专利摘要

本发明的目的在于提供能够用作核酸递送载体的阳离子性脂质、使用了阳离子性脂质的脂质膜结构体、及使用了阳离子性脂质的核酸导入剂、以及使用包含阳离子性脂质的核酸导入剂而实现核酸导入的方法。包含式(1)所示(式中各符号的定义如说明书中记载)的阳离子性脂质的脂质膜结构体的血液中稳定性、肿瘤聚集性优异。使用了该阳离子性脂质的核酸导入剂能够实现向细胞质内递送核酸的高核酸递送效率。

权利要求

1.式(1)所示的阳离子性脂质，

式(1)中，R1a及R1b独立地为碳原子数8以下的亚烷基或氧二亚烷基，

Xa及Xb独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、或醚键，

R2a及R2b独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素残基、或碳原子数13～23的脂肪族烃基。

2.根据权利要求1所述的阳离子性脂质，其中，R1a及R1b独立地为亚烷基。

3.根据权利要求1或2所述的阳离子性脂质，其中，Xa及Xb为酯键。

4.根据权利要求1或2所述的阳离子性脂质，其中，R2a及R2b独立地为脂溶性维生素残基、或碳原子数13～23的脂肪族烃基。

5.根据权利要求1或2所述的阳离子性脂质，其中，R2a及R2b独立地为脂溶性维生素残基。

6.根据权利要求1或2所述的阳离子性脂质，其中，R2a及R2b独立地为碳原子数13～23的脂肪族烃基。

7.脂质膜结构体，其包含权利要求1～6中任一项所述的阳离子性脂质作为膜的构成脂质。

8.核酸导入剂，其包含权利要求1～6中任一项所述的阳离子性脂质或权利要求7所述的脂质膜结构体。

9.核酸导入剂，其是在权利要求1～6中任一项所述的阳离子性脂质或权利要求7所述的脂质膜结构体中封入抗炎剂而成的。

10.将核酸递送到细胞内的方法，其包括：使包封有核酸的权利要求8或9所述的核酸导入剂与细胞在生物体外接触。

11.权利要求8或9所述的核酸导入剂在制备将核酸导入细胞内的方法中使用的药物中的用途，所述方法包括：将封入有核酸的权利要求8或9所述的核酸导入剂以递送至靶细胞的方式向生物体给药。

说明书

技术领域

本发明涉及改善了核酸递送效率的阳离子性脂质、包含该阳离子性脂质的脂质膜结构体、以及它们的用途。

背景技术

核酸治疗是将核酸(RNA)递送到细胞质内而抑制致病蛋白的表达的治疗法，基因治疗是将核酸(DNA)递送到细胞核内而促进对治疗有用的蛋白的表达的治疗法。在这些治疗法中，将核酸递送到细胞内是重要的。然而，单独的核酸会因血液中的酶的存在而迅速地分解，因此难以实现向细胞内的递送。为此，为了使这些治疗药物实用化，要求用于将核酸递送到细胞内的载体。

在将外来物质递送到细胞内这样的载体的性质方面，以较少的使用量发挥出显著的效果是必要的。即，对于核酸递送载体而言，要求提高被摄取到细胞质内的每单位载体对应的核酸的递送量，也就是要求提高向细胞质内的核酸递送效率。

以逆转录病毒及腺病毒为代表的病毒载体是核酸递送效率高的载体。但另一方面却存在着会因病毒载体插入至基因组而引起瘤的形成、或对靶细胞以外造成非特异性的影响这样的问题。从这些问题出发，非病毒载体的开发得到了进行。其中，使用了阳离子性脂质的核酸递送载体(脂质膜结构体)是最为普遍地被使用的非病毒载体。

对于使用了阳离子性脂质的核酸递送载体而言，为了提高其核酸递送效率，要求对体内动力学(例如，在血液中的稳定性、瘤等在靶细胞中的聚集性等)加以改善。进一步，为了提高核酸向细胞质内的递送效率，除了上述体内动力学以外，还需要对细胞内动力学(例如，细胞吸收、从核内体的逸出、细胞质内的核酸从载体的释放等)加以改善(非专利文献1)。

阳离子性脂质大致可区分为由疏水性部分和亲水性部分构成。作为其构成，疏水性部分已被采用的有脂肪酸基团、甾醇基等疏水性基团，亲水性部分已被采用的有氨基等阳离子性基团。作为阳离子性脂质的组成，较多地被已知的是相对于1个亲水性基团而包含2个疏水性基团的结构(以下称为“双链型阳离子性脂质”)。

如上所述，在使用了阳离子性脂质的核酸递送载体中，需要对体内动力学及细胞内动力学加以改善。已发现，由于核酸、细胞膜显示阴离子性，因此，与它们显示静电性相互作用的阳离子性脂质的阳离子性基团对于解决这些问题而言可起到重要的作用。因此，对于阳离子性脂质，已以阳离子性基团、即以氨基为中心而进行了开发。

为了改善细胞内动力学，已知有使用具有季铵的阳离子性脂质的方法。例如，在具有季铵的公知的双链型阳离子性脂质1,2-Dioleoyl-3-dimethylammonium propane(以下称为“DOTAP”)中，DOTAP的氨基可通过与显示阴离子性的核酸发生静电性相互作用而形成带正电的脂质膜结构体。该带正电的脂质膜结构体可通过与显示阴离子性的细胞膜发生相互作用而提高向细胞的摄入。然而，在具有季铵的DOTAP中，由于与核酸之间的静电性相互作用过强，因此存在核酸不易从载体中释放出来的问题(非专利文献2)。

