专利摘要

本发明提供了一种羰基还原酶突变体及其在(13R,17S)‑ethylsecol合成中的应用，具体地，本发明以乙基缩合物ethylsecodione和异丙醇为底物进行定向进化获得羰基还原酶突变体，避免使用葡萄糖/葡萄糖脱氢酶或者是甲酸钠/甲酸脱氢酶作为辅酶再生，仅使用异丙醇作为共底物和助溶剂，对羰基进行还原从而制备高手性纯度的(13R,17S)‑ethylsecol。

权利要求

1.一种羰基还原酶突变蛋白，其特征在于：所述突变蛋白在对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中，仅第114位点的天冬酰胺突变为甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸；或者仅第294位点的亮氨酸突变为脯氨酸、天冬酰胺；或者仅第285位点的甲硫氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

2.一种羰基还原酶突变蛋白，其特征在于：所述突变蛋白相对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列而言，存在如下位点的突变：第114位突变为亮氨酸、丝氨酸或甘氨酸且第294位突变为脯氨酸；第114位突变为甘氨酸且第294位突变为天冬酰胺；第285位突变为亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸且第294位突变为脯氨酸；第114位突变为亮氨酸、且第285位突变为亮氨酸或缬氨酸或异亮氨酸，以及第294位突变为脯氨酸；第114位突变为丝氨酸、且第285位突变为亮氨酸，以及第294位突变为脯氨酸。

3.如权利要求1至2任一项所述的羰基还原酶的突变体蛋白的编码基因。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9-14。

5.含有如权利要求3或4所述的编码基因的重组表达载体或重组菌。

6.如权利要求1至2任一项所述的羰基还原酶的突变体蛋白，或如权利要求3或4所述的编码基因在催化以乙基缩合物底物的转化中的应用。

7.一种以乙基缩合物底物的转化的方法，其包括利用如权利要求1至2任一项所述的羰基还原酶的突变体蛋白催化乙基缩合物为底物的转化反应。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述乙基缩合物ethyl secodione，并且转化产物为(13R,17S)-ethyl secol。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：是以含所述羰基还原酶突变体的编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以乙基缩合物ethyl secodione为底物，加入异丙醇，于搅拌条件下进行还原反应。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：其中以pH为6.0-10.0的缓冲液为反应介质，于25℃-50℃的反应温度、搅拌条件下进行还原反应。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌的菌体量为10-50 g/L；或者所述pH 为6.0-8.0；或者所述反应温度为35℃-45℃；或所述底物浓度为5-120 g/L。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌的菌体量为10-30 g/L；或者所述pH 为7.5；或者所述反应温度为40℃；或所述底物浓度为20-80 g/L。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地，本发明涉及羰基还原酶突变体及其在制备手性ethyl secol及结构类似物中的应用。

背景技术

2,2-双取代-1,3-环戊二酮的去对称性还原反应是合成多种甾体类化合物（13-位的手性季碳的形成）的关键步骤(Chapelon, A.-S.; Moraléda, D.; Rodriguez, R.;Ollivier, C.; Santelli, M., Enantioselective synthesis of steroids.Tetrahedron 2007, 63, 11511-11616; Sakata, K.; Wang, Y.; Urabe, D.; Inoue,M., Synthesis of the tetracyclic structure of batrachotoxin enabled bybridgehead radical coupling and Pd/Ni-promoted Ullmann reaction. Org. Lett. 2018, 20, 130-133.)。以ethyl secodione为底物去对称性单羰基还原后产物是合成甾体类药物左炔诺孕酮（levonorgestrel）、孕二烯酮（gestodene）的关键中间体（图1a）；利用2-甲基-2-(3-氧代丙基)-1,3-环戊二酮为底物去对称化还原后产物可以用于合成13β-甲基-14β-羟基的甾体化合物（图1b）(Ruel, R.; Deslongchamps, P., Synthesis of anoptically active 13β-methyl 14β-hydroxy steroid via base-catalyzed reactions.Tetrahedron Lett. 1990, 31, 3961-3964)。2,2-双取代-1,3-环二酮的去对称化不仅可以用于合成甾体化合物的中间体，还可用于合成多种结构复杂的生物活性分子(Bressy,C.; Merad, J.; Candy, M.; Pons, J.-M., Catalytic Enantioselectivedesymmetrization of meso compounds in total synthesis of natural products:towards an economy of chiral reagents. Synthesis 2017, 49, 1938-1954; Mori,K.; Mori, H., Synthesis of (1S, 5R)-Karahana ether and (1S, 5R)-Karahanalactone. The optical active forms of unique monoterpenen with a 6-oxabicyclo[3,2,1]octane Ring system. Tetrahedron 1985, 41, 5487-5493; Takano, S.; Sato,S.; Goto, E.; Ogasawara, K., A new asymmetric route to (+)-vincamine. Chem. Commun. 1986, 156-158; Brooks, D. W.; Woods, K. W., Chiral building blocksfor fused cyclopentanoids: enantioselective synthesis of 5-methylbicyclo[3.3.0]oct-l-ene-3,6-dione and derivatives. J. Org. Chem. 1987, 52, 2036-2039; Murai, A.; Tanimoto, N.; Sakamoto, N.; Masamune, T., Total synthesis ofglycinoeclepin A. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 1985-1986)。

