专利摘要

本发明公开了一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物及其制备方法，步骤为：第一步，酶促聚合：将羟基酪醇溶解于乙酸‑乙酸钠缓冲液中，与漆酶溶液充分混合水浴反应；第二步，沉淀、离心：经过酶促聚合的液体，立即放入高温下使漆酶失活，并降温使聚合物沉淀，再离心获得粗制羟基酪醇聚合物；第三步，洗涤、真空干燥：将收集的粗制羟基酪醇聚合物，使用混合有机溶剂进行洗涤若干次，除去未反应的羟基酪醇和漆酶，并真空干燥除去溶剂获得最终的羟基酪醇聚合物。产物稳定性好，抗氧化性强，生产过程绿色环保。

权利要求

1.一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物，其特征在于，为以下两种结构式的混合物，

其中，n＝4～12。

2.一类权利要求1所述的高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法，其特征在于，步骤为：

第一步，酶促聚合：将羟基酪醇溶解于乙酸-乙酸钠缓冲液中，与漆酶溶液充分混合水浴反应；所述的漆酶是毛绒革盖菌产的漆酶；

第二步，沉淀、离心：经过酶促聚合的液体，立即放入高温下使漆酶失活，并降温使聚合物沉淀，再离心获得粗制羟基酪醇聚合物；

第三步，洗涤、真空干燥：将收集的粗制羟基酪醇聚合物，使用混合有机溶剂进行洗涤若干次，除去未反应的羟基酪醇和漆酶，并真空干燥除去溶剂获得最终的羟基酪醇聚合物。

3.如权利要求2所述的一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法，其特征在于，第一步中的乙酸-乙酸钠缓冲液为pH4～pH6，羟基酪醇的毫摩尔数m mol与漆酶酶活U比值范围为1:1～7000。

4.如权利要求2所述的一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法，其特征在于，第一步中的水浴的反应温度为35～100℃，反应时间1～5h。

5.如权利要求2所述的一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法，其特征在于，第二步中的高温为60～120℃。

6.如权利要求2所述的一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物制备方法，其特征在于，第二步中的降温指降至-4～4℃。

7.如权利要求2所述的一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法，其特征在于，第二步中的离心时间1～20min，离心转速300～8000r/min。

8.如权利要求2所述的一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法，其特征在于，第三步中的混合有机溶剂包括乙醇-水、乙酸乙酯-甲醇、氯仿-甲醇、氯仿-丙酮或丙酮-水中的任意一种。

9.如权利要求2所述的一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法，其特征在于，第三步中的混合有机溶剂间的比例为1～5:1～5。

10.如权利要求2所述的一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法，其特征在于，第三步中的真空干燥的温度为25～100℃，真空度为0.02～0.1Mpa。

说明书

技术领域

本发明涉及天然活性物的酶促氧化聚合技术领域，涉及的是一种抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法。

背景技术

羟基酪醇(3,4-二羟基苯乙醇)，是一种天然小分子酚类化合物，广泛存在于油橄榄果、叶、初榨橄榄油和尤其富含于油橄榄榨油厂的废水中。1950年在狭叶松果菊中以松果菊苷的形式被发现，具有抗氧化、抗炎、抗癌、保护心血管疾病和降血糖等活性功能。尤其被认为是最具有清除自由基的天然抗氧化剂之一，其自由基清除率是槲皮素的2倍，表儿茶酸的3倍之多，使其在保健品、药品和化妆品领域均有极为广泛的应用。然而，对羟基酪醇的应用研究发现，存在抗氧化性的热稳定性较低，常温存贮时容易发生氧化变质等问题。通常的解决办法是对羟基酪醇结构中羟基进行酯化或酰基化等改性，虽然提高了稳定性，但却降低了抗氧化性。如对羟基酪醇进行羟基醚化反应，结果证明羟基酪醇醚化产物的抗氧化性降低。

漆酶(p-diphenol:oxygen oxidoreductase EC1.10.3.2.)是一种含铜离子的多酚氧化酶，与植物抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同属于铜蓝蛋白家族。广泛存在于日本紫胶漆树(Rhus vernicifera)、白腐菌中。漆酶可催化多酚、甲基替代单酚、芳香胺、苯硫醇等易氧化的底物，具有作用底物广，专一性和稳定性高等特点。因1883年日本吉田首次从漆树的汁液—生漆中发现而得名，后来的研究证实漆酶也广泛分布于真菌和部分细菌之中。漆酶可催化氧化多酚物质，促进苯酚和二元胺的甲氧基取代；漆酶可催化底物氧化聚合或交联，利用这个反应可以使有毒的酚或芳胺生成低毒或无毒的产物除去。漆酶的应用范围非常广泛，在很多方面都显示出了很高的应用价值。很多研究表明，漆酶具有降解木素，可以与有毒的酚类物质作用，使苯氧基类除草剂、石油工业废水去除毒性，近年来在造纸、饮料加工、环保等方面得到广泛的应用。

