专利摘要

本发明公开了一种赤霉菌及利用该菌株发酵生产赤霉素GA4+7的方法，属于发酵工程领域。该方法包括：平板培养，种子培养，发酵培养以及在发酵培养过程中的条件控制，在发酵培养基中添加混合碳源，在特定的发酵时间补加植物油、添加特征性前体及增加氧通量，而达到提高GA4+7效价的目的。本菌株发酵获得的GA4+7效价高，成本低，操作简便，有利于工业化生产。CGMCCNo.55882011.12.14

权利要求

1.一种赤霉菌，菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.5588，分类命名赤霉菌，菌种的拉丁学名Gibberella fujikuroi，参据的微生物株NJYHWG32261，保藏日期是2011.12.14。

2.一种利用如权利要求1所述赤霉菌发酵生产赤霉素GA₄₊₇的方法，其具体步骤为：

（1）平板培养：将赤霉菌NJYHWG32261菌种接到PDA培养基上,在pH6.0～7.0,温度为26～32℃,培养2～4天,得到活化的赤霉菌菌落；其中PDA培养基的组成为(g/L):土豆汁150～250、葡萄糖10～30、琼脂15～20；

（2）种子培养：从PDA培养基上挑1-2个活化的赤霉菌菌落到装种子培养基的摇瓶中,在pH6.0～7.0,温度为26～32℃,摇床转速为160～200rpm,培养2～4天,得到种子液；其中种子培养基的装液量为摇瓶体积的10～20%；种子培养基为(g/L)：葡萄糖30～50、NH₄NO₃1～2、MgSO₄·7H₂O 0.8～1.2、KH₂PO₄·3H₂O 0.5～1.0；

(3)发酵培养：将种子液按发酵培养基体积的5%～10%比例接种于装发酵培养基的摇瓶中，控制pH6.0～7.0，温度为26～32℃，摇床转速为160～200rpm,在发酵过程的前期增大发酵液的通气量,发酵中后期补加植物油和特征前体,培养6～8天,得到发酵液；其中发酵培养基的装液量为摇瓶体积的10～20%；发酵培养基为(g/L):30～50的速效碳源与10～30的迟缓碳源、0.5～1.0的氮源、MgSO₄·7H₂O0.8～1.2、KH₂PO₄·3H₂O0.5～1.0、NaCl 3～5。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的速效碳源为葡萄糖、蔗糖、饴糖或乳糖；迟缓碳源为糊精或淀粉水解液；氮源为(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃、NaNO₃、花生饼粉、黄豆饼粉或玉米浆。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中发酵24～28h把摇床转速提高到220～230rpm以提高发酵液的通气量；在发酵72～120h补加植物油，植物油的加入质量与发酵培养基装液量体积比为0.1～0.3g/L；特征前体的加入质量与发酵培养基装液量体积比为0.2～0.4g/L；其中所述的植物油为豆油或芝麻油；所述的特征前体为氨基乙酸或甲羟戊酸。 

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程领域，主要涉及的是对本实验室筛选到的一株产赤霉素GA₄₊₇的赤霉菌发酵培养基进行优化同时对发酵过程进行控制以提高GA₄₊₇效价的方法。 

背景技术

我国是拥有几千年历史的农耕大国，在传统的种植业中粮食的产量在很大程度上取决于当地的日照、温度、湿度等气候条件。利用现代科学技术，突破环境地域的限制，是解决粮食危机的主要手段。研究发现，植物细胞在接受温度光照等环境信号时，会产生低浓度可调节植物生理反应的活性物质，影响细胞的分裂、伸长、分化，这些活性物质被称为植物激素。赤霉素是六大植物激素之一，目前已发现上百种赤霉素同系物,GA₄₊₇和GA₃最具使用价值和商业价值。GA₃因为活性过高，副作用很大，GA₄₊₇以其独特的优势成为了目前农业领域研究的热点。它在植物体内的含量非常低，工业中主要是通过赤霉菌发酵生产，作为一种新型高效的植物生长激素，主要具有如下特点：①破坏休眠。植物在开花前都需要经过低温和长日照，以促进GA₄₊₇的合成,打破植物的休眠，外源性的添加GA₄₊₇可以使植物种子提前发芽。②增加座果，植物的开花期用GA₄₊₇喷洒后可以防止空洞果，增加座果率，能防止在使用其它的生长激素过程中所带来的营养的浪费。③刺激细胞分裂扩大，GA₄₊₇可以抑制细胞壁过氧化物酶的活性，增加壁的柔韧性，而具有更好伸展性，生长加快，能使细胞周期缩短30%左右。④诱导单性结实，如在诸如葡萄、草莓、杏、梨、番茄等果实的生长前期，用一定浓度的GA₄₊₇喷洒，可生长得到无籽果实。 