中国专利文献CN201810555674.6报道了利用羰基还原酶突变体实现乙基缩合物ethyl secodione，其结构标准命名及中文标准命名为：(E)-2-ethyl-2-(2-(6-methoxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-ylidene)ethyl)cyclopentane-1,3-dione，中文是(顺)-2-乙基-2-(2-(6-甲氧基-3，4-二氢萘酚-1(2H)乙基)-1,3-环戊二酮）的高效还原，但是该突变体需要额外加入葡萄糖脱氢酶（GDH）和大量的葡萄糖作为辅酶再生，原子经济性不高，副产物葡萄糖酸的生成使得反应过程中需要不断调整反应的pH值，由于乙基缩合物ethylsecodione的溶解度较差，需要额外使用一定比例的有机溶剂作为助溶剂。羰基还原酶TbADH可以利用异丙醇实现辅酶的再生，但是由于目标底物乙基缩合物ethyl secodione与异丙醇相比结构具有更大的位阻，而且TbADH对乙基缩合物ethyl secodione的活力很低。因此对其进行改造是非常有必要的。

发明内容

为了在温和的反应条件下合成(13R,17S)-ethyl secol，其结构标准命名及中文标准命名为：(2R,3S)-2-ethyl-3-hydroxy-2-(2-((E)-6-methoxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-ylidene)ethyl)cyclopentan-1-one，中文是(2R,3S)-2-乙基-3羟基--2-(2-((顺)-6-甲氧基-3，4-二氢萘酚-1(2H)乙基)-1-环戊酮），并且避免使用葡萄糖或者是甲酸钠作为辅酶再生的共底物，避免使用葡萄糖脱氢酶或者是甲酸脱氢酶作为辅酶再生的酶，本发明以乙基缩合物ethyl secodione和异丙醇为底物进行定向进化获得羰基还原酶突变体，避免使用葡萄糖/葡萄糖脱氢酶或者是甲酸钠/甲酸脱氢酶作为辅酶再生，仅使用异丙醇作为共底物和助溶剂，对羰基进行还原从而制备高手性纯度的(13R,17S)-ethyl secol。

本发明提供的羰基还原酶突变蛋白，且所述突变蛋白是在对应于SEQ ID NO：1:所示氨基酸序列中的第114，285和294位点中有一个或多个位点突变的羰基还原酶突变体：在优选实施方式中，所述的第114位点的天冬酰胺（N）突变为甘氨酸（G）、丝氨酸（S）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L），优选亮氨酸（L）。

在另一优选实施方式中，所述的第294位点的亮氨酸突变为脯氨酸（P）、天冬酰胺（N），优选脯氨酸（P）。

在另一优选实施方式中，第285位点的甲硫氨酸（M）突变为缬氨酸（V）、亮氨酸（L）和异亮氨酸（I），优选亮氨酸（L）。

更具体的是下述组合突变：第114位突变为亮氨酸（L）、丝氨酸（S）或甘氨酸（G）且第294位突变为脯氨酸（P）；第114位突变为甘氨酸（G）且第294位突变为天冬酰胺（N）；第285位突变为亮氨酸（L）、缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）且第294位突变为脯氨酸（P）；第114位突变为亮氨酸（L）、且第285位突变为亮氨酸（L）或缬氨酸（V）或异亮氨酸（I），以及第294位突变为脯氨酸（P）；第114位突变为丝氨酸（S）、且第285位突变为亮氨酸（L），以及第294位突变为脯氨酸（P）。

本发明进一步提供如上所述突变体的编码基因。以及含有所述基因的重组表达载体，及其重组菌。其中所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：9-14。