发明内容

本发明提供了一种高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物及其制备方法，解决了羟基酪醇稳定性差，抗氧化性较弱，及酚类聚合反应中工业常使用的强酸、强碱作为催化剂，易造成工业设备的腐蚀和环境污染等问题，而利用生物酶进行酚类氧化聚合不仅有利于工厂的绿色生产，而且有利于提高羟基酪醇的应用范围。

本发明所采用的技术方案如下：一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物，为以下两种结构式的混合物

其中，n＝4～12。

一类所述的高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法，步骤为：

第一步，酶促聚合：将羟基酪醇溶解于乙酸-乙酸钠缓冲液中，与漆酶溶液充分混合水浴反应；

第二步，沉淀、离心：经过酶促聚合的液体，立即放入高温下使漆酶失活，并降温使聚合物沉淀，再离心获得粗制羟基酪醇聚合物；

第三步，洗涤、真空干燥：将收集的粗制羟基酪醇聚合物，使用混合有机溶剂进行洗涤若干次，除去未反应的羟基酪醇和漆酶，并真空干燥除去溶剂获得最终的羟基酪醇聚合物。

第一步中的乙酸-乙酸钠缓冲液为pH 4～pH 6，羟基酪醇的毫摩尔数m mol与漆酶酶活U比值范围为1:1～7000。

第一步中的水浴的反应温度为35～100℃，反应时间1～5h。

第二步中的高温为60～120℃。

第二步中的降温指降至-4～4℃。

第二步中的离心时间1～20min，离心转速300～8000r/min。

第三步中的混合有机溶剂包括乙醇-水、乙酸乙酯-甲醇、氯仿-甲醇、氯仿-丙酮或丙酮-水中的任意一种。

第三步中的混合有机溶剂间的比例为1～5:1～5。

第三步中的真空干燥的温度为25～100℃，真空度为0.02～0.1Mpa。

有益效果：

1、本发明采用在漆酶作用下，对油羟基酪醇进行酶促氧化聚合，不仅减少了强酸、强碱等催化剂的使用，而且生成的聚合具有更高的抗氧化性和热稳定性。清除DPPH自由基能力约是羟基酪醇的2.2倍，虽然峰值温度接近，但从最后的残余质量所占比例结果发现，热稳定性显著提高了51％，此外，较强酸、强碱催化剂，不仅绿色循环经济上表现更好，且专一性更强，获得的聚合产物较化学催化剂更集中。明显提高了羟基酪醇聚合物的生产效率。

2、减少了设备腐蚀维护，仅使用生物漆酶即可，获得得的羟基酪醇聚合物纯度更高。

3、在温和的温度及弱酸条件下，对羟基酪醇进行酶促聚合。

4、酶促聚合过程无需使用其他易腐蚀和易氧化硫酸、盐酸和对苯二甲酸等试剂，工艺方法重现性好，产品品质好，本发明工艺稳定，收率高，适合工业化生产。

5、本发明特别筛选后，使用的是毛绒革盖菌产的漆酶，反应时间短，反应活化能较低，催化活性更高，更有利于聚合度高的产物形成。

附图说明

图1为本发明的提供的工艺流程图。

图2羟基酪醇和羟基酪醇聚合物的Uv-Vis。

图3羟基酪醇和羟基酪醇聚合物的FT-IR。

图4羟基酪醇和羟基酪醇聚合物的DPPH自由基清除能力。

图5羟基酪醇和羟基酪醇聚合物的TG-DTG图。

具体实施方式

一种高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法：

一种高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物的制备方法，步骤为：

第一步，酶促聚合：称取适量羟基酪醇溶解于乙酸-乙酸钠缓冲液中，与适量的漆酶溶液，充分混合，置于烧瓶中并放入一定温度的水浴中，磁力搅拌数小时。

第二步，沉淀、离心：经过酶促反应的液体，立即放入高温下使漆酶失活，并置于冰箱一定温度下若干小时，使其聚合物沉淀。再在一定的转速和时间条件下，经过离心机离心获得粗制羟基酪醇聚合物。

第三步，洗涤、真空干燥：将收集的粗制羟基酪醇聚合物，使用一定比例的混合有机溶剂进行洗涤若干次，除去未反应的羟基酪醇和漆酶，并最终置于真空干燥箱中在一定的真空温度、真空度和时间条件下除去溶剂获得最终的羟基酪醇聚合物。

