专利摘要

本发明涉及生物农药技术领域，具体涉及一种深绿木霉HB20111在防治小麦茎基腐病和纹枯病上的应用，所述深绿木霉HB20111已于2018年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16963。本发明属于绿色生物农药范畴，它的使用可以相应减少化学农药使用，降低农产品农药残留，对改善农产品品质具有重要的意义，适合用于无公害绿色农产品的生产应用。

权利要求

1.一种深绿木霉HB20111的应用，其特征在于，所述应用为防治小麦茎基腐病和纹枯病，所述深绿木霉HB20111的分类命名为深绿木霉Trichoderma atroviride，于2018年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 16963。

2.如权利要求1所述的一种深绿木霉HB20111的应用，其特征在于，所述深绿木霉HB20111通过对小麦拌种防治土传真菌病害。

3.如权利要求2所述的一种深绿木霉HB20111的应用，其特征在于，所述应用为采用含有HB20111的生物拌种剂对小麦进行拌种。

4.如权利要求3所述的一种深绿木霉HB20111的应用，其特征在于，所述生物拌种剂的制备方法包括以下步骤：

使用载体对深绿木霉HB20111孢子悬液进行吸附，形成固体菌剂，加入质量分数1%-8%羧甲基纤维素钠和质量分数1%-5%海藻酸钠后用搅拌机混匀，调整菌数不低于2.0×108cfu/g，在流化床中50℃干燥至水份含量10%以下。

5.如权利要求4所述的一种深绿木霉HB20111的应用，其特征在于，所述载体包括硅藻土、麦饭石或草炭土。

6.如权利要求4所述的一种深绿木霉HB20111的应用，其特征在于，所述深绿木霉HB20111孢子悬液的制备方法包括以下步骤：

①固体一级种子制备：采用PDA培养基，将深绿木霉HB20111试管菌种接种在试管培养基中，28℃培养，4℃冰箱保存，要求菌丝与分生孢子丰满，无杂菌；然后接种茄形瓶，采用PDA培养基，28℃培养，菌龄5-10天，要求菌落表面无液态水，菌丝与分生孢子丰满，无杂菌污染；

②液体种子制备：使用115℃灭菌30分钟的1%的葡萄糖水冲洗茄瓶表面，将新鲜孢子洗下后稀释至1×106-1×107孢子/mL作为固体接种的液体种子；

③接种固体培养基：固体培养基的组成包括麦粒和稻壳，所述麦粒和稻壳的质量比为49：5，固体培养基的含水量为70%，FeSO4为100ppm，121℃灭菌40分钟后以循环水冷却，接种量为2%-5%，在混合接种器内将液体种子和固体培养基混合均匀，转移到固体培养室内培养96-120h；

④制备孢子悬液：将发酵好的固体发酵培养基按培养基与水质量比1：1的比例浸润至水中，搅拌使固料中的分生孢子分散至水中，过滤去除固体发酵原料，获得孢子悬液，调整浓度至5.0×109孢子/mL。

7.如权利要求6所述的一种深绿木霉HB20111的应用，其特征在于，所述步骤③的培养条件为：

1）菌丝生长阶段：固体培养基厚度控制在5cm以下，料温控制在30±2℃，室温控制在25-30℃，空气的相对含水量控制在95-100%，固体发酵室内配备新风系统，采用室内CO2浓度反馈调节，培养室的面积根据产能确定；

2)孢子产生阶段：料温控制在30±2℃，培养基表面不能有液态水，空气的相对湿度不低于90%，定时取样计算分生孢子数，当每克固体发酵物中分生孢子数达到5×109时即可收获。

说明书

技术领域

本发明涉及生物农药技术领域，具体涉及一种深绿木霉HB20111在防治小麦茎基腐病和纹枯病上的应用。

背景技术

小麦是世界上种植最广泛的谷物之一，也是我国重要的粮食经济作物之一，根据国家统计局数据报道，2018我国小麦种植面积为小麦种植面积2427万公顷，小麦产量13143万吨。然而，随着小麦生产水平的提高，化肥施用量大幅度增加，有机肥施用量的大量减少，造成土壤生态恶化，土传病害持续发生；此外，长年连作和秸秆还田面积扩大，也造成了土壤中病原菌源逐年积累，加之生产中缺乏优良抗性品种，导致近年来我国小麦产区土传病害呈现不断加重和蔓延趋势。其中小麦茎基腐病和纹枯病是两种主要的小麦病害。