另一方面，对于叔胺也进行了各种探讨。作为具有叔胺的公知的双链型阳离子性脂质，可列举1,2-Dioleoyl-3-dimethylamino propane(以下称为“DODAP”)。根据记载，DODAP可通过与核酸之间的静电性相互作用而形成脂质膜结构体，从而成为能够向靶细胞递送核酸的载体(非专利文献2)。

在非专利文献3中，针对体内动力学进行了阐述。在该文献中，将双链型阳离子性脂质的pKa调整到了中性附近。使用了该阳离子性脂质的脂质膜结构体显示出了下述性质：在静脉内注射后长时间在血液中稳定、聚集于瘤部位。

在非专利文献4中，针对细胞内动力学进行了阐述。在该文献中，记载了下述内容：对于双链型阳离子性脂质，通过改变氨基周边的结构，能够将作为脂质膜结构体的pKa调整为对于细胞内的核内体逸出有利的值。由此表明，核内体逸出得到促进、核酸递送效率提高。

另外，还针对具有疏水性基团和氨基数不同的叔氨基的阳离子性脂质进行了开发。例如，在专利文献1及3中，针对具有将包含1个疏水性基团和1个亲水性基团的化合物彼此间以显示生物降解性的二硫键连结而成的结构的阳离子性脂质进行了阐述。该文献中显示，该阳离子性脂质能够改善血液中稳定性、肿瘤靶向性等体内动力学。另外还阐明，该阳离子性脂质由于与作为公知的阳离子性脂质的DOTAP、DODAP相比显示出高核酸递送效率，因此能够实现核酸向细胞质内的递送效率的提高等细胞内动力学的改善。

然而，尽管在本领域已取得了这样的技术进展，利用使用了阳离子性脂质的脂质膜结构体所实现的向细胞质内的核酸递送效率仍然未能得到充分满足。

正如在专利文献2中阐述的那样，为了提高向细胞内的递送能力，大量地含有氨基是有用的。但是，由于大量地含有氨基时，会导致细胞内核酸从载体的释放受到抑制，因此无法期待核酸递送效率的改善。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2013/073480号

专利文献2：日本特开2011-121966号公报

专利文献3：US20140335157

非专利文献

非专利文献1：Molecular Therapy 13(4):786-794,2006

非专利文献2：Biomaterials 29(24-25):3477-96,2008

非专利文献3：Journal of Controlled Release 107:276-287,2005

非专利文献4：Nature Biotechnology 28:172-176,2010

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供能够用作核酸递送载体的阳离子性脂质、使用了阳离子性脂质的脂质膜结构体、及使用了阳离子性脂质的核酸导入剂。

另外，在于提供使用包含阳离子性脂质的核酸导入剂而实现核酸导入的方法。

解决问题的方法

为了提高向细胞质内的核酸递送效率，需要在使氨基数增加、从而使向细胞内的递送能力提高的同时，实现核酸在细胞质内的有效释放。

本发明人等着眼于该技术问题而进行了深入研究，结果发现，具有将包含疏水性基团和以哌嗪为叔胺的亲水性基团的化合物彼此间以二硫键连结而成的结构的阳离子性脂质(相对于2个疏水性基团而具有4个亲水性基团的结构、以下也称为本发明的阳离子性脂质)具有高核酸递送效率，进而完成了本发明。

即，本发明包含以下内容。

[1]一种阳离子性脂质，其以式(1)表示。

[化学式1]

(式(1)中，R1a及R1b独立地为碳原子数8以下的亚烷基或氧二亚烷基,

Xa及Xb独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、或醚键，

R2a及R2b独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素残基、或碳原子数13～23的脂肪族烃基)。

[2]上述[1]所述的阳离子性脂质，其中，R1a及R1b独立地为亚烷基。

[3]上述[1]或[2]所述的阳离子性脂质，其中，Xa及Xb为酯键。

[4]上述[1]～[3]中任一项所述的阳离子性脂质，其中，R2a及R2b独立地为脂溶性维生素残基或碳原子数13～23的脂肪族烃基。

[5]上述[1]～[4]中任一项所述的阳离子性脂质，其中，R2a及R2b独立地为脂溶性维生素残基。

[6]上述[1]～[4]中任一项所述的阳离子性脂质，其中，R2a及R2b独立地为碳原子数13～23的脂肪族烃基。

[7]一种脂质膜结构体，其包含[1]～[6]中任一项所述的阳离子性脂质作为膜的构成脂质。

[8]一种核酸导入剂，其包含[1]～[6]中任一项所述的阳离子性脂质或[7]所述的脂质膜结构体。

[9]一种核酸导入剂，其是在[1]～[6]中任一项所述的阳离子性脂质或[7]所述的脂质膜结构体封入抗炎剂而成的。

[10]一种将核酸递送到细胞内的方法，其包括：使包封有核酸的[8]或[9]所述的核酸导入剂与细胞在生物体外接触。

[11]将核酸导入细胞内的方法，其包括：将封入有核酸的[8]或[9]所述的核酸导入剂以递送至靶细胞的方式向生物体给药。

发明的效果

本发明涉及阳离子性脂质。该阳离子性脂质能够形成脂质膜结构体、并且能够制成包含该阳离子性脂质的核酸导入剂。就包含该阳离子性脂质的脂质膜结构体而言，由于能够使其pKa达到中性附近，因此具有血液中稳定性、肿瘤聚集性。另外，在细胞内的还原性环境中，本发明的阳离子性脂质中包含的二硫键将被切断，从而使内包物(核酸)的释放得到促进。因此，使用了本发明的阳离子性脂质的核酸导入剂能够实现向细胞质内递送核酸的高核酸递送效率。