第一步所述的乙酸-乙酸钠缓冲液为pH 4～pH 6，羟基酪醇的毫摩尔数(m mol)与漆酶酶活(U)比值范围为1:1～1:1000。

第一步所述的所述的放入一定温度的水浴中的反应温度范围为10～100℃，磁力搅拌数小时的反应时间范围为1～10h。

第二步所述的立即放入高温下使漆酶失活中的温度范围为60～120℃。

第二步所述的置于冰箱一定温度下若干小时，其温度范围为-4～4℃，时间范围为12～72h。

第二步所述的离心时间1～20min，离心转速300～8000r/min。

第三步所述的混合有机溶剂为乙醇-水、乙酸乙酯-甲醇、氯仿-甲醇、氯仿-丙酮和丙酮-水中的一种。

第三步所述的混合有机溶剂间的比例为1:1、1:3、1:5、3:1和5:1中之一。

第三步所述的真空干燥条件中温度范围25～100℃，真空度范围0.02～0.1Mpa，时间范围12～96h。

本发明的漆酶购于sigma公司。

实施例1

配置1mM的羟基酪醇溶解于30mL乙酸缓冲液(0.05M，pH 4.7)。该酶促聚合反应初始添加漆酶溶液(1.0mg/mL，酶活300U)。将载有不同试剂的烧瓶置于35℃磁力搅拌反应3h，再在90℃下使漆酶失活。在酶促反应过程中，该反应的媒介颜色逐渐加深可用于指示聚合反应的大体进程，聚合反应结束后，将反应容器置于4℃冰箱20h，使其聚合产物沉淀。然后沉淀物通过转速3500r/min，离心6min获得，并用丙酮与去离子水(1:1,v/v)的混合溶剂洗涤若干次以去除未反应的羟基酪醇与漆酶。生成的聚合物置于温度范围60℃，真空度范围0.1Mpa，时间范围18h真空干燥箱中除去溶剂，再置于玻璃干燥器中备用。所获干燥的羟基酪醇聚合物质量0.86g。

实施例2

配置1.5mM的羟基酪醇溶解于50mL乙酸缓冲液(0.1M，pH 5)。该酶促聚合反应初始添加漆酶溶液(2.2mg/mL，酶活660U)。将载有不同试剂的烧瓶置于40℃磁力搅拌反应3.5h，再在90℃高温使漆酶失活。在酶促反应过程中，该反应的媒介颜色逐渐加深可用于指示聚合反应的大体进程，聚合反应结束后，将反应容器置于0℃冰箱16h，使其聚合产物沉淀。然后沉淀物通过转速4000r/min，离心15min获得，并用丙酮与氯仿(5:1,v/v)的混合溶剂洗涤若干次以去除未反应的羟基酪醇与漆酶。生成的聚合物置于温度范围50℃，真空度范围0.07Mpa，时间范围72h真空干燥箱中除去溶剂，再置于玻璃干燥器中备用。所获干燥的羟基酪醇聚合物质量0.93g。

实施例3

配置2.0mM的羟基酪醇溶解于50mL乙酸缓冲液(0.1M，pH 5)。该酶促聚合反应初始添加漆酶溶液(3.0mg/mL，酶活900U)。将载有不同试剂的烧瓶置于45℃磁力搅拌反应4h，再在100℃下使漆酶失活。在酶促反应过程中，该反应的媒介颜色逐渐加深可用于指示聚合反应的大体进程，聚合反应结束后，将反应容器置于-3℃冰箱22h，使其聚合产物沉淀。然后沉淀物通过转速3000r/min，离心10min获得，并用丙酮与去离子水(1:3,v/v)的混合溶剂洗涤若干次以去除未反应的羟基酪醇与漆酶。生成的聚合物置于温度60℃，真空度范围0.08Mpa，时间范围48h真空干燥箱中除去溶剂，再置于玻璃干燥器中备用。所获干燥的羟基酪醇聚合物质量1.36g。

实施例4

配置3.0mM的羟基酪醇溶解于50mL乙酸缓冲液(0.1M，pH 5)。该酶促聚合反应初始添加漆酶溶液(3.3mg/mL，酶活990U)。将载有不同试剂的烧瓶置于50℃磁力搅拌反应4.5h，再在100℃下使漆酶失活。在酶促反应过程中，该反应的媒介颜色逐渐加深可用于指示聚合反应的大体进程，聚合反应结束后，将反应容器置于-4℃冰箱20h，使其聚合产物沉淀。然后沉淀物通过转速7000r/min，离心20min获得，并用正丁醇与去离子水(3:1,v/v)的混合溶剂洗涤若干次以去除未反应的羟基酪醇与漆酶。生成的聚合物置于温度范围50℃，真空度范围0.09Mpa，时间范围24h真空干燥箱中除去溶剂，再置于玻璃干燥器中备用。所获干燥的羟基酪醇聚合物质量2.59g。