小麦茎基腐病是一种以镰孢菌为主多种病原菌复合侵染性土传病害，该病是一种世界性的重要病害，已有10多个国家报道其发生。在我国是近几年快速增长的一种小麦病害，目前主要发生在玉米小麦两熟轮作、秙杆还田较多的河南、河北、山东、安徽、江苏等地。2012 年河南省率先报道茎基腐病，2016年该病在全国多个省份大发生，对小麦生产造成了严重的威胁。近两年，该病已经上升为山东、河南等我国小麦重要产区生产上的主要病害，严重地块该病导致的白穗率达50％以上。小麦茎基腐病菌侵染后还会产生真菌毒素，影响粮食品质。此外，有报道显示，使用引起小麦茎基腐病的病原菌禾谷镰刀菌菌悬液对小麦穗部进行接种及再分离鉴定，验证了小麦茎基腐禾谷镰刀菌可引起小麦赤霉病。小麦纹枯病也是一种以土壤传播为主的真菌病害。随着种植制度的改革，高产品种的推广和水、肥、密度的增加，危害日趋严重，而土壤中的菌丝和菌核则是纹枯病的主要侵染来源。上述这些由真菌病原体引起的小麦病害已经成为影响我国小麦产量的重要因素。

在国内有研究报道，甲基托布津、多菌灵、嘧菌酯、戊唑醇、氟硅唑、丙环唑、灭菌唑、苯醚甲环唑、咯菌腈等杀菌剂对引起小麦茎基腐病的禾谷镰刀菌(F.graminearum)、引起小麦纹枯病的立枯丝核菌等病原菌均有一定的抑制作用。目前我国主要利用以上药剂拌种和后期喷雾防治上述小麦真菌病害，拌种处理时化学杀菌剂选择和使用不当，会对小麦生长发育产生药害，导致出苗推迟、出苗率低、畸形苗等。由于长期连续使用造成病原茵的抗药性，同时喷雾使用还会污染环境，对天敌有杀伤作用，对生态环境和小麦生产极易造成二次污染，不利于农业的可持续发展。

生物防治策略具有生物防治资源来源广泛、环境友好型等特点，各个国家和地区的学者及研究人员都在积极探索和评估生物防治方法在禾谷镰刀菌防治手段上的应用前景和潜在价值。如澳大利亚科学家研究发现，洋葱伯克氏菌对假禾谷镰刀菌引起的小麦茎基腐病具有一定的生防效果；Moya-Elazondo等(2016)研究发现，蕈状芽胞杆菌拌种处理，可以有效降低假禾谷镰刀菌引起的病害的发生；Lakhesar等(2010)发现，哈茨木霉结合适宜的N肥管理可以有效降低镰孢菌引起的病害的发生。国内研究报道，利用木霉菌处理小麦秸秆并掩埋，可以加速病菌的死亡，6个月后可将秸秆上面的假禾谷镰刀菌完全清除，而不处理的秸秆上仍有大量的病原菌存活。因此生物防治作为新型的小麦茎基腐病和纹枯病防治措施具有很好的生产应用价值。

发明内容

针对小麦病害目前主要采用化学杀菌剂进行防治，不能从根本上改善土传病害加重和蔓延趋势问题，且对环境和食品存在安全隐患的现状，本发明提供一种深绿木霉HB20111在防治小麦茎基腐病和纹枯病上的应用。

一种深绿木霉HB20111在防治小麦茎基腐病和纹枯病上的应用，所述深绿木霉HB20111 (Trichoderma atroviride)，于2018年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.16963。

进一步的，所述深绿木霉HB20111通过对小麦拌种防治土传真菌病害。

进一步的，所述应用为采用含有HB20111的生物拌种剂对小麦进行拌种。

进一步的，所述生物拌种剂的制备方法包括以下步骤：

使用载体对深绿木霉HB20111孢子悬液进行吸附，形成固体菌剂，加入质量分数1％-8％羧甲基纤维素钠和质量份数1％-5％海藻酸钠后用搅拌机混匀，调整菌数不低于2.0×10⁸cfu/g，在流化床中50℃干燥至水份含量10％以下。