另外，在使用本发明的阳离子性脂质或脂质膜结构体进行核酸导入时，由血清成分引起的核酸的分解得到抑制，因此对于在血清存在下的核酸导入、在生物体内的核酸导入而言是有利的。

附图说明

[图1]是示出了由各种阳离子性脂质(Myr-C3M、TS-C3M、TS-PZ4C2)制备的各种MEND(多功能性信封式纳米结构体)的基因表达活性的图。

[图2]是示出了由调整了Dex-Pal的内封量的TS-PZ4C2制备的MEND的基因表达活性的经时变化的图。

[图3]是示出了pDNA、或由封入有pDNA的市售的转染试剂制备的基因转染剂、以及由封入有pDNA的TS-PZ4C2制备的MEND经静脉给药后在肝脏中的基因表达活性的图。

[图4]是示出了由封入有pDNA的TS-C3M制备的MEND、或由TS-PZ4C2制备的MEND经静脉给药后在肝脏中的基因表达活性的图。

[图5]上段是示出了由搭载有脂溶性荧光色素的各种阳离子性脂质(Myr-C3M、TS-PZ4C2、L-PZ4C2、O-PZ4C2)制备的各种MEND经静脉给药后向各脏器及肿瘤的聚集性的照片。中段是示出了给药后24小时后的向肝脏的聚集量的图。下段是示出了给药后24小时后向肿瘤的聚集量的图。

[图6]是示出了由封入有pDNA的各种阳离子性脂质(Myr-C3M、L-PZ4C2、O-PZ4C2)制备的各种MEND经静脉给药后48小时后在肿瘤中的基因表达活性的图。

[图7]是示出了由封入有基因的L-PZ4C2制备的MEND经静脉给药后的抗肿瘤效果的图。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明，但本发明并不限定于这些实施方式。

本发明提供式(1)所示的化合物(以下也称为本发明的化合物或本发明的阳离子性脂质)。

R1a及R1b独立地表示碳原子数8以下的亚烷基或氧二亚烷基，优选为碳原子数8以下的亚烷基。

碳原子数8以下的亚烷基可以为直链状，也可以具有分支，但优选为直链状。该亚烷基中所含的碳原子数优选为6以下、最优选为4以下。作为碳原子数8以下的亚烷基，具体可列举：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、四亚甲基、亚异丁基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基等，优选为亚甲基、亚乙基、亚丙基、四亚甲基，最优选为亚乙基。

所述碳原子数8以下的氧二亚烷基，表示介入了醚键的亚烷基(亚烷基-O-亚烷基)，所存在的2个亚烷基的碳原子数的总和为8个以下。这里，所存在的2个亚烷基可以相同也可以不同，优选相同。作为碳原子数8以下的氧二亚烷基，具体可列举：氧二亚甲基、氧二亚乙基、氧二亚丙基、氧二亚丁基等。优选为氧二亚甲基、氧二亚乙基、氧二亚丙基，最优选为氧二亚乙基。

R1a可以与R1b相同也可以不同，但优选R1a是与R1b相同的基团。

Xa及Xb独立地为酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键，优选为酯键、酰胺键，最优选为酯键。Xa及Xb的成键的朝向并无限制，但在Xa及Xb为酯键的情况下，优选呈R2a-CO-O-R1a-及R2b-CO-O-R1b-结构。

Xa与Xb可以相同也可以不同，但优选Xa是与Xb相同的基团。

R2a及R2b独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素残基或碳原子数13～23的脂肪族烃基，优选为脂溶性维生素残基或碳原子数13～23的脂肪族烃基。最优选为脂肪族烃基。另外，从脏器(特别是肝脏)特异性这样的观点出发，还优选R2a及R2b为脂溶性维生素残基。

作为“甾醇残基”，可列举去除参与和Xa或Xb键合的反应性官能团(例如羟基)而成的源自甾醇或甾醇衍生物的残基，但优选为源自甾醇衍生物的残基。所述甾醇衍生物可列举例如：使甾醇的羟基与二羧酸中的一侧羧酸反应而成的甾醇半酯(此时，另一侧的羧酸成为反应性官能团)。甾醇可列举例如胆甾醇、胆甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇、及麦角甾醇等，优选为胆甾醇、或胆甾烷醇。作为二羧酸，可列举例如丙二酸、丁二酸、戊二酸、或己二酸等，优选为丁二酸或戊二酸。作为甾醇衍生物的具体例，可列举胆甾醇半丁二酸酯、胆甾醇半戊二酸酯等。

作为“脂溶性维生素残基”，可列举去除参与和Xa或Xb键合的反应性官能团(例如羟基)而成的源自脂溶性维生素或脂溶性维生素衍生物的残基，但优选为源自脂溶性维生素衍生物的残基。所述脂溶性维生素衍生物可列举使反应性官能团为羟基的脂溶性维生素的羟基与二羧酸中的一侧羧酸反应而成的脂溶性维生素半酯(此时，另一侧的羧酸成为反应性官能团)。作为脂溶性维生素，可列举例如视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆甾醇、钙化醇、胆钙化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速甾醇、生育酚、或生育三烯酚等，优选为视黄酸、或生育酚，最优选为生育酚。作为二羧酸，可列举丙二酸、丁二酸、戊二酸、及己二酸等，优选为丁二酸及戊二酸。作为脂溶性维生素衍生物的具体例，可列举生育酚半丁二酸酯、生育酚半戊二酸酯等。