GA₄₊₇是不能人工合成的植物激素，其工业化生产主要是利用赤霉菌发酵生产。赤霉菌发酵会产生不同种类的赤霉素,其中以GA₃为主，对以产GA₄₊₇为主的菌种报道极少。GA₄₊₇作为赤霉菌的次级代谢产物，培养条件与营养组分对其产量影响很大。不同的碳源、氮源、pH及温度均会对 其产生影响，再加上赤霉菌是强好氧菌，对氧气的需求量非常高，不同的发酵条件会产生不同种类赤霉素，对后期分离提取提出了很高的要求。这严重制约着GA₄₊₇的产量，针对这些问题，若能利用GA₄₊₇产生菌建立一套优化的发酵方法，增加GA₄₊₇效价，将具有巨大的应用前景。 

发明内容

本发明的目的是提供一种赤霉菌；本发明的另一目的提供一种利用上述赤霉菌发酵生产赤霉素GA₄₊₇的方法，在于通过发酵培养基的优化及发酵条件的控制提高GA₄₊₇产量。 

本发明的技术方案为：一种赤霉菌，菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号是CGMCCNo.5588，分类命名赤霉菌，菌种的拉丁学名Gibberella fujikuroi，参据的微生物株NJYHWG32261，保藏日期是2011.12.14。 

本发明还提供了一种利用上述赤霉菌发酵生产GA₄₊₇的方法，其具体步骤为为： 

（1）平板培养：将赤霉菌NJYHWG32261菌种接到PDA培养基上,在pH6.0～7.0,温度为26～32℃,培养2～4天,得到活化的赤霉菌菌落；其中PDA培养基的组成为(g/L):土豆汁150～250、葡萄糖10～30、琼脂15～20； 

（2）种子培养：从PDA培养基上挑1-2个活化的赤霉菌菌落到装种子培养基的摇瓶中,在pH6.0～7.0,温度为26～32℃,摇床转速为160～200rpm,培养2～4天,得到种子液；其中种子培养基的装液量为摇瓶体积的10～20%；种子培养基为(g/L)：葡萄糖30～50、NH₄NO₃1～2、MgSO₄·7H₂O 0.8～1.2、KH₂PO₄·3H₂O 0.5～1.0； 

(3)发酵培养：将种子液按发酵培养基体积的5%～10%比例接种于装发酵培养基的摇瓶中，控制pH6.0～7.0，温度为26～32℃，摇床转速为160～200rpm,在发酵过程的前期增大发酵液的通气量,发酵中后期补加植物油和特征前体,培养6～8天,得到发酵液；其中发酵培养基的装液量为 摇瓶体积的10～20%；发酵培养基为(g/L):30～50的速效碳源与10～30的迟缓碳源、0.5～1.0的氮源、MgSO₄·7H₂O0.8～1.2、KH₂PO₄·3H₂O0.5～1.0、NaCl 3～5;

优选步骤(3)所述的速效碳源为葡萄糖、蔗糖、饴糖或乳糖；迟缓碳源为糊精或淀粉水解液；氮源为(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃、NaNO₃、花生饼粉、黄豆饼粉或玉米浆。优选步骤(3)中发酵24～28h把摇床转速提高到220～230rpm以提高发酵液的通气量；在发酵72～120h补加植物油，植物油的加入质量与发酵培养基装液量体积比为0.1～0.3g/L；特征前体的加入质量与发酵培养基装液量体积比为0.2～0.4g/L；所述的植物油为豆油或芝麻油；所述的特征前体为氨基乙酸或甲羟戊酸。 

CGMCC No.5588菌株具有下述性质： 

1、形态与培养特征： 

在PDA培养基上培养,菌落圆形,菌丝为白色，稠密的细绒毛状,生长旺盛,后期中央菌丝由白色转为黑灰色。有性世代产生子囊孢子,子囊壳呈椭球状,黑色,大小为10~25.5×10.2~19.6μm。无性世代产生分生孢子,白色,孢子镰刀型，有隔膜。赤霉菌菌丝生长和子囊孢子萌发都要合适条件:最适温度28℃,相对湿度70%,喜偏酸性近中性,PH6.0~7.0,最适PH6.8。 

2、生理生化特性: 

赤霉菌CGMCC No.5588菌株的主要生理生化特征见表1： 

表1菌株的生理生化特征 

注：＋：阳性或生长；－：阴性或不生长 

有益效果： 

(1)我们筛选到一株以积累GA₄₊₇为主的赤霉菌,菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.5588。(2)根据次级代谢产物的发酵特点，我们在初始培养基中添加速效及迟缓混合碳源，并根据该菌株的特性，在发酵对数期增加通气量。达到的菌体生产与产物积累的平衡点。(3)在发酵稳定前期，即GA₄₊₇大量合成前期，补加植物油及特征性前体，使得GA₄₊₇的积累量更高。HPLC检测发酵液中提取的GA混合物发现至少含有70%的GA₄₊₇，GA₄：GA₇为（3±0.5）：1。 