本发明还提供所述的羰基还原酶的突变体在催化以乙基缩合物底物的转化中的应用。优选地，所述乙基缩合物为ethyl secodione，并且转化产物为(13R,17S)-ethylsecol。

本发明进一步提供以乙基缩合物底物的转化的方法，其包括利用所述突变体催化乙基缩合物为底物的转化反应。优选地，所述乙基缩合物为ethyl secodione，并且转化产物为(13R,17S)-ethyl secol。

在一个具体实施方式中，是以含所述羰基还原酶突变体的编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以乙基缩合物ethyl secodione为底物，加入异丙醇，于搅拌条件下进行还原反应。更具体地，其中以pH为6.0-10.0的缓冲液为反应介质，于25℃-50℃的反应温度、搅拌条件下进行还原反应。

优选地，在所述方法中各步骤的更优选的操作如下之一：

(i)反应体系含有菌体量为10-50 g/L，更佳地，10-30 g/L；

(ii)反应体系的pH 为6.0-10.0，较佳地，6.0-8.0，更佳地，7.0；

(iii)反应体系温度为25℃-50℃，较佳地，35℃-45℃，更佳地，40℃；

(iv)催化底物浓度为5-120 g/L，更佳地，底物浓度为20-80 g/L。

本发明的有益效果：通过对羰基还原酶的改造获得的突变体，可以完全避免使用葡萄糖/葡萄糖脱氢酶或者是甲酸钠/甲酸脱氢酶，仅使用异丙醇作为共底物和助溶剂，突变体的立体选择性有明显提高，对异丙醇的活力保持较好。在一个实施实验中，本发明突变体可以ethyl secodione为底催化获得的(13R,17S)-ethyl secol的ee值≥98.0%，更佳地≥99.0%。因此，本发明效果十分显著，具有较高的应用价值。

附图说明

图1 2,2-双取代-1,3-环戊酮醇在甾体化合物合成中的应用。

图2 TbADH与突变体蛋白经诱导表达后结果。其中，M 表示 Marker，其中，M 表示Marker，1 为TbADH野生型蛋白表达上清，2为TbADH野生型蛋白表达沉淀，3为代表性突变体N114G蛋白表达上清，4为代表性突变体N114G蛋白表达沉淀，5为代表性突变体M285L蛋白表达上清，6为代表性突变体M285L蛋白表达沉淀，7为代表性突变体L294T蛋白表达上清，8为代表性突变体L294T蛋白表达沉淀。

图3是产物ethyl secol消旋体的HPLC谱图。

图4 是(13R,17S)-ethyl secol的HPLC谱图。

具体实施方式

下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

如本文所用，术语“表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如N114L表示第114位的氨基酸N突变为L，以此类推。

在本发明的一个具体实施方式中，羰基还原酶突变体的制备方法如下：大肠杆菌作为表达宿主。具体步骤为：（1）羰基还原酶TbADH，其核苷酸序列为SEQ ID NO：8，其蛋白序列如 SEQ ID NO：1所示，相应突变位点的基因构建到pET 21a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。（2）将重组质粒转入宿主菌细胞 优选大肠杆菌 BL21(DE3)，获得相应的工程菌株。（3）将工程菌株接种至LB培养基中，37℃培养3小时，加入 0.1 mM 的异丙基硫代半乳糖苷30℃培养12小时。（4）离心收集菌体。

实施例1羰基还原酶TbADH突变体库的构建

根据TbADH的结构，选择其底物结合口袋内非保守残基分别进行饱和突变，采用简并密码子NNK设计突变引物，以pET21a-TbADH作为模板。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对表达的蛋白进行高通量活力筛选，筛选方法为分别以乙基缩合物为底物，检测340 nm处NADP(H)的变化。其中反应的具体方法是： 底物用DMSO溶解，终浓度0.8mM，其中DMSO 60μL，NADPH 0.5mg/mL，粗酶液20μL，pH7.5的磷酸钾缓冲液补齐至200μL，酶标仪检测340 nm处NADPH的下降，若酶活相对较高，则NADPH的消耗则快，下降曲线的斜率较大。

建库突变的位点分别为42，49，86，106，107，110，114，266，267，268，285和294。对乙基缩合物ethyl secodione转化实验测定（具体操作如实施例4中描述的进行），获得立体选择性提高的有益突变位点114，285和294，分别为突变体1、2、3蛋白序列如 SEQ ID NO：2-4所示。进一步转化实验结果表明单点突变中突变体3活力最好，且立体选择性有明显提高，对异丙醇的活力保持较好，蛋白序列如 SEQ ID NO：4所示（具体结果见表2所示）。