碳原子数13～23的脂肪族烃基可以是直链的也可以具有分支，但优选为直链。该脂肪族烃基可以是饱和的也可以是不饱和的。对于不饱和烃基的情况而言，该脂肪族烃基中所含的不饱和键的个数为1～6个、优选为1～3个、最优选为1～2个。不饱和键包括碳-碳双键及三键，但优选为双键。对于直链的情况而言，该脂肪族烃基中所含的碳原子数优选为13～21、最优选为13～17。作为碳原子数13～23的脂肪族烃基，可列举例如：十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十二碳六烯基、甲基十二烷基、甲基十三烷基、甲基十四烷基、甲基十五烷基、甲基十七烷基、甲基十八烷基、甲基十九烷基、甲基二十烷基、甲基二十一烷基、甲基二十二烷基、乙基十一烷基、乙基十二烷基、乙基十三烷基、乙基十四烷基、乙基十五烷基、乙基十七烷基、乙基十八烷基、乙基十九烷基、乙基二十烷基、乙基二十一烷基、己基庚基、己基壬基、庚基辛基、庚基癸基、辛基壬基、辛基十一烷基、壬基癸基、癸基十一烷基、十一烷基十二烷基、六甲基十一烷基等。作为直链的碳原子数13～23的脂肪族烃基，优选为十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、二十一烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基，特别优选为十三烷基、十七烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基。作为分支的碳原子数13～23的脂肪族烃基，优选为甲基十五烷基、己基壬基、庚基癸基、辛基十一烷基、六甲基十一烷基，特别优选为甲基十五烷基、己基壬基、庚基癸基。

在一个实施方式中，碳原子数13～23的脂肪族烃基可采用源自脂肪酸、脂肪族醇、或脂肪族胺的基团。在R2a源自脂肪酸的情况下，Xa为酯键或酰胺键，源自脂肪族的羰基碳包含在Xa中。在R2b源自脂肪酸的情况下，Xb为酯键或酰胺键，源自脂肪族的羰基碳包含在Xb中。作为脂肪族烃基的具体例，在使用亚油酸作为脂肪酸的情况下，为十七碳二烯基，在使用油酸作为脂肪酸的情况下，为十七碳烯基。

R2a与R2b可以相同也可以不同，但优选R2a是与R2b相同的基团。

在一个实施方式中，R1a与R1b相同、Xa与Xb相同、R2a与R2b相同。

在一个实施方式中，

R1a及R1b独立地表示碳原子数8以下(碳原子数1～8)的亚烷基，

Xa及Xb表示酯键，

R2a及R2b独立地表示脂溶性维生素残基(例如，源自生育酚半丁二酸酯的基团)。

在一个实施方式中，

R1a及R1b独立地表示碳原子数8以下(碳原子数1～8)的亚烷基，

Xa及Xb表示酯键，

R2a及R2b独立地表示碳原子数13～23的脂肪族烃基(例如，十七碳二烯基、十七碳烯基)。

在一个实施方式中，

R1a及R1b表示碳原子数8以下(碳原子数1～8)的亚烷基，

Xa及Xb表示酯键，

R2a及R2b表示脂溶性维生素残基(例如，源自生育酚半丁二酸酯的基团)，

R1a与R1b相同、

R2a与R2b相同。

在一个实施方式中，

R1a及R1b表示碳原子数8以下(碳原子数1～8)的亚烷基，

Xa及Xb表示酯键，

R2a及R2b表示碳原子数13～23的脂肪族烃基(例如，十七碳二烯基、十七碳烯基)，

R1a与R1b相同、

R2a与R2b相同。

在一个实施方式中，

R1a及R1b表示亚乙基，

Xa及Xb表示-CO-O-，

R2a及R2b独立地表示脂溶性维生素残基(例如，源自生育酚半丁二酸酯的基团)。

在一个实施方式中，

R1a及R1b表示亚乙基，

Xa及Xb表示-CO-O-，

R2a及R2b独立地表示碳原子数13～23的脂肪族烃基(例如，十七碳二烯基、十七碳烯基)。

在一个实施方式中，

R1a及R1b表示亚乙基，

Xa及Xb表示-CO-O-，

R2a及R2b表示脂溶性维生素残基(例如，源自生育酚半丁二酸酯的基团)，

R2a与R2b相同。

在一个实施方式中，

R1a及R1b表示亚乙基，

Xa及Xb表示-CO-O-，

R2a及R2b表示碳原子数13～23的脂肪族烃基(例如，十七碳二烯基、十七碳烯基)，

R2a与R2b相同。

作为本发明的阳离子性脂质的具体例，可列举以下的TS-PZ4C2、L-PZ4C2、O-PZ4C2。

[表1]

以下，针对本发明的化合物的制造方法进行说明。

本发明的化合物具有-S-S-(二硫)键。因此，作为制造方法，可列举：在制造具有R2a-Xa-R1a-的SH(硫醇)化合物及具有R2b-Xb-R1b-的SH(硫醇)化合物之后，通过将这些化合物氧化(偶联)而得到包含-S-S-键的本发明的化合物的方法，由包含-S-S-键的化合物出发，依次合成必要的部分并最终获得本发明的化合物的方法等。优选为后一种方法。

将后一种方法的具体例列举如下，但制造方法并不限定于此。

作为起始化合物，可列举：包含-S-S-键的两末端羧酸、两末端胺、两末端异氰酸酯、两末端醇、具有甲磺酰基等离去基团的两末端醇、具有对硝基苯基碳酸酯基等离去基团的两末端碳酸酯等。

例如，在制造R1a及R1b为亚乙基、Xa及Xb相同地为X(酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、或醚键)、R2a及R2b相同地为R2(甾醇残基、脂溶性维生素残基、或碳原子数13～23的脂肪族烃基)的化合物的情况下，在使包含-S-S-键的化合物(I)中的两末端官能团与4位经由亚乙基而具有官能团的哌嗪衍生物(以下称为“化合物(II)”)的1位的仲氨基反应之后，通过使衍生物(II)中的官能团与包含R2-X的化合物(III)中的官能团反应，可得到包含-S-S-键、2个哌嗪骨架、R1a及R1b、X1a及X1b、及R2a及R2b的本发明的化合物。

