接种到装有50mL种子培养基(同实施例2)中，30℃，200r/min培养至对数生长期(22～24h)；
(2)ARTP诱变
调节步骤(1)培养的出发菌株制备成OD600＝0.6～0.8的菌悬液，用移液枪吸取10μL于诱变载片，进行ARTP诱变，诱变时间为60s，将诱变载片上的菌体洗下得到菌悬液，对诱变菌悬液进行梯度稀释，分别取100μL涂布在琼脂培养基上，37℃培养60h。挑选480个单菌落，进行24深孔板微量培养，结合2,4-二硝基苯肼显色原理作为初筛手段，选育能高效转化植物甾醇的生产菌株，以此菌株作为下一步LiCl诱变的出发菌株；
(3)LiCl诱变
将步骤(2)所得出发菌株制备成OD600＝0.6～0.8的菌悬液，菌悬液中加入终浓度为3.25％的LiCl，37℃水浴处理30min，在振荡器上间歇震荡1min，加1mL 0.9％生理盐水终止反应，对诱变菌悬液进行梯度稀释，分别取100μL涂布在琼脂培养基上，37℃培养60h。挑选480个单菌落，进行24深孔板微量培养，结合2,4-二硝基苯肼显色原理作为初筛手段，选育能高效转化植物甾醇的生产菌株，以此菌株作为下一步复合诱变的出发菌株；
(4)ARTP与LiCl复合诱变
将步骤(3)所得出发菌株制备成OD600＝0.6～0.8的菌悬液，用移液枪吸取10μL于诱变载片，进行ARTP诱变，诱变后在超净台中向各装有诱变后载片的EP管中加入1mL3.25％的LiCl溶液，37℃水浴处理30min，加1mL 0.9％生理盐水终止反应，在振荡器上间歇震荡1min，对复合诱变菌悬液进行梯度稀释，分别取100μL涂布在琼脂培养基上，37℃培养60h；
偶发分枝杆菌诱变菌株的初步筛选：
共挑取诱变后在琼脂培养基中生长起来的单菌落2100个，另取出发菌株作为对照，进行24微孔板培养，基于2,4-二硝基苯肼显色技术进行初筛，选育能高效转化植物甾醇的生产菌株142株，并对初筛获得的142株菌株进行24微孔板二筛，获得11株能高效转化植物甾醇的诱变菌株，对11株二筛获得的诱变菌株进行摇瓶发酵复筛，以转化过程终点产物9α-OH-AD的含量为指标，筛选高产9α-OH-AD偶发分枝杆菌ARL-91。
实施例2：偶发分枝杆菌发酵生产9α-OH-AD
实验菌株：ARL-91及出发菌株；
(1)种子培养
分别取培养2～3天的新鲜ARL-91菌株和出发菌株斜面各一只，用0.5％的Tween80无菌水溶液洗下斜面种子，使菌体OD600值控制在1.0±0.2。以3％的接种量接种到装有50mL种子培养基中，30℃，200r/min培养至对数生长期(22～24h)。
所述种子培养基组分如下：磷酸氢二铵1.5g/L，酵母粉9g/L，甘油10g/L，磷酸二氢钠0.5g/L，磷酸氢二钠0.5g/L，吐温80 0.5g/L，pH调至7.3；
(2)发酵培养
种子液以8％的接种量接入发酵培养基，发酵培养基中投加有终浓度为10g/L的植物甾醇，在28～30℃，140r/min条件下发酵96h。
所述发酵培养基组成如下：硫酸铵1.8g/L，尿素0.3g/L，磷酸二氢钠0.8g/L，磷酸氢二钠0.7g/L，吐温80 0.2g/L，甘油9g/L、植物甾醇10g/L、甲基-β-环糊精31.6g/L，pH7.3。
(3)在转化过程中取发酵液800μL，加入等体积的乙酸乙酯，超声20min，12000r/min离心10min，取上清进行HPLC检测9α-OH-AD含量。
通过产物9α-OH-AD的含量X9α-OH-AD(g/L)，计算9α-OH-AD的生成率。
9α-OH-AD生成率的计算方程式为：
式中d代表样品的稀释倍数；V为发酵液的计算体积；msub为V体积内底物的投加量；其中M9α-OH-AD、Msub分别为9α-OH-AD与底物的相对分子质量，分别为302.4g/mol、406.8g/mol。
诱变菌株ARL-91植物甾醇的转化率达到95.7％，出发菌株植物甾醇的转化率为78.7％，诱变菌较出发菌株提高21.2％，ARL-91在72h即可完成转化，出发菌株需要96h，发酵过程曲线如图1。
实施例3 ARL-91发酵生产9α-OH-AD
(1)生产菌株为ARL-91，种子培养同实施例1；
(2)发酵培养：将种子液按10％的接种量接入发酵培养基，发酵培养基中投加有终浓度为5g/L的植物甾醇，在28～30℃，160r/min条件下发酵48h，发酵结束后9α-OH-AD的生成率可达96.2％。
所述发酵培养基组成如下：硫酸铵2.0g/L，尿素0.2g/L，磷酸二氢钠1.0g/L，磷酸氢二钠0.5g/L，吐温80 0.3g/L，甘油8g/L、植物甾醇5g/L、甲基-β-环糊精15.8g/L，pH7.3，在0.1～0.15mpa压力下，120～122℃灭菌20min。
实施例4 ARL-91发酵生产9α-OH-AD
(1)生产菌株为ARL-91，种子培养同实施例1；
(2)发酵培养：按15％的接种量接入发酵培养基，发酵培养基中投加有终浓度为8g/L的植物甾醇，在28～30℃，180r/min条件下发酵60h，发酵结束后9α-OH-AD的生成率可达93.5％。
所述发酵培养基组成如下：硫酸铵1.9g/L，尿素0.3g/L，磷酸二氢钠0.9g/L，磷酸氢二钠0.6g/L，吐温80 0.25g/L，甘油10g/L、植物甾醇8g/L、甲基-β-环糊精31.6g/L，pH7.3，在0.1～0.15mpa压力下，120～122℃灭菌20min。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
高产9α-OH-AD的偶发分枝杆菌及其应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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