实施例2羰基还原酶TbADH组合突变体库构建

根据饱和突变结果，选取活力提高，立体选择性最优突变体3为模板，分别构建组合突变体库（表1给出了突变体库构建所用到的引物序列）。对乙基缩合物ethyl secodione转化实验测定（具体操作如实施例4中描述的进行）。两位点组合突变获得的突变体为突变体4和5，蛋白序列为SEQ ID NO：5和6，以突变体4为模板，将M285突变位点引入，筛选获得的更优突变体6蛋白序列为SEQ ID NO：7。其结果见表2。

表1 突变体库引物序列

表2 羰基还原酶TbADH组合突变体对乙基缩合物ethyl secodione转化和异丙醇活力结果

实施例 3：羰基还原酶TbADH突变体的诱导表达

配置种子液 50 mL，培养基为 LB 液体培养基 (蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl10 g/L)，用接种环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200 rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以 1% 的接种量转接到发酵培养基 (LB 培养基)，37℃，200 rpm 培养至OD600为0.6-1.0左右，加入 0.1 mM的 IPTG，并置于30℃，200 rpm 诱导10～12 h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体，用磷酸钠缓冲液(100 mM，pH 7.0)清洗一遍。SDS-PAGE 电泳图谱显示TbADH与突变体的诱导表达情况，如图2所示，其中，M 表示 Marker，1 为TbADH野生型蛋白表达上清，2为TbADH野生型蛋白表达沉淀，3为代表性突变体N114G蛋白表达上清，4为代表性突变体N114G蛋白表达沉淀，5为代表性突变体M285L蛋白表达上清，6为代表性突变体M285L蛋白表达沉淀，7为代表性突变体L294T蛋白表达上清，8为代表性突变体L294T蛋白表达沉淀。以上结果可以表明，本实施例的方法获得的突变体蛋白与TbADH均含可溶性蛋白表达。

实施例 4：TbADH野生型重组菌催化乙基缩合物ethyl secodione的方法

按照实施例3的方法诱导表达TbADH野生型（其核苷酸序列如SEQ ID NO：8，其蛋白序列如 SEQ ID NO：1所示），离心收集菌体 (6000 rpm)，以菌体作为生物催化剂。取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH7.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为10 g/L，37℃，200 r/min反应，24 h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。转化率6%，(13R,17S)-ethyl secol产物含量96%。乙基缩合物ethyl secodione单羰基还原消旋体如图3所示，(13R,17S)-ethyl secol如图4所示。

实施例 5：TbADH突变体重组菌催化乙基缩合物ethyl secodione的实验

按照实施例3的方法诱导表达本发明的TbADH突变体1（其核苷酸序列如SEQ ID NO：9，其蛋白序列如 SEQ ID NO：2所示），离心收集菌体 (6000 rpm)，以菌体作为生物催化剂。基于不同的参数进行下述实验，并测定和计算实验结果。

(1) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 8.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h后取样检测底物转化率62%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(2) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h后取样检测底物转化率89%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(3) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率73%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(4) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率55%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(5) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率45%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(6) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为40 g/L，37℃，200r/min反应，36 h取样检测底物转化率99%，停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

通过上述实验表明，在不同pH值条件、不同底物乙基缩合物ethyl secodione的浓度下都具有较好的底物转率，其中尤其是pH为7.5时，TbADH突变体1能够最快的转化底物乙基缩合物ethyl secodione。

实施例 6：TbADH突变体重组菌催化乙基缩合物ethyl secodione的实验

按照实施例3的方法诱导表达本发明的TbADH突变体2（其核苷酸序列如SEQ ID NO：10，其蛋白序列如 SEQ ID NO：3所示），离心收集菌体 (6000 rpm)，以菌体作为生物催化剂。基于不同的参数进行下述实验，并测定和计算实验结果。

(1) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 8.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h后取样检测底物转化率58%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(2) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h后取样检测底物转化率72%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(3) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率78%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(4) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率75%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(5) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率49%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(6) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为40 g/L，37℃，200r/min反应，36 h取样检测底物转化率99%，停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

通过上述实验表明，在不同pH值条件、不同底物乙基缩合物ethyl secodione的浓度下都具有较好的底物转率，其中尤其是pH为7.5时，TbADH突变体2能够最快的转化底物乙基缩合物ethyl secodione。

