专利摘要
本发明提供一种基于亚甲基蓝琼脂糖法分离芸薹根肿菌单孢的方法。包括以下步骤：首先制备浓度为5×103个孢子·mL‑1的芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液；将0.01％亚甲基蓝染色液加入1.3％琼脂糖溶液，制备亚甲基蓝琼脂糖载玻片凝层；取2μL芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液均匀涂布于凝层表面，在显微镜下观察，确定视野下只有一个孢子时，分离含有单孢的凝层，倒扣于十字花科幼苗根毛处，培育得到芸薹根肿菌单孢系。本发明利用亚甲基蓝琼脂糖法进行芸薹根肿菌单孢分离，背景呈轻微蓝色，且无杂质和气泡，能清晰区分芸薹根肿菌单孢。此方法过程简单、易操作，大大提高了芸薹根肿菌单孢分离效率和准确率。
权利要求
1.一种基于亚甲基蓝染色液结合琼脂糖法的芸薹根肿菌单孢分离方法，包括如下步骤：
1)将十字花科根肿病发病组织打成匀浆，过滤，弃沉淀，制备芸薹根肿菌孢子悬浮液；
2)配制质量体积百分浓度为1.3％-1.5％的琼脂糖溶液，并灭菌；
配制质量体积百分浓度为0.005％-0.01％的亚甲基蓝染色液；
将所述亚甲基蓝染色液与灭菌后的所述琼脂糖溶液按照体积比100μL：30mL的比例混合混匀，得到亚甲基蓝染色液琼脂糖溶液；
3)取洁净的载玻片，在步骤2)所述亚甲基蓝染色液琼脂糖溶液中蘸一下，使载玻片表面形成凝层；
4)将步骤1)所述的芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液均匀涂布于亚甲基蓝染色液琼脂糖凝层表面，在显微镜下观察，确定视野下只有一个孢子时，分离含有该芸薹根肿菌单孢的亚甲基蓝染色液琼脂糖凝层，倒扣于十字花科植物的幼苗根毛处，培育得到芸薹根肿菌单孢系。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述过滤的方式为采用八层纱布过滤。
3.根据权利要求1或2所述的分离方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液中孢子的浓度为5×10
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述芸薹根肿菌孢子悬浮液在使用前放置在4℃～8℃保存。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述琼脂糖溶液和亚甲基蓝染色液中的溶剂均为无菌水；所述灭菌的条件为：121℃灭菌20min。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述步骤2)中，将灭菌后的所述琼脂糖溶液熔化并冷至50℃-60℃，然后加入所述亚甲基蓝染色液。
7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述显微镜的放大倍数为400倍。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述分离含有该芸薹根肿菌单孢的亚甲基蓝染色液琼脂糖凝层的方式为：用手术刀切取约1mm
9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述十字花科植物为大白菜。
10.根据权利要求9所述的分离方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述培育的条件为：温度25℃、湿度80％、暗培养24h。
说明书
技术领域
本发明属于涉及单孢分离领域，具体涉及一种基于亚甲基蓝染色液结合琼脂糖法的芸薹根肿菌单孢分离方法。
背景技术
