专利摘要
本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体涉及一种梨囊鞭菌及其发酵秸秆生产氢气的新方法和应用。本发明公开了一种梨囊鞭菌PiromycesCY1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCCNO.18141，还公开了梨囊鞭菌PiromycesCY1厌氧发酵秸秆生产氢气的方法及其在生物制氢中的应用。本发明所公开的梨囊鞭菌可以通过保藏在体外传代存活，发酵秸秆可产生大量高浓度氢气，且发酵工艺简单，对设备要求低，便于推广，在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景。
权利要求
1.一种梨囊鞭菌（
2.如权利要求1所述的梨囊鞭菌（
（1）梨囊鞭菌（
将梨囊鞭菌（
（2）厌氧发酵秸秆生产氢气
吸取步骤（1）制备的菌剂，按10% v/v接种量接入以1% w/v秸秆为底物的液体基本培养基中，加入复合抗生素厌氧培养；
所述的液体基本培养基配方为：酵母膏 1.0 g，蛋白胨 1.0 g，NaHCO
所述的盐溶液I包括 NaCl 6 g，(NH
3.如权利要求2所述的梨囊鞭菌（
4.如权利要求2所述的梨囊鞭菌（
5.如权利要求4所述的梨囊鞭菌（
6.如权利要求2所述的梨囊鞭菌（
7.如权利要求2所述的梨囊鞭菌（
8.如权利要求1所述的梨囊鞭菌（
说明书
技术领域
本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体涉及一种梨囊鞭菌及其发酵秸秆生产氢气的方法和应用。
背景技术
木质纤维素是秸秆的主要成分，木质纤维素的水解是整个厌氧消化中的限速步骤，也是整个技术的难点。木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维和木质素组成，木质素和半纤维素结合的共价键将纤维素分子包埋其中，木质素中醚键和碳-碳键形成的具有三维结构高分子芳香类化合物，这些强的键抑制水解酶的作用。因此，秸秆的厌氧发酵中需要对木质纤维素进行预处理。常见的预处理木质纤维素方法有机械法、热处理法、化学处理，这些都能有效促进厌氧消化，但这些预处理方法成本高，且不环保。普通微生物处理也存在较多缺陷，例如，单一微生物处理效果不好，人工构件的复合菌群效果也不理想，各菌种间存在相互拮抗的表现，导致预处理时间长，转化效率低，目前尚未有完备的方案进行秸秆的厌氧发酵生产氢气。
水稻是我国的主要粮食作物，播种面积广泛，每年伴随产生的秸秆数量也是非常巨大的。目前我国农村的大量玉水稻秸秆资源完全处于高消耗、高污染、低利用率、低产出状况，水稻秸秆作为能源物质没有得到合理开发利用。通过厌氧消化处理可将玉米秸秆进行资源再生，但现有的厌氧消化技术存在技术效率低，推广难度大的问题。
犏牛是牦牛与黄牛杂交的一代种。分为犏牛(公)和犏乳牛(母)具有明显杂交优势，肉、乳生产能力、役用能力接近于牦牛。用野血牦牛冻精对农区西门塔尔牛进行杂交，其杂交后代就是犏牛，由于犏牛中含有50％野牦牛血液，具有较高的青藏高原环境适应能力。犏牛瘤胃内栖息着独特的，复杂多样，大量的微生物群落协同代谢高效降解野牧草为牦牛提供生存能量和营养物质，长期的自然选择和进化使犏牛瘤胃成为一个高效木质纤维素降解酶系统，具有独特优势和高效的木质纤维素降解能力。
采用厌氧真菌处理秸秆，是一个较新也较为有效的手段，发明人博士期间研究了牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌的共培养物以及厌氧真菌纯培养物以玉米秸秆、水稻秸秆和小麦秸秆为底物进行厌氧发酵(魏亚琴.牦牛瘤胃厌氧真菌与甲烷菌共培养物的多样性及其纤维降解特性研究[D].2016.)，通过检测产气量、多糖水解酶活性、酯酶活性、干物质降解率、酚酸释放量、甲烷和乙酸产量来评估厌氧真菌和甲烷菌共培养物以及厌氧真菌纯培养物的降解秸秆的功效，并具体测定了降解秸秆所产氢气的气量，研究结果显示：高效降解三大秸秆的N属厌氧真菌纯培养物(N.frontalis)Yak16分别以三大秸秆为底物进行发酵，其中以玉米秸秆为底物，7天培养期内产氢气量达到最高为2.3mmol/g DM，高于以小麦秸秆和水稻秸秆为底物所产的氢气量；高效降解三大秸秆的P属厌氧真菌纯培养物PiromycesYak18以小麦秸秆为底物发酵，7天培养期内的产氢气量为0.7mmol/g DM，以玉米秸秆为底物发酵，7天培养期内的产氢气量为1.5mmol/gDM，而以水稻秸秆为底物进行发酵，7天培养期内的产氢气量仅为0.7mmol/gDM；现有文件中以秸秆为底物进行厌氧发酵，所产氢气的量低，无法满足生物制氢的广泛用途。
针对上述技术问题，本发明另辟蹊径，从犏牛瘤胃中分离梨囊鞭菌纯培养物，将其用于秸秆厌氧发酵，意外的得到了一种能够高效分解水稻秸秆并产生大量氢气的梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1。
发明内容
本发明公开了一种梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1，分离自青藏高原的甘肃省天祝县安远镇南泥湾村的乌鞘岭牧场的全放牧犏牛瘤胃内容物中，所述的梨囊鞭菌(Piromycessp.)CY1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.18141，保藏日期为2019年7月9日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还公开了梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1以秸秆为底物厌氧发酵生产氢气的方法，所述的方法具体包括如下步骤：
(1)梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1纯培养物菌剂的制备
将梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1纯培养物菌液以10％v/v接种量接种到液体基本培养基中，加入1％w/v干燥粉碎的秸秆作为底物，同时加入复合抗生素传代培养，置39℃厌氧培养72h即得到高活力菌剂。
(2)厌氧发酵秸秆生产氢气
吸取步骤(1)制备的菌剂，按10％v/v接种量接入以1％w/v秸秆为底物的与步骤(1)相同的液体基本培养基中，同时加入复合抗生素，39℃厌氧培养7天。