实施例5

配置3.5mM的羟基酪醇溶解于50mL乙酸缓冲液(0.1M，pH 5)。该酶促聚合反应初始添加漆酶溶液(1.5mg/mL，酶活450U)。将载有不同试剂的烧瓶置于55℃磁力搅拌反应5h，再高温使漆酶失活。在酶促反应过程中，该反应的媒介颜色逐渐加深可用于指示聚合反应的大体进程，聚合反应结束后，将反应容器置于0℃冰箱18h，使其聚合产物沉淀。然后沉淀物通过转速6000r/min，离心10min获得，并用丙酮与去离子水(1:3,v/v)的混合溶剂洗涤若干次以去除未反应的羟基酪醇与漆酶。生成的聚合物置于温度范围45℃，真空度范围0.06Mpa，时间范围18h真空干燥箱中除去溶剂，再置于玻璃干燥器中备用。所获干燥的羟基酪醇聚合物质量1.75g。

实施例6

配置4.0mM的羟基酪醇溶解于50mL乙酸缓冲液(0.1M，pH 5)。该酶促聚合反应初始添加漆酶溶液(1.3mg/mL，酶活390U)。将载有不同试剂的烧瓶置于50℃磁力搅拌反应5.5h，再高温使漆酶失活。在酶促反应过程中，该反应的媒介颜色逐渐加深可用于指示聚合反应的大体进程，聚合反应结束后，将反应容器置于-4℃冰箱24h，使其聚合产物沉淀。然后沉淀物通过转速5000r/min，离心15min获得，并用丙酮与去离子水(1:1,v/v)的混合溶剂洗涤若干次以去除未反应的羟基酪醇与漆酶。生成的聚合物置于温度范围35℃，真空度范围0.05Mpa，时间范围16h的真空干燥箱中除去溶剂，再置于玻璃干燥器中备用。所获干燥的羟基酪醇聚合物质量2.01g。

实施例7-对比例

配置3.5mM的羟基酪醇溶解于50mL乙酸缓冲液(0.1M，pH 5)。该酶促聚合反应初始添加辣根过氧化物酶溶液(2.0mg/mL，酶活800U)。将载有不同试剂的烧瓶置于50℃磁力搅拌反应4.5h，再高温使辣根过氧化物酶失活。在酶促反应过程中，该反应的媒介颜色逐渐加深可用于指示聚合反应的大体进程，聚合反应结束后，将反应容器置于-1℃冰箱22h，使其聚合产物沉淀。然后沉淀物通过转速7000r/min，离心15min获得，并用丙酮与去离子水(1:1,v/v)的混合溶剂洗涤若干次以去除未反应的羟基酪醇与辣根过氧化合物酶。生成的聚合物置于温度范围50℃，真空度范围0.08Mpa，时间范围20h真空干燥箱中除去溶剂，再置于玻璃干燥器中备用。所获干燥的羟基酪醇聚合物质量1.23g。且通过GPC测定得到的羟基酪醇聚合度n为2～6，该聚合物的DPPH自由基清除能力的IC₅₀为40.31×10^-3mg/mL，大于使用漆酶清除DPPH自由基能力的IC₅₀为25.06×10^-3mg/mL(见图4)，也即清除DPPH自由基能力小于。TG的峰值温度为310.5℃小于漆酶催化羟基酪醇聚合产物的峰值温度315℃，且其残渣所占比例35.68％远小于漆酶催化的羟基酪醇聚合产物66.09％(见图5)，说明辣根超氧化物酶也不如漆酶催化羟基酪醇的聚合产物的热稳定性高。

本发明采用在漆酶作用下，对油羟基酪醇进行酶促氧化聚合，不仅减少了强酸、强碱等催化剂的使用，而且生成的聚合具有更高的抗氧化性和热稳定性。由图4可以看出，清除DPPH自由基能力约是羟基酪醇的2.2倍。从附图5可以看出，虽然峰值温度接近，但从最后的残余质量所占比例结果发现，热稳定性显著提高了51％。

上述所有实施例一个漆酶活力单位(U)是指：在25℃条件下，1min氧化转化1μmol ABTS时所需的酶量。一个漆酶活力单位(U)是指在25℃条件下，在1min内能转化1μmol H₂O₂所需的酶量。

一类高抗氧化和热稳定性的羟基酪醇聚合物及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。