进一步的，所述载体包括硅藻土、麦饭石或草炭土。

进一步的，所述深绿木霉HB20111孢子悬液的制备方法包括以下步骤：

①固体一级种子制备：采用PDA培养基，将深绿木霉HB20111试管菌种接种在试管培养基中，28℃培养，4℃冰箱保存，要求菌丝与分生孢子丰满，无杂菌；然后接种茄形瓶，采用PDA培养基，28℃培养，菌龄5-10天，要求菌落表面无液态水，菌丝与分生孢子丰满，无杂菌污染；

②液体种子制备：使用115℃灭菌30分钟的1％的葡萄糖水冲洗茄瓶表面，将新鲜孢子洗下后稀释至1×10⁶-1×10⁷孢子/mL作为固体接种的液体种子；

③接种固体培养基：固体培养基的组成包括麦粒和稻壳，所述麦粒和稻壳的质量比为49： 5，固体培养基的含水量为70％(其中包括液体种子中的水分)，FeSO₄为100ppm，121℃灭菌40分钟后以循环水冷却，接种量为2％-5％，在混合接种器内将液体种子和固体培养基混合均匀，转移到固体培养室内培养96-120h；

④制备孢子悬液：将发酵好的固体发酵培养基按培养基与水质量比1：1的比例浸润至水中，搅拌使固料中的分生孢子分散至水中，过滤去除固体发酵原料，获得孢子悬液，调整浓度至5.0×10⁹个/mL。

进一步的，所述步骤③的培养条件为：

1)菌丝生长阶段：固体培养基厚度控制在5cm以下，料温控制在30±2℃，室温控制在 25-30℃，空气的相对含水量控制在95-100％，固体发酵室内配备新风系统，采用室内CO₂浓度反馈调节，培养室的面积根据产能确定；

2)孢子产生阶段：料温控制在30±2℃，培养基表面不能有液态水，空气的相对湿度不能低于90％，定时取样计算分生孢子数，当每克固体发酵物(干燥后)中分生孢子数达到5×10⁹时即可收获。

本发明的有益效果在于，

深绿木霉HB20111具有促进植物生长作用，使用含有深绿木霉HB20111的生物拌种剂对小麦纹枯病和小麦茎基腐病均有明显防治效果，使菌剂中的活性成分——生防木霉菌在小麦从萌芽开始就能在根际保持适当的菌群丰度，从而为小麦根际构筑起一道防止土传病原真菌外源侵入的防护网；本发明属于绿色生物农药范畴，它的使用可以相应减少化学农药使用，降低农产品农药残留，对改善农产品品质具有重要的意义，适合用于无公害绿色农产品的生产应用。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1深绿木霉HB20111高浓度孢子悬液的制备

深绿木霉HB20111采用固体发酵法大量获得，具体制备方法包括以下步骤：

①固体一级种子制备：采用PDA培养基，将深绿木霉HB20111试管菌种接种在试管培养基中，28℃培养，4℃冰箱保存，要求菌丝与分生孢子丰满，无杂菌；然后接种茄形瓶，采用PDA培养基，28℃培养，菌龄8天，要求菌落表面无液态水，菌丝与分生孢子丰满，无杂菌污染；

②液体种子制备：使用115℃灭菌30分钟的1％的葡萄糖水冲洗茄瓶表面，将新鲜孢子洗下后稀释至5×10⁶孢子/mL作为固体接种的液体种子；

③接种固体培养基：麦粒：稻壳(W/W)＝49：5，含水量为70％(其中包括接种的液体发酵液的水分)，FeSO₄为100ppm，121℃灭菌40分钟后以循环水冷却，接种量为3％，在混合接种器内将发酵液和培养基混合均匀，转移到固体培养室内培养108h；

培养条件为：

1)菌丝生长阶段：固体培养基厚度控制在5cm以下，料温控制在30±2℃，室温控制在 25-30℃，空气的相对含水量控制在95-100％，固体发酵室内配备新风系统，采用室内CO₂浓度反馈调节，培养室的面积根据产能确定；