十字花科根肿病(Clubroot disease)是由芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae Woron.)侵染引起的一种专性寄生的世界性病害，素有“十字花科癌症”之称，任何十字花科植物的感病品种都能被侵染，引起薄壁细胞的异常分裂增大，形成瘤状肿根。根肿菌休眠孢子在无感病寄主植物的土壤中存活可达20年之久，土壤一旦污染，将不再适宜十字花科植物的栽培。近年来，根肿病在我国各地区迅速蔓延，其中西南、东北、华东等地区成为根肿病的重灾区。据《中国农业年鉴》统计，由根肿病危害造成的十字花科作物经济损失超过40亿元，在产业链的前、中、后连带影响，造成经济损失超过100亿元。
选用抗病品种是防治十字花科根肿病的有效途径。由于芸薹根肿菌种下存在生理小种，生产中经常出现十字花科寄主品种对病原菌某个或少数生理小种免疫或高抗，而对另一些生理小种则高度感染的现象。由于抗病性是针对某个或某些生理小种的，生产上大面积单一地推广具有该类抗性的品种时，容易导致侵染它的生理小种上升为优势小种而被感染、淘汰，因而抗病性不能稳定和持久。获得纯化的芸薹根肿菌单孢系是开展生理小种鉴定、病原菌遗传变异，以及稳定、持久抗病育种等许多研究工作的基础。
芸薹根肿菌属于严格的专性寄生菌，不能进行人工分离培养，只能从活体宿主植株中吸收营养而繁殖，离开宿主生物就不能继续生存，因此很难分离获得纯菌株单孢系。
目前国内外根肿菌单孢分离的方法主要有以下四种：
第一种方法是水琼脂块法分离根肿菌单孢子，将孢悬液滴于含有水琼脂块的载玻片上，在光学显微镜物镜转换器上安置微型打孔器准确切取一个孢子放于寄主根部。这种方法存在以下问题：水琼脂块制备过程中易产生气泡，而且含有杂质较多，而芸薹根肿菌休眠孢子无色、非常小，单孢大小4.6～6.0×1.6～4.6μm，水琼脂块在显微镜下观察很难区分孢子、气泡或杂质，往往不能准确判断是否含有芸薹根肿菌单孢，导致切取的单孢目标块不含或含有多个芸薹根肿菌单孢。
第二种方法是微管法(李茜等，2012，芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)单孢分离接种及生理小种的鉴定.植物保护，2012，38(3):95-101)，借助微管在水琼脂块上准确吸取一个孢子放于寄主根部。该方法除存在水琼脂块气泡和杂质多，不易区分芸薹根肿菌单孢的问题外，还存在利用微管反复吸取悬浮液时易出现孢子沾在微管壁上导致使观察不到的问题，该方法效率较低。
第三种方法是冷冻盒接菌法(刘一凡等，2017，芸薹根肿菌单孢分离技术体系构建及沈阳地区根肿菌的鉴定.园艺学报，2017，44(12):2383-2390)，借助针灸针在水琼脂块上准确挑取一个孢子准确放于寄主根部，培养于81孔冷冻盒。该方法也是在传统水琼脂块上在光学显微镜下利用针灸针挑取一个单孢，同样存在挑取目标孢子可能是气泡或杂质的问题，此外在挑取过程中针灸针会使孢子壁破碎，直接导致孢子死亡，影响发病率，同时该方法在挑取单孢时耗时较久。
第四种方法是通过稀释芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液，使悬浮液达到1μL含有一个休眠孢子的浓度，然后用移液枪在载玻片上进行反复观察，确定只有一个孢子后进行接种。该方法由于休眠孢子悬液中孢子分布不均匀，可能接种的单孢悬浮液不含有孢子或不是单孢。
以上4种现有技术均存在琼脂块中存在气泡或杂质，孢子与背景差异不明显、不易区分单孢等问题，导致挑取单孢耗时、费力，成功率较低。
发明内容
为解决现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种基于亚甲基蓝染色液与琼脂糖法相结合的芸薹根肿菌单孢分离方法。用琼脂糖法替代水琼脂法，能有效避免水琼脂中有气泡或杂质干扰的问题；在琼脂糖中加入亚甲基蓝染色液，琼脂糖背景呈现轻微蓝色，而芸薹根肿菌休眠孢子无色，更易于区分单孢和琼脂糖背景，解决了芸薹根肿菌单孢目标模糊、不易挑取等缺点。本发明操作简单，能大大提高挑取单孢的准确性，提高了接种后获得单孢系的可能性。
本发明所提供的基于亚甲基蓝染色液结合琼脂糖法的芸薹根肿菌单孢分离方法，包括：制备芸薹根肿菌孢子悬浮液、制备亚甲基蓝琼脂糖溶液、制备亚甲基蓝琼脂糖载玻片凝层、挑取芸薹根肿菌单孢。