实施例 7：TbADH突变体重组菌催化乙基缩合物ethyl secodione的实验

按照实施例3的方法诱导表达本发明的TbADH突变体3（其核苷酸序列如SEQ ID NO：11，其蛋白序列如 SEQ ID NO：4所示），离心收集菌体 (6000 rpm)，以菌体作为生物催化剂。基于不同的参数进行下述实验，并测定和计算实验结果。

(1) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 8.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h后取样检测底物转化率82%，反应时间延长至12 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(2) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h后取样检测底物转化率99%，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(3) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率91%，反应时间延长至12 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(4) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率85%，反应时间延长至12 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(5) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率65%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(6) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为40 g/L，37℃，200r/min反应，14 h取样检测底物转化率99%，停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(7) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为30 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（15 mL）至终浓度为100 g/L，NADP+终浓度0.2 g/L，37℃，200 r/min反应，24 h取样检测底物转化率99%后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(8) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为30 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（20 mL）至终浓度为150 g/L，NADP+终浓度0.2 g/L，37℃，200 r/min反应，36 h取样检测底物转化率99%后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。底物转化率98%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

通过上述实验表明，在不同pH值条件、不同菌体浓度、不同底物乙基缩合物ethylsecodione的浓度下都具有较好的底物转率，其中尤其是pH为7.5时，TbADH突变体3能够最快的转化底物乙基缩合物ethyl secodione。

实施例 8：TbADH突变体重组菌催化乙基缩合物ethyl secodione的实验

按照实施例3的方法诱导表达本发明的TbADH突变体4（其核苷酸序列如SEQ ID NO：12，其蛋白序列如 SEQ ID NO：5所示），离心收集菌体 (6000 rpm)，以菌体作为生物催化剂。基于不同的参数进行下述实验，并测定和计算实验结果。

(1) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 8.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，5 h后取样检测底物转化率89%，反应时间延长至12 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(2) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，5 h后取样检测底物转化率99%，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(3) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，5 h取样检测底物转化率93%，反应时间延长至12 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(4) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，5 h取样检测底物转化率89%，反应时间延长至12 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(5) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，5 h取样检测底物转化率74%，反应时间延长至24 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(6) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为40 g/L，37℃，200r/min反应，10 h取样检测底物转化率99%，停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(7) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为30 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（15 mL）至终浓度为100 g/L，NADP+终浓度0.2 g/L，37℃，200 r/min反应，22 h取样检测底物转化率99%后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(8) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为30 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（20 mL）至终浓度为150 g/L，NADP+终浓度0.2 g/L，37℃，200 r/min反应，24 h取样检测底物转化率99%后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。底物转化率98%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

通过上述实验表明，在不同pH值条件、不同菌体浓度、不同底物乙基缩合物ethylsecodione的浓度下都具有较好的底物转率，其中尤其是pH 为7.5时，TbADH突变体4能够最快的转化底物乙基缩合物ethyl secodione。

实施例 9：TbADH突变体重组菌催化乙基缩合物ethyl secodione的实验

按照实施例3的方法诱导表达本发明的TbADH突变体5（其核苷酸序列如SEQ ID NO：13，其蛋白序列如 SEQ ID NO：6所示），离心收集菌体 (6000 rpm)，以菌体作为生物催化剂。基于不同的参数进行下述实验，并测定和计算实验结果。

(1) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 8.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，5 h后取样检测底物转化率93%，反应时间延长至12 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(2) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，4 h后取样检测底物转化率99%，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(3) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率99%，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(4) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率99%，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(5) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，5 h取样检测底物转化率87%，反应时间延长至10 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(6) 取菌体重悬于 100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为40 g/L，37℃，200r/min反应，8 h取样检测底物转化率99%，停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(7) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为30 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（15 mL）至终浓度为100 g/L，NADP+终浓度0.2 g/L，37℃，200 r/min反应，16 h取样检测底物转化率99%后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(8) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为30 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（20 mL）至终浓度为150 g/L，NADP+终浓度0.2 g/L，37℃，200 r/min反应，20 h取样检测底物转化率99%后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。底物转化率98%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

通过上述实验表明，在不同pH值条件、不同菌体浓度、不同底物乙基缩合物ethylsecodione的浓度下都具有较好的底物转率，其中尤其是pH 为7.5时，TbADH突变体5能够最快的转化底物乙基缩合物ethyl secodione。