2)孢子产生阶段：料温控制在30±2℃，培养基表面不能有液态水，空气的相对湿度不能低于90％，定时取样计算分生孢子数，当每克固体发酵物(干燥后)中分生孢子数达到5×10⁹时即可收获；

④制备孢子悬液：将发酵好的固体发酵培养基按培养基与水质量比1：1的比例浸润至水中，搅拌使固料中的分生孢子分散至水中，过滤去除固体发酵原料，获得孢子悬液，调整浓度至5.0×10⁹个/mL。

实施例2生物拌种剂的制备

使用硅藻土对实施例1制得的深绿木霉HB20111孢子悬液进行吸附，形成固体菌剂，加入3％羧甲基纤维素钠和3％海藻酸钠后用搅拌机混匀，调整菌数为2.0×10⁸cfu/g，在流化床中 50℃干燥至水份含量10％以下，然后分装为袋装产品。

试验例1生物拌种剂对小麦茎基腐病和纹枯病的防效

试验地位于济南市桑梓店，试验地前茬为玉米，沙壤土，近年茎基腐病和纹枯病发生严重。采用本发明实施例2制备的生物拌种剂拌种，菌剂用量按照每10kg种子100g使用，对照药剂为奥拜瑞、多福克和酷拉斯包衣处理，使用剂量按照包装说明进行，每处理防治面积 5亩。本实施例选择小麦品种为济麦22，为山东省主要栽培品种，茎基腐病和纹枯病调查于 2018年5月17日进行。

(1)小麦茎基腐病调查

依据《小麦品种(系)抗茎基腐病田间鉴定技术规范》(DB37T3404-2018)，记录分析试验数据。

病害分级标准：

0级：整株茎秆无症状；

1级：地上部基部第1叶鞘变褐色，但茎节没有病变；

3级：地上部分第1茎节变褐色；

5级：地上部分第2茎节变褐色；

7级：褐色病斑超过第2茎节，但无白穗；

9级：褐色病斑超过第2茎节，产生白穗或因发病而无穗。

病害严重程度(病情指数)计算公式：

病害严重程度＝Σ(各级病株数×该病级代表数值)/(最高病级代表数值×调查总株数) ×100％。

防效＝(对照组病害严重程度-处理组病害严重程度)/对照组病害严重程度×100％

(2)小麦纹枯病调查

依据中华人民共和国农业行业标准《小麦纹枯病测报调查规范》(NY/T614-2002)，记录分析试验数据。

病害分级标准：

0级：(无病)健株；

1级：叶鞘发病，或茎杆上病斑宽度占茎杆周长的1/4以下；

2级：茎杆上病斑宽度占茎杆周长的1/4-1/2；

3级：茎杆上病斑宽度占茎杆周长的1/2-3/4；

4级：茎杆上病斑宽度占茎杆周长的3/4以上，但植株未枯死；

5级：病株提早枯死，呈枯孕穗或白穗。

病情指数：

式中：I——病情指数；

d_i——各严重度级值；

l_i——各级病株数；

L——调查总病株数。

防效＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％。

注：计算不同处理的病情指数及防效，并利用SPSS数据分析软件进行差异显著性分析及多重比较。

(3)检测结果分析

表1为2018年5月17调查后的检测结果，深绿木霉HB20111拌种剂拌种对小麦茎基腐病和纹枯病的生物防治效果分别达到73.00％和71.09％。其中对茎基腐病的防治效果与奥拜瑞相近、优于酷拉斯和多福克；对小麦纹枯病的防治效果优于三种化学制剂，说明可以拌种使用有效地防治小麦茎基腐病和纹枯病，能够用于替代小麦种衣剂中化学杀菌剂成分的替代使用，降低化学农药使用量，应用潜力巨大。

表1深绿木霉HB20111拌种剂对小麦茎基腐病和纹枯病防治效果

实施例3

使用麦饭石对深绿木霉HB20111孢子悬液进行吸附，形成固体菌剂，加入2％羧甲基纤维素钠和1％海藻酸钠后用搅拌机混匀，调整菌数为2.0×10⁸cfu/g，在流化床中50℃干燥至水份含量10％以下，然后分装为袋装产品；