在化合物(I)与化合物(II)的反应中，作为催化剂，可使用碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾等碱催化剂，也可以在无催化剂下进行。可优选使用碳酸钾或碳酸钠作为催化剂。

作为催化剂量，相对于化合物(I)为0.1～100mol当量、优选为0.1～20mol当量、更优选为0.1～5mol当量。相对于化合物(I)，化合物(II)的投料量为1～50mol当量、优选为1～10mol当量。

作为在化合物(I)与化合物(II)的反应中使用的溶剂，只要是不会破坏反应的溶剂、水溶液即可，可以没有特殊限制地使用。可列举例如：乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯等。这些中，优选甲苯、氯仿、乙腈。

反应温度为-20～150℃、优选为0～80℃、更优选为20～50℃。反应时间为1～48小时、优选为2～24小时。

使化合物(I)与化合物(II)的反应产物(以下称为反应产物(I))、和化合物(III)反应的情况下，如在化合物(I)与化合物(II)的反应中使用的催化剂那样，可以使用碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾等碱催化剂，也可以在对甲苯磺酸、甲磺酸等酸催化剂、或无催化剂下进行。

另外，可以使用二环己基碳二亚胺(以下称为“DCC”)、二异丙基碳二亚胺(以下称为“DIC”)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(以下称为“EDC”)等缩合剂而使反应产物(I)与化合物(III)直接反应，或者，也可以在使用缩合剂而将化合物(III)转变为酸酐之后再使其与反应产物(I)反应。

化合物(III)的投料量相对于反应产物(I)为1～50mol当量、优选为1～10mol当量。

在反应产物(I)与化合物(III)的反应中使用的催化剂可根据待反应的官能团彼此而适当选择。

催化剂量相对于反应产物(I)为0.05～100mol当量、优选为0.1～20mol当量、更优选为0.2～5mol当量。

作为在反应产物(I)与化合物(III)的反应中使用的溶剂，只要是不会破坏反应的溶剂、水溶液即可，可以没有特殊限制地使用。可列举例如乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯等。这些中，优选氯仿、甲苯。

反应温度为0～150℃、优选为0～80℃、更优选为20～50℃。反应时间为1～48小时、优选为2～24小时。

通过上述反应得到的反应物可通过萃取纯化、重结晶、吸附纯化、再沉淀、柱色谱法、离子交换色谱法等常规的纯化法进行适当纯化。

作为具体例，后述给出以具有-S-S-键、且在两末端具有甲磺酸酯基(MsO-)等离去基团的化合物为起始原料，在使其与1-哌嗪乙醇结合之后，与脂溶性维生素或脂肪酸结合的实施例(实施例1～3)。只要是本领域技术人员，则能够通过适当选择原料、并按照本说明书的实施例的方法进行反应而制造期望的本发明的化合物。

以下，针对本发明的脂质膜结构体进行说明。本发明的脂质膜结构体含有本发明的化合物、即上述通式(1)所示的化合物作为膜的构成物质。这里，本发明的所述“脂质膜结构体”是指，具有两亲性脂质的亲水基团朝着界面的水相侧排列的膜结构的粒子。所述“两亲性脂质”指的是具有显示亲水性的亲水性基团及显示疏水性的疏水性基团这两者的脂质。作为两亲性脂质，可列举例如：阳离子性脂质、磷脂等。

本发明的脂质膜结构体的形态没有特殊限定，但作为例如在水性溶剂中分散有本发明的阳离子性脂质的形态，可列举脂质体(例如单层脂质体、多层脂质体等)、O/W型乳液、W/O型乳液、球状胶束、蠕虫状胶束、或不特定的层状结构体等。本发明的脂质膜结构体优选为脂质体。

本发明的脂质膜结构体除了本发明的阳离子性脂质以外，还可以进一步含有除其以外的其它构成成分。作为该其它构成成分，可列举例如：脂质(磷脂(磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱等)、糖脂、肽脂、胆甾醇、本发明的阳离子性脂质以外的阳离子性脂质、PEG脂质等)、表面活性剂(例如，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]丙烷磺酸酯、胆酸钠盐、辛基葡糖苷、N-D-葡糖-N-甲基烷酰胺类等)、聚乙二醇、蛋白质等。本发明的脂质膜结构体中的该其它构成成分的含量通常为5～100mol％、优选为10～90mol％、更优选为30～70mol％。

本发明的脂质膜结构体中包含的本发明的阳离子性脂质的含量没有特殊限定，但通常，在将脂质膜结构体用作后述的核酸导入剂的情况下，可包含为了导入核酸而言充分量的本发明的阳离子性脂质。例如为总脂质的5～100mol％、优选为10～90mol％、更优选为30～70mol％。

本发明的脂质膜结构体可通过使本发明的阳离子性脂质及其它构成成分(脂质等)分散在适当的溶剂或分散介质、例如水性溶剂、醇性溶剂中，并根据需要进行诱导组装化的操作来制备。

作为“诱导组装化的操作”，可列举例如：乙醇稀释法、单纯水合法、超声波处理、加热、涡旋、醚注入法、法式压滤法、胆酸法、Ca2+融合法、冻融法、反相蒸发法等自身公知的方法，但并不限定于这些方法。

可以通过使核酸包封在包含本发明的阳离子性脂质的脂质膜结构体中、并使其与细胞接触，从而在生物体内和/或生物体外将该核酸导入该细胞内。因此，本发明提供包含上述本发明的阳离子性脂质或脂质膜结构体的核酸导入剂。