具体包括如下步骤：
1)将十字花科根肿病发病组织打成匀浆，过滤，弃沉淀，制备浓度为5×10
2)配制质量体积百分浓度为1.3％-1.5％的琼脂糖溶液，并灭菌；配制质量体积百分浓度为0.005％-0.01％的亚甲基蓝染色液；
将所述亚甲基蓝染色液与灭菌后的所述琼脂糖溶液按照体积比100μL：30mL的比例混合混匀，得到亚甲基蓝染色液琼脂糖溶液；
3)取洁净的载玻片，在步骤2)所述亚甲基蓝染色液琼脂糖溶液中蘸一下，使载玻片表面形成凝层；
4)将步骤1)所述的芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液均匀涂布于亚甲基蓝染色液琼脂糖凝层表面，在显微镜下观察，确定视野下只有一个孢子时，分离含有该芸薹根肿菌单孢的亚甲基蓝染色液琼脂糖凝层，倒扣于十字花科植物的幼苗根毛处，培育得到芸薹根肿菌单孢系。
上述方法步骤1)与2)-3)之间无先后顺序，亦可同时进行。
上述方法步骤1)中，所述过滤的方式为采用八层纱布过滤。
上述方法步骤2)中，所述琼脂糖溶液和亚甲基蓝染色液中的溶剂均为无菌水；所述灭菌的条件为：121℃灭菌20min。
上述方法步骤2)中，将灭菌后的所述琼脂糖溶液熔化并冷至50℃-60℃，然后加入所述亚甲基蓝染色液加入所述灭菌后的琼脂糖溶液中。
上述方法步骤4)中，所述的芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液的用量为1μL～5μL。
上述方法步骤4)中，所述显微镜的最大放大倍数不低于1000倍，具体为400倍。
所述分离含有该芸薹根肿菌单孢的亚甲基蓝染色液琼脂糖凝层的方式为：用手术刀切取约1mm
上述方法步骤4)中，所述十字花科植物具体可为菊心大白菜(购于中蔬种业科技(北京)有限公司)。所述培育的条件为：温度25℃、湿度80％、暗培养24h。
本发明利用亚甲基蓝对琼脂糖进行染色处理后，琼脂糖凝层背景呈现轻微蓝色，而对芸薹根肿菌休眠孢子活力无影响，因此能更清晰地判断芸薹根肿菌单孢，突破性地解决了传统水琼脂法背景含杂质和气泡较多，不易区分芸薹根肿菌单孢等问题，大大提高了获取根肿菌单孢的速度及准确率，提高了获取单孢系的效率。
附图说明
图1为不同单孢分离方法制备的芸薹根肿菌大量孢子和单孢照片；其中A，B分别为亚甲基蓝琼脂糖法芸薹根肿菌大量孢子和单孢照片，亚甲基蓝琼脂糖背景呈轻微蓝色，且无杂质和气泡，易于区分芸薹根肿菌单孢；C，D分别为传统水琼脂法芸薹根肿菌大量孢子和单孢照片，水琼脂块背景含杂质和气泡较多，不易区分芸薹根肿菌单孢。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供的一种基于亚甲基蓝染色液结合琼脂糖法分离芸薹根肿菌单孢的方法，包括芸薹根肿菌的处理肿根、配制孢悬液、获取单孢子及单孢接种等过程。本发明的方法是1)将十字花科根肿病发病组织打成匀浆，八层纱布过滤，弃沉淀，制备浓度为5×10
本试验以菊心大白菜(购于中蔬种业科技(北京)有限公司)为试验材料，采用传统琼脂块法和染色液琼脂糖法两种方法各接种600株大白菜幼苗，共计3次重复。接种45d左右进行调查，结果表明：采用染色液琼脂糖法挑取根肿菌单孢子不仅大大提高了接种后植株的成活率，还提高了接种后的单孢发病率，相比较发病率提高了16.71％。
实施例1、琼脂糖最佳浓度的筛选
将灭菌的载玻片在不同浓度琼脂糖溶液中蘸一下，使载玻片表面形成凝层。然后取5μL稀释好的休眠孢子悬浮液滴于琼脂糖凝层表面。在显微镜下观察，用手术刀切取约1mm2含有单孢的染色液的琼脂糖凝层。筛选出最佳琼脂块浓度。将琼脂糖溶液浓度设1％、1.2％、1.3％、1.5％、1.8％、2％、2.5％和3％共8个处理，分析不同浓度下琼脂糖凝层的透明度、质地硬度、以及单孢挑取的难易程度。
表1不同浓度琼脂糖结果分析表
结果显示当浓度为1.3％时，琼脂糖凝层透明度较好、质地适中、易挑取，最适合进行芸薹根肿菌单孢分离，详细结果描述见表1。
实施例2、最佳染色剂及染色液浓度的筛选