其中，深绿木霉HB20111孢子悬液采用固体发酵法大量获得，具体制备方法包括以下步骤：

①固体一级种子制备：采用PDA培养基，将深绿木霉HB20111试管菌种接种在试管培养基中，28℃培养，4℃冰箱保存，要求菌丝与分生孢子丰满，无杂菌；然后接种茄形瓶，采用PDA培养基，28℃培养，菌龄5天，要求菌落表面无液态水，菌丝与分生孢子丰满，无杂菌污染；

②液体种子制备：使用115℃灭菌30分钟的1％的葡萄糖水冲洗茄瓶表面，将新鲜孢子洗下后稀释至1.5×10⁶孢子/mL作为固体接种的液体种子；

③接种固体培养基：麦粒：稻壳(W/W)＝49：5，含水量为70％(其中包括接种的液体发酵液的水分)，FeSO₄为100ppm，121℃灭菌40分钟后以循环水冷却，接种量为2％，在混合接种器内将发酵液和培养基混合均匀，转移到固体培养室内培养96h；

培养条件为：

1)菌丝生长阶段：固体培养基厚度控制在5cm以下，料温控制在30±2℃，室温控制在 25-30℃，空气的相对含水量控制在95-100％，固体发酵室内配备新风系统，采用室内CO₂浓度反馈调节，培养室的面积根据产能确定；

2)孢子产生阶段：料温控制在30±2℃，培养基表面不能有液态水，空气的相对湿度不能低于90％，定时取样计算分生孢子数，当每克固体发酵物(干燥后)中分生孢子数达到5×10⁹时即可收获；

④制备孢子悬液：将发酵好的固体发酵培养基按培养基与水质量比1：1的比例浸润至水中，搅拌使固料中的分生孢子分散至水中，过滤去除固体发酵原料，获得孢子悬液，调整浓度至5.0×10⁹个/mL。

实施例4

使用草炭土对深绿木霉HB20111孢子悬液进行吸附，形成固体菌剂，加入4％羧甲基纤维素钠和4％海藻酸钠后用搅拌机混匀，调整菌数为2.0×10⁸cfu/g，在流化床中50℃干燥至水份含量10％以下，然后分装为袋装产品；

其中，深绿木霉HB20111孢子悬液采用固体发酵法大量获得，具体制备方法包括以下步骤：

①固体一级种子制备：采用PDA培养基，将深绿木霉HB20111试管菌种接种在试管培养基中，28℃培养，4℃冰箱保存，要求菌丝与分生孢子丰满，无杂菌；然后接种茄形瓶，采用PDA培养基，28℃培养，菌龄10天，要求菌落表面无液态水，菌丝与分生孢子丰满，无杂菌污染；

②液体种子制备：使用115℃灭菌30分钟的1％的葡萄糖水冲洗茄瓶表面，将新鲜孢子洗下后稀释至1×10⁷孢子/mL作为固体接种的液体种子；

③接种固体培养基：麦粒：稻壳(W/W)＝49：5，含水量为70％(其中包括接种的液体发酵液的水分)，FeSO₄为100ppm，121℃灭菌40分钟后以循环水冷却，接种量为4.5％，在混合接种器内将发酵液和培养基混合均匀，转移到固体培养室内培养120h；

培养条件为：

1)菌丝生长阶段：固体培养基厚度控制在5cm以下，料温控制在30±2℃，室温控制在 25-30℃，空气的相对含水量控制在95-100％，固体发酵室内配备新风系统，采用室内CO₂浓度反馈调节，培养室的面积根据产能确定；

2)孢子产生阶段：料温控制在30±2℃，培养基表面不能有液态水，空气的相对湿度不能低于90％，定时取样计算分生孢子数，当每克固体发酵物(干燥后)中分生孢子数达到5×10⁹时即可收获；

④制备孢子悬液：将发酵好的固体发酵培养基按培养基与水质量比1：1的比例浸润至水中，搅拌使固料中的分生孢子分散至水中，过滤去除固体发酵原料，获得孢子悬液，调整浓度至5.0×10⁹个/mL。

尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。

一种深绿木霉HB20111在防治小麦茎基腐病和纹枯病上的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。