本发明的核酸导入剂可以将任意的核酸导入细胞内。作为核酸的种类，可列举DNA、RNA、RNA的嵌合核酸、DNA/RNA的杂合体等，但并不限定于这些。另外，核酸可以使用1～3根链的任意核酸，但优选为单链或双链。核酸也可以是作为嘌呤或嘧啶碱基的N-葡糖苷的其它类型的核苷酸、或具有非核苷酸骨架的其它低聚物(例如，市售的肽核酸(PNA)等)、或具有特殊键的其它低聚物(需要说明的是，该低聚物含有存在于DNA、RNA中那样的碱基配对、具有容许碱基附着的构型的核苷酸)等。此外，该核酸还可以是例如：施加了公知的修饰的核酸、具有本领域已知的标记的核酸、带有帽的核酸、经过了甲基化的核酸、将1个以上天然核苷酸用类似物取代而成的核酸、经过了分子内核苷酸修饰的核酸、具有无电荷键(例如，甲基磺酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的核酸、具有含电荷的键或含硫键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核酸、具有例如蛋白质(例如，核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、糖(例如，单糖等)等侧链基团的核酸、具有插入性化合物(例如，吖啶、补骨脂等)的核酸、含有螯合化合物(例如，金属、具有放射活性的金属、硼、氧化性的金属等)的核酸、含有烷基化剂的核酸、具有经过了修饰的键的核酸(例如，α异头型的核酸等)等。

能够在本发明中使用的DNA的种类没有特殊限制，可根据使用目的而适当选择。可列举例如质粒DNA、cDNA、反义DNA、染色体DNA、PAC、BAC等，优选为质粒DNA、cDNA、反义DNA，更优选为质粒DNA。质粒DNA等环状DNA可通过限制性内切酶等被消化，也可以用作线性DNA。

能够在本发明中使用的RNA的种类没有特殊限制，可根据使用目的而适当选择。可列举例如：siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、信使RNA(mRNA)、单链RNA基因组、双链RNA基因组、RNA复制子、转运RNA、核糖体RNA等，优选为siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反义RNA、RNA复制子。

对于本发明中使用的核酸，优选利用本领域技术人员通常使用的方法进行纯化。

在一个实施方式中，本发明中使用的核酸中，CpG序列的频度被抑制于低水平，优选不包含CpG序列。通过使用CpG序列的频度低的核酸，被导入到细胞内的核酸会长时间停留在细胞内，从而长时间保持其生理效应。例如，使用不包含CpG序列的质粒DNA(表达载体)作为在本发明中使用的核酸的情况下，能够使目标基因持续地表达更长时间。在本说明书中，所述CpG序列是从5’向3’在胞嘧啶之后出现鸟嘌呤的类型的2碱基序列。例如，本发明中使用的核酸中CpG序列的频度为每50个碱基有1个以下、优选为每100个碱基有1个以下、更优选为每1000个碱基有1个以下、最优选不包含CpG序列。

另外，CpG序列诱导先天免疫应答，因此通过在本发明中使用CpG序列的频度被抑制于低水平的核酸(优选为不包含CpG序列的核酸)，可以避免由先天免疫应答引起的炎症等副作用的发生。特别是，由于本发明的化合物或脂质膜结构体本身的刺激性低、在向生物体内给药时基本不会诱导产生炎性细胞因子，因此，通过将本发明的脂质膜结构体和CpG序列的频度被抑制于低水平的核酸(优选为不包含CpG序列的核酸)组合使用，能够将由先天免疫应答引起的炎症等副作用的发生风险抑制在最低限度。

本发明的核酸导入剂也可以和抗炎剂组合使用，另外，还可以使抗炎剂包封在脂质膜结构体中。与抗炎剂组合使用时，不仅能够将伴随核酸导入的副作用的发生风险抑制在最低限度，还能够如后述实施例中也阐明的那样进一步提高基因表达效率，因此是优选的实施方式。作为抗炎剂，可列举非甾体类抗炎剂(例如，布洛芬、酮洛芬、萘普生、吲哚美辛、阿司匹林、双氯芬酸、吡罗昔康、乙酰氨酚、塞来昔布、罗非昔布等)、甾体类抗炎剂(例如，氢化可的松、强的松龙、地塞米松、倍他米松等)，优选为甾体类抗炎剂。这些抗炎剂也可以根据给药方式而使用经过了衍生物化的那些。例如，地塞米松优选经过脂肪酸酯化，特别优选以地塞米松棕榈酸酯的形式使用。抗炎剂向脂质膜结构体的包封可以与后述的将核酸包封至脂质膜结构体的方法同样地进行。

出于例如疾病的预防和/或治疗的目的，可以将包封有核酸的本发明的核酸导入剂进行生物体内(in vivo)给药。因此，本发明中使用的核酸优选为对某种给定疾病具有预防和/或治疗活性的核酸(预防/治疗用核酸)。作为这样的核酸，可列举例如可用于所谓的基因治疗的核酸等。

为了使用本发明的核酸导入剂将核酸导入细胞内，在形成本发明的脂质膜结构体时，通过使目标的核酸共存而形成包封有该核酸的本发明的脂质膜结构体。例如，在利用乙醇稀释法形成脂质体的情况下，在将核酸的水溶液和本发明的脂质膜结构体的构成成分(脂质等)的乙醇溶液通过涡旋等剧烈地进行混合之后，利用适当的缓冲液对混合物进行稀释。在利用单纯水合法形成脂质体的情况下，将本发明的脂质膜结构体的构成成分(脂质等)溶解在适当的有机溶剂中，并将该溶液加入玻璃容器，通过进行减压干燥而将溶剂蒸馏除去，从而得到脂质薄膜。在向其中加入核酸的水溶液并使其发生水合之后，利用Sonicator进行超声波处理。本发明还提供这样的包封有核酸的上述脂质膜结构体。