实施例 10：TbADH突变体重组菌催化乙基缩合物ethyl secodione的实验

按照实施例3的方法诱导表达本发明的TbADH突变体6（其核苷酸序列如SEQ ID NO：14，其蛋白序列如 SEQ ID NO：6所示），离心收集菌体 (6000 rpm)，以菌体作为生物催化剂。基于不同的参数进行下述实验，并测定和计算实验结果。

(1) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 8.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，4 h后取样检测底物转化率90%，反应时间延长至8 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(2) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，4 h后取样检测底物转化率99%，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(3) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，4 h取样检测底物转化率93%，反应时间延长至5 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(4) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，4 h取样检测底物转化率92%，反应时间延长至5 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(5) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 6.0，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为20 g/L，37℃，200r/min反应，4 h取样检测底物转化率83%，反应时间延长至6 h后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(6) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为10 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（10 mL）至终浓度为40 g/L，37℃，200r/min反应，6 h取样检测底物转化率99%，停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(7) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为30 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（15 mL）至终浓度为100 g/L，NADP+终浓度0.2 g/L，37℃，200 r/min反应，12 h取样检测底物转化率99%后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。检测底物转化率99%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

(8) 取菌体重悬于100 mL磷酸钠缓冲液 (pH 7.5，100 mM)，菌体浓度为30 g/L，加入溶有底物乙基缩合物ethyl secodione的异丙醇（20 mL）至终浓度为150 g/L，NADP+终浓度0.2 g/L，37℃，200 r/min反应，18 h取样检测底物转化率99%后停止反应，乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。底物转化率98%，(13R,17S)-ethyl secol占产物含量99.5%。

通过上述实验表明，在不同pH值条件、不同菌体浓度、不同底物乙基缩合物ethylsecodione的浓度下都具有较好的底物转率，其中尤其是pH 为7.5时，TbADH突变体6能够最快的转化底物乙基缩合物ethyl secodione。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 羰基还原酶突变体及其应用

<130> 1

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 350

<212> PRT

<213> Thermoanaerobium brockii

<400> 1

Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu

1 5 1015

Lys Glu Lys Pro Ala Pro Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu

202530

Ala Val Ala Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala

354045

Ile Gly Glu Arg His Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu

505560

Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg

65707580

Val Val Val Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Ser Glu Val Gln

859095

Arg Gly Tyr His Gln His Ser Gly Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe

100 105 110

Ser Asn Val Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Phe Phe His Val Asn Asp

115 120 125

Ala Asp Met Asn Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Ile Pro Leu Glu Ala

130 135 140

Ala Val Met Ile Pro Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu

145 150 155 160

Leu Ala Asp Ile Glu Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly

165 170 175

Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly

180 185 190

Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys

195 200 205

Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asp Gly Pro Ile Glu

210 215 220

Ser Gln Ile Met Asn Leu Thr Glu Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ile Ala Gly Gly Asn Ala Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val

245 250 255

Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Glu

260 265 270

Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys

275 280 285

Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg

290 295 300

Leu Ile Asp Leu Val Phe Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val

305 310 315 320

Thr His Val Phe Arg Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Phe Met Leu

325 330 335

Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile

340 345 350

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> Thermoanaerobium brockii

<400> 2

Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu

1 5 1015

Lys Glu Lys Pro Ala Pro Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu

202530

Ala Val Ala Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala

354045

Ile Gly Glu Arg His Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu

505560

Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg

65707580

Val Val Val Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Ser Glu Val Gln

859095

Arg Gly Tyr His Gln His Ser Gly Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe

100 105 110

Ser Leu Val Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Phe Phe His Val Asn Asp

115 120 125

Ala Asp Met Asn Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Ile Pro Leu Glu Ala

130 135 140

Ala Val Met Ile Pro Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu

145 150 155 160

Leu Ala Asp Ile Glu Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly

165 170 175

Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly

180 185 190

Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys

195 200 205

Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asp Gly Pro Ile Glu

210 215 220

Ser Gln Ile Met Asn Leu Thr Glu Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ile Ala Gly Gly Asn Ala Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val

245 250 255

Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Glu

260 265 270

Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys

275 280 285

Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg

290 295 300

Leu Ile Asp Leu Val Phe Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val

305 310 315 320

Thr His Val Phe Arg Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Phe Met Leu

325 330 335

Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile

340 345 350

<210> 3

<211> 350

<212> PRT

<213> Thermoanaerobium brockii

羰基还原酶突变体及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。