优选的，所述的液体基本培养基的配方为：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO37.0g，1.0g/L刃天青1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I 165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。
优选的，所述的盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O0.4g，MgSO4·2H2O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL。
优选的，所述的盐溶液II包括K2HPO4 4g，蒸馏水定容至1000mL。
优选的，所述的步骤(1)中加入的秸秆为小麦秸秆。
优选的，所述步骤(2)中加入的秸秆分别为小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆。
优选的，所述步骤(2)中加入的秸秆为水稻秸秆。
优选的，所述步骤(2)中加入秸秆底物后除氧，高温高压灭菌。
优选的，复合抗生素为青霉素、硫酸链霉素和氯霉素；在发酵过程中添加复合抗生素，可防止共培养物体系不受细菌和甲烷菌污染，提高厌氧发酵效率。
优选的，所述的青霉素和硫酸链霉素在液体基本培养基的终浓度分别为1600IU/mL和2000IU/mL，氯霉素在培养基的终浓度是50μg/mL。
所述的梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1在生物制氢中的应用。
本发明的有益效果是：①本发明所公开的梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1是发明人从犏牛瘤胃液中意外提取而得到的新菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.18141。②梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1发酵秸秆产氢气的量极高，最高达到4.3mmol/g DM，相较于现有技术获得了显著提高；③本发明中采用的梨囊鞭菌可以通过保藏在体外存活传代，发酵水稻秸秆可产生大量高浓度氢气，且发酵工艺简单，对设备要求低，便于推广，在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景；④通过天祝放牧犏牛瘤胃梨囊鞭菌厌氧发酵水稻秸秆可产生大量氢气，可进一步提高水稻秸秆的使用率，显著提高经济效益。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明所请求保护的技术方案进行说明，但本发明所请求保护的范围并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的厌氧培养基如下：
液体基本培养基的成分：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO3 7.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I 165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液II包括4g K2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。
分离纯化培养基：在液体基本培养基中添加1.0g/L葡萄糖，不加秸秆，然后除氧和灭菌。
琼脂滚管培养基：在液体基本培养基中添加1.0g/L葡萄糖和20g/L琼脂粉，然后除氧和灭菌。
秸秆培养基：在液体基本培养基中分别添加1％w/v的粉碎风干的小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆，不加葡萄糖，然后除氧和灭菌。
传代培养基：在液体基本培养基中添加1％w/v的粉碎风干的小麦秸秆，然后除氧和灭菌。
除氧方法：将液体培养基分装到亨氏厌氧管或厌氧瓶中，厌氧管或厌氧瓶通过针头接入带有真空泵和高纯CO2的抽气装置进行培养基除氧。首先真空泵抽出管中气体达到负压时培养基颜色改变，然后充入高纯CO2。每管抽气充气3次，其中第1次约15min，其余二次每次5min，最后1次充气后用无菌株针再放气使得厌氧管内外压平衡，并于121℃高温高压湿热灭菌20min后备用。实施例一、梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1的提取分离
1.犏牛瘤胃液的采集
放牧犏牛在牧场自由采食后我们开始采集瘤胃液，用不锈钢胃管一头通过金属开口器插入犏牛的瘤胃内部，另一头接抽空气设备抽吸出胃管内空气形成负压后瘤胃食糜液从不锈钢胃管中流出，迅速用无菌注射器吸取1mL瘤胃食糜液迅速接种到以0.1g小麦秸秆为底物，包括9mL梨囊鞭菌液体基本培养基的厌氧管中，约接种10支厌氧管并置39℃恒温培养，用于下一步分离纯化梨囊鞭菌。
2.梨囊鞭菌的分离纯化
用无菌注射器吸取1mL牦牛瘤胃食糜样品，接种到39℃预热的以小麦秸秆为底物的9mL液体基本培养基中，即制成10
3.梨囊鞭菌总DNA的提取
采用液氮研磨菌体后使用天根植物基因组试剂盒(天根生化科技，北京)提取梨囊鞭菌总DNA。
(1)10m L梨囊鞭菌纯培养物菌液接种到90m L，无秸秆，添加0.1％w/v葡萄糖的液体培养基中培养4-5天后将菌液移到离心管后12000×g离心5min，弃上清，收集菌体沉淀转入研钵，加入液氮将菌体快速充分研磨成粉末。
(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％w/v，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品。
(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000×g离心5min。
(4)将上一步所得水层相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。