作为包封有核酸的脂质体的实施方式之一，可列举通过将核酸与聚阳离子(例如，鱼精蛋白)间的静电性复合体封入脂质体而制备的多功能性信封式纳米结构体(MEND；multifunctional envelope-type nano device、以下称为“MEND”)(Kogure K et al.,Multifunctional envelope-type nano device(MEND)as a non-viral gene deliverysystem.Adv Drug Deliv Rev.2008)。该结构体(MEND)可作为用于将核酸等选择性地递送到特定的细胞内的药物递送系统使用，对于例如基于向树突细胞的抗原基因转染的DNA疫苗、肿瘤的基因治疗等而言是有用的。

包封有核酸的本发明的脂质膜结构体的粒径优选为10nm～300nm、更优选为100nm～200nm。粒径的测定可使用Zetasizer Nano(Malvern公司)进行。脂质膜结构体的粒径可通过脂质膜结构体的制备方法而适当调整。

包封有核酸的本发明的脂质膜结构体的表面电位(ξ电位)优选为-15～+10mV、进一步优选为-15～+5mV。在以往的基因转染中，主要被使用的是带正的表面电位的粒子。这作为用于促进具有负电荷的细胞表面与硫酸肝素之间的静电性相互作用、从而促进向细胞的摄取的方法是有用的，但正的表面电荷存在会在细胞内与递送核酸之间的相互作用而抑制核酸从载体的释放、或因mRNA与递送核酸之间的相互作用而抑制蛋白质的合成的可能性。通过将表面电荷调整至上述范围内，可以解决该问题。表面电荷的测定可使用Zetasizer Nano进行。脂质膜结构体的表面电荷可根据包含本发明的阳离子性脂质的脂质膜结构体的构成成分的组成而进行调整。

通过使包封有核酸的本发明的脂质膜结构体与细胞接触，可以将包封的核酸导入细胞内。该“细胞”的种类没有特殊限定，可使用原核生物及真核生物的细胞，但优选为真核生物。真核生物的种类也没有特殊限定，可列举例如：包括人类在内的哺乳类(例如，人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、鸟类(例如，鸡、鸵鸟等)、两栖类(例如，蛙等)、鱼类(例如，斑马鱼、青鳉鱼等)等脊椎动物、昆虫(蚕、蛾、果蝇等)等无脊椎动物、植物、微生物(例如，酵母等)等。在本发明中成为对象的细胞更优选为动物或植物细胞、进一步优选为哺乳动物细胞。该细胞可以是包含癌细胞的培养细胞系，也可以是从个体、组织中分离出的细胞、或组织或组织片的细胞。另外，细胞可以是贴壁细胞，也可以是非贴壁细胞。

以下，对使包封有核酸的本发明的脂质膜结构体与细胞在生物体外(in vitro)接触的工序进行具体说明。

对于细胞，可以在使其与该脂质膜结构体接触的数日前悬浮在适当的培养基中，并在适当的条件下进行培养。在与脂质膜结构体接触时，细胞可以是在增殖期，也可以不是在增殖期。

该接触时的培养液可以是含血清的培养基也可以是不含血清的培养基，但培养基中的血清浓度优选为30重量％以下、更优选为20重量％以下。培养基中包含过量的血清等蛋白质时，存在阻碍该脂质膜结构体与细胞的接触的可能性。

该接触时的细胞密度没有特殊限定，可考虑细胞的种类等而适当设定，但通常在1×104～1×107细胞/mL的范围。

在这样制备的细胞中，添加例如上述包封有核酸的本发明的脂质膜结构体的悬浮液。该悬浮液的添加量没有特殊限定，可考虑到细胞数等而适当设定。就与细胞接触时的脂质膜结构体的浓度而言，只要能够实现目标核酸向细胞内的导入则没有特殊限定，但以脂质浓度计，通常为1～10nmol/mL、优选为10～50nmol/mL，以核酸的浓度计，通常为0.01～100μg/mL、优选为0.1～10μg/mL。

将上述悬浮液添加至细胞后，对该细胞进行培养。培养时的温度、湿度、CO2浓度等可考虑到细胞的种类而适当设定。细胞为源自哺乳动物的细胞的情况下，通常，温度约为37℃、湿度约为95％、CO2浓度约为5％。另外，培养时间也可以考虑到所使用的细胞的种类等条件而适当设定，但通常为0.1～24小时的范围、优选为0.2～4小时的范围、更优选为0.5～2小时的范围。上述培养时间如果过短，则可能导致核酸无法充分导入细胞内，培养时间如果过长，则可能导致细胞变弱。

通过上述培养，核酸被导入细胞内，但优选将培养基交换为新鲜的培养基、或向培养基中添加新鲜的培养基而进一步继续培养。细胞为源自哺乳动物的细胞的情况下，新鲜的培养基优选包含血清或营养因子。

另外，通过如上所述地使用本发明的脂质膜结构体，不仅在生物体外(in vitro)、在生物体内(in vivo)也能够将核酸导入细胞内。即，通过将包封有核酸的本发明的脂质膜结构体向对象给药，可使该脂质膜结构体到达并接触靶细胞，从而在生物体内将包封在该脂质膜结构体中的核酸导入细胞内。作为能够给药该脂质膜结构体的对象，没有特殊限定，可列举例如：哺乳类(例如，人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、鸟类(例如，鸡、鸵鸟等)、两栖类(例如，蛙等)、鱼类(例如，斑马鱼、青鳉鱼(rice-fish)等)等脊椎动物、昆虫(例如，蚕、蛾、果蝇等)等无脊椎动物、植物等。作为本发明的脂质膜结构体的给药对象，优选为人或其它哺乳动物。