染色液的配置：分别称取0.05g酸性品红、0.01g刚果红、0.01g伊红Y纳、0.05g中性红、0.01g番红、0.005g亚甲基蓝、0.01g亚甲基蓝、0.02g亚甲基蓝、0.03g亚甲基蓝、0.04g亚甲基蓝、0.02g溴酚蓝、0.01g甲基绿，加入100mL无菌水。配制成质量体积百分浓度分别为0.05％酸性品红、0.01％刚果红、0.01％伊红Y纳、0.05％中性红、0.01％番红、0.005％亚甲基蓝、0.01％亚甲基蓝、0.02％亚甲基蓝、0.03％亚甲基蓝、0.04％亚甲基蓝、0.02％溴酚蓝和0.01％甲基绿的染色液，置棕色瓶4℃保存备用。
染色液琼脂糖凝层制备：取上述12种不同染色液各50μL，加入15mL熔化并冷至50℃左右的1.3％琼脂糖溶液中，置于无菌培养皿中凝固，制备染色液琼脂糖凝层。
染色液琼脂糖凝层对芸薹根肿菌孢子活力的影响：采用Hochest 33342-PI双荧光复染法，检测不同染色液处理对芸薹根肿菌休眠孢子活力的影响。将浓度1×10
表2不同染色剂对芸薹根肿菌休眠孢子活力影响
表3不同浓度亚甲基蓝染色液对芸薹根肿菌休眠孢子活力影响
如表2、表3所示：不同染色液对芸薹根肿菌休眠孢子活力有一定的影响。其中亚甲基蓝染色液对根肿菌休眠孢子活力影响最小，以无菌水为溶剂的0.01％亚甲基蓝染色液处理休眠孢子存活率为97％，以PBS缓冲液为溶剂的0.01％亚甲基蓝染色液处理休眠孢子存活率为95％，与对照不加染色剂的处理孢子存活率98％差异不显著。在一定范围内，随着以无菌水为溶剂亚甲基蓝染色液浓度的增加，经处理后休眠孢子的成活率下降。酸性品红、溴酚蓝、甲基绿等，对芸薹根肿菌孢子活力都有一定的影响，休眠孢子存活率在61％～87％之间。此外，将芸薹根肿菌置于亚甲基蓝染色液琼脂糖凝层处理后，在光学显微镜下观察，琼脂糖背景和芸薹肿根残留组织菌被染为淡蓝色，而有活力的根肿菌孢子不被染色，因此便于区分芸薹根肿菌单孢。综上所述，亚甲基蓝染色液对芸薹根肿菌孢子活力无影响，可用于单孢分离是琼脂糖凝层背景的染色(见图1)。
实施例3、亚甲基蓝琼脂糖块法与传统水琼脂法单孢分离效果的比较
采用本发明建立的亚甲基蓝琼脂糖块法与已报道的水琼脂法(背景技术中提及的方法一)进行芸薹根肿菌单孢接菌，比较根肿菌单孢分离结果。对催芽24h的菊心大白菜(购于中蔬种业科技(北京)有限公司)幼苗利用2种不同的方法接种处理后，移植到直径5cm×5cm无菌育苗盘，置于温室中培养。各处理200株，3次重复。置于温室环境中，保持日温20～25℃、夜温11～16℃、光照16h·d
表4水琼脂块法接种与亚甲基蓝琼脂糖块法接种调查数据统计
结果如表4所示：同等栽培条件下，采用相同的菌株和接种寄主材料，比较传统水琼脂块法和亚甲基蓝琼脂糖块法接种单孢后大白菜的发病情况，即获得芸薹根肿菌单孢株系情况。通过试验结果对比，传统琼脂糖法单孢发病率为0.74％，共获得单孢株系3株；而本发明所用的染色液琼脂糖块法的发病率为17.45％，共获得单孢株系85株，远远高于传统水琼脂块法的寄主发病率和单孢株系获得概率。结果表明本发明基于亚甲基蓝琼脂糖块法的芸薹根肿菌单孢分离方法，大大提高了接种寄主大白菜的发病率和芸薹根肿菌单孢获得概率，该方法是可靠、可行的。
采用本发明的方法适于挑取芸薹根肿菌单孢子，用琼脂糖代替水琼脂，无杂质；加入染色液后，能更块、更准确地观察到单孢；且染色液对孢子活力无影响。可以从根本上解决不易分离芸薹根肿菌单孢的操作问题及接种后大白菜不易成活的问题。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性活动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
一种基于亚甲基蓝琼脂糖法分离芸薹根肿菌单孢的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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