保藏信息 

上述赤霉菌Gibberella fujikuroi CGMCC No.5588是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.5588，保藏日期是：2011.12.14。 

具体实施方式

以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。 

实施案例1： 

平板培养：将赤霉菌NJYHWG32261菌种接到PDA培养基上,在pH6.0,温度为32℃，培养2天,得到活化的赤霉菌菌落；其中PDA培养基的组成为(g/L):土豆汁250、葡萄糖10、琼脂15； 

种子培养：从PDA培养基上挑1个活化的赤霉菌菌落到装种子培养基的摇瓶中,在pH6.0，培养温度为32℃，摇床转速为160rpm，培养2天,得到种子液；其中种子培养基的装液量为摇瓶体积的10%；种子培养基为(g/L)：葡萄糖30、NH₄NO 32.0、MgSO₄·7H₂O 1.0、KH₂PO₄·3H₂O1.0； 

发酵培养：将种子液按发酵培养基体积的5%比例接种于装发酵培养液的摇瓶中，pH为6.0，培养温度为32℃，摇床转速为160rpm，在发酵28h把摇床转速提高到220rpm以提高发酵液的通气量，在发酵120h补加0.1g/L豆油、0.4g/L氨基乙酸（补加物料的质量与发酵培养基装液量体积比），培养8天得到发酵液；其中发酵培养基的装液量为摇瓶体积的10%；发酵培养基为(g/L)：30.0葡萄糖、30.0糊精、0.5(NH₄)₂SO₄、0.8MgSO₄·7H₂O、0.5KH₂PO₄·3H₂O、3NaCl；HPLC检测发酵液中提取的GA混合物发现含有70.02%的GA₄₊₇，GA₄：GA₇为3.7：1.2。 

实施案例2： 

平板培养：将赤霉菌NJYHWG32261菌种接到PDA培养基上培养,在pH6.5,培养温度为28℃，培养3天，得到活化的赤霉菌菌落；其中PDA培养基的组成为(g/L):土豆汁150、葡萄糖30、琼脂20； 

种子培养：从PDA培养基上挑2个活化的赤霉菌菌落到装种子培养基的摇瓶中,在pH6.5，培养温度为28℃，摇床转速为180rpm，培养3天，得到种子液；其中种子培养基的装液量为摇瓶体积的15%；种子培养基为(g/L)：葡萄糖40、NH₄NO₃1.0、MgS O₄·7H₂O 0.8、KH₂PO₄·3H₂O0.5；； 

发酵培养：将种子液按发酵培养基体积的8%比例接种于装发酵培养液的摇瓶中，pH为6.5，培养温度为28℃，摇床转速为180rpm,在发酵24h把摇床转速提高到225rpm以提高发酵液的通气量；在发酵72h补加0.2g/L芝麻油、0.3g/L甲瓦龙酸（补加物料的质量与发酵培养基装液量体积比），培养6天得到发酵液；其中发酵培养基的装液量为摇瓶体积的15%；发酵培养基为(g/L)：40.0蔗糖、20.0淀粉水解液、0.75花生饼粉、1.0MgSO₄·7H₂O、0.75KH₂PO₄·3H₂O、4NaCl；HPLC检测发酵液中提取的GA混合物发现含有83.10%的GA₄₊₇，GA₄：GA₇为5.6：1.9。 

实施案例3： 

平板培养：将赤霉菌NJYHWG32261菌种接到PDA培养基上培养,在pH7.0,培养温度为26℃，培养4天得到活化的赤霉菌菌落；其中PDA培养基的组成为(g/L):土豆汁200、葡萄糖20、琼脂18； 

种子培养：从PDA培养基上挑1个活化的赤霉菌菌落到装种子培养基的摇瓶中,在pH7.0，培养温度为26℃，摇床转速为200rpm，培养4天得到种子液；其中种子培养基的装液量为摇瓶体积的20%；种子培养基为(g/L)：葡萄糖50、NH₄NO₃1.5、MgSO₄·7H₂O 1.2、KH₂PO₄·3H₂O0.8；； 

发酵培养：将种子液按发酵培养基体积的10%比例接种于装发酵培养液的摇瓶中，pH为7.0，培养温度为26℃，摇床转速为200rpm,；在发酵26h把摇床转速提高到230rpm以提高发酵液的通气量；在发酵96h补加0.3g/L芝麻油、0.2g/L氨基乙酸（补加物料的质量与发酵培养基装液量体积比），培养7天得到发酵液；其中发酵培养基的装液量为摇瓶体积的20%；发酵培养基为(g/L)：50.0乳糖、10.0糊精、1.0的玉米浆、1.2MgSO₄·7H₂O、1.0KH₂PO₄·3H₂O、5NaCl；HPLC检测发酵液中提取的GA混合物发现含有72.00%的GA₄₊₇，GA₄：GA₇为2.7：0.8。 

一种赤霉菌及发酵生产赤霉素GA4+7的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。