(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000×g离心30s，弃掉废液。(吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。
(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前检查是否已加入无水乙醇)，10000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)重复操作步骤(7)。
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000×g离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000×g离心2min，将溶液收集到离心管中。
(11)将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000×g离心2min。
(12)DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
4.梨囊鞭菌ITS1序列的PCR扩增
利用梨囊鞭菌ITS1专用引物Neo18S For(5’-AAT CCT TCG GAT TGG CT-3’)和Neo5.8S Rev(5’-CGA GAA CCA AGA GAT CCA-3’)扩增梨囊鞭菌的ITS1全序列。使用MyCycler PCR仪(Bio-rad，美国)进行扩增，PCR反应缓冲液(总体积10μL)包括40m MTricine-KOH(pH 8.0),16mM KCI，3.5mM MgCl2，100μg/m L牛血清白蛋白，800μM dNTP，500nM上下游引物，0.2μL 50×TITANIUM Taq酶和模板DNA大约50ng。PCR反应条件是：95℃5min，然后10个循环95℃30s，68℃30s(每个循环降1℃)和72℃30s，然后25个循环95℃30s，58℃30s和72℃30s，最后72℃延伸6min。没有模板的PCR反应体系作为空白对照。
5.梨囊鞭菌的鉴定结果
梨囊鞭菌的形态特征如下所述：梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1是单中心生长类型，内生型的椭球型孢子囊(50×100μm)，菌丝弯曲，菌丝高度分支无隔，单鞭毛游动孢子。形态学初步鉴定为Piromyces sp.属菌株。
实施例二、梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1发酵秸秆生产氢气的方法
1.梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1菌剂的制备：
吸取1mL梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1培养物接种到20mL体积的亨氏厌氧管中以风干粉碎的0.1g小麦秸秆为底物的9mL液体基本培养基中，同时加入复合抗生素，使青霉素和硫酸链霉素在液体基本培养基的终浓度分别为1600IU/mL和2000IU/mL，氯霉素在培养基中的终浓度为50μg/mL。39℃厌氧培养72h，即达到生长高峰，此时发酵液为高活力菌剂。
2.发酵秸秆生产氢气的方法
在100mL体积厌氧发酵瓶中盛90mL液体基本培养基，分别以1.0g粉碎风干后的玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆为底物。除氧。灭菌。把传代培养72h的梨囊鞭菌(Piromycessp.)CY1用无菌注射器吸取10mL分别接种到上述加有玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆的液体基本培养基中，同时加入复合抗生素，使其在液体基本培养基溶液的终浓度为青霉素1600IU/mL，硫酸链霉素2000IU/mL，氯霉素在培养基中的终浓度为50μg/mL，39℃厌氧培养7天。共设置3个平行实验，隔24h测定发酵液中的氢气产量。
3.发酵产生氢气的测定方法
使用气相色谱仪检测氢气。气相色谱仪型号是GC522，伍丰仪器，中国，配置有GPS101柱(2m×3mm)，配置上海精科GC112A-TCD热导池检测器，检测条件是：汽化室250℃，柱温100℃，检测器温度150℃，载气为氮气，进样量10μL。
实验结果显示，梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1高效降解水稻秸秆的同时产生大量氢气，产氢气量最高达到4.3mmol/g DM，显著高于现有技术所报道的梨囊鞭菌降解各种秸秆所产氢气的产量，也高于梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1降解玉米秸秆和水稻秸秆所产氢气的产量。具体结果如下表：
表1 7天培养期内梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1发酵小麦秸秆、水稻秸秆和玉米秸秆的氢气产量
通过以上实施例我们可以看到，犏牛瘤胃梨囊鞭菌(Piromyces sp.)CY1降解水稻秸秆的同时产生大量氢气，明显优于现有技术公开的微生物发酵产生氢气的产量，在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景。
序列表
<110> 甘肃省科学院生物研究所
<120> 一种厌氧真菌及其发酵秸秆生产氢气的新方法和应用
<141> 2019-07-11
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 372
<212> DNA
<213> piromyces CY1
<400> 1
ccaccgattg tttggcttag tgaatccttc ggattggcta tttttttctg gcaacagaat 60
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一种梨囊鞭菌及其发酵秸秆生产氢气的方法和应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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