靶细胞的种类没有特殊限定，通过使用本发明的脂质膜结构体，可以向各种组织(例如，肝脏、肾脏、胰脏、肺、脾脏、心脏、血液、肌肉、骨、脑、胃、小肠、大肠、皮肤、脂肪组织等，优选为肝脏、肾脏、脾脏)中的细胞导入核酸。

本发明的阳离子性脂质及包含该阳离子性脂质的脂质膜结构体具有肿瘤聚集性，因此，对于肿瘤、尤其是恶性肿瘤的治疗是有用的。作为这样的恶性肿瘤，可列举例如：纤维肉瘤、鳞状细胞癌、神经芽细胞瘤、乳腺癌、胃癌、肝细胞癌、膀胱癌、甲状腺肿瘤、尿路上皮癌、神经胶母细胞瘤、急性髓细胞性白血病、胰腺癌及前列腺癌等，但并不限定于这些。

另外，本发明的脂质膜结构体中，核酸以外的化合物(例如，抗癌剂等)可与核酸一起、或单独地被导入。作为向导入了核酸以外的化合物的脂质膜结构体的对象(例如，脊椎动物、无脊椎动物等)的给药方法，只要是能够使该脂质膜结构体到达并接触靶细胞，从而将导入至该脂质膜结构体的化合物导入细胞内的方法则没有特殊限定，可考虑导入化合物的种类、靶细胞的种类、部位等而适当选择本身公知的给药方法(例如，口服给药、非口服给药(例如，静脉内给药、肌内给药、局部给药、经皮给药、皮下给药、腹腔内给药、喷雾等)等)。该脂质膜结构体的给药量只要在能够实现化合物向细胞内的导入的范围则没有特殊限定，可考虑到给药对象的种类、给药方法、导入化合物的种类、靶细胞的种类、部位等而适当选择。

将本发明的阳离子性脂质或脂质膜结构体作为核酸导入剂使用的情况下，可以按照常规方法进行制药。

提供该核酸导入剂作为研究用试剂的情况下，该本发明的核酸导入剂可以直接、或使用与例如水或除水以外的生理学上可接受的液体(例如，水溶性溶剂(例如，苹果酸缓冲液等)、有机溶剂(例如，乙醇、甲醇、DMSO等)或水溶性溶剂与有机溶剂的混合液等)形成的无菌性溶液或悬浮液而提供本发明的脂质膜结构体。本发明的核酸导入剂可适当地包含本身公知的生理学上可接受的添加剂(例如，赋形剂、媒介物(vehicle)、防腐剂、稳定剂、结合剂等)。

另外，提供该核酸导入剂作为药物的情况下，该本发明的核酸导入剂可以直接使用本发明的脂质膜结构体、或通过将本发明的脂质膜结构体与药学上可接受的公知添加剂(例如，担载体、香味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、稳定剂、结合剂等)一起使用并将它们以常规认可的制药实施所要求的单位用量形式进行混和而以口服剂(例如，片剂、胶囊剂等)或非口服剂(例如注射剂、喷雾剂等)的形式、优选以非口服剂(更优选为、注射剂)的形式制造。

本发明的核酸导入剂除了可用于成人以外，还可以作为儿科用制剂。

本发明的核酸导入剂也可以以试剂盒的形式提供。该试剂盒中除了本发明的阳离子性脂质或脂质膜结构体以外，还可以包含在导入核酸时使用的试剂。在一个实施方式中，本发明的核酸导入剂(或试剂盒)进一步包含聚阳离子(例如，鱼精蛋白)。通过使用该实施方式的本发明的核酸导入剂(或试剂盒)，可以容易地将核酸与聚阳离子(例如，鱼精蛋白)间的静电性复合体封入本发明的脂质膜结构体而构成MEND，从而用于核酸向细胞内的导入。

实施例

以下，针对本发明的实施例进行更为详细的说明，但本发明完全不受到该实施例的限定。

在实施例的说明中使用的简称的含义分别如下所述。

pDNA：质粒DNA

Chol：胆甾醇

PEG2000-DMG：1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(PEG MW 2000)

PEG2000-DSG：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(PEG MW 2000)

PEG5000-DSG：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(PEG MW 5000)

DOPE：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺

SOPC：1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱

Dex-Pal：地塞米松棕榈酸酯

DiR：1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚三羰花青

PBS：磷酸缓冲生理盐水

15PGDH：15-羟基前列腺素脱氢酶

表2中示出了在下述实施例及比较例中制造的阳离子性脂质的名称和结构。比较例1及2分别是基于专利文献1的实施例1及实施例5而制造的。

[表2]

[实施例1]TS-PZ4C2的合成

<甲磺酰化>

将双(2-羟基乙基)二硫醚15g(东京化成工业公司制)(97mmol)加入到乙腈143mL中，并于20～25℃使其溶解。加入三乙胺33.3g(关东化学公司制)(328mmol)之后，边搅拌边冷却至10℃。以使温度在20℃以下的方式花费1小时滴加了甲磺酰氯34.5g(关东化学公司制)(300mmol)。滴加结束后，于20～25℃进行了3小时反应。通过TLC分析(展开溶剂:氯仿、碘显色)而确认到双(2-羟基乙基)二硫醚的斑点消失，结束了反应。向反应溶液中加入乙醇29mL，使反应停止之后，通过过滤而滤除了不溶物。向滤液中加入10％碳酸氢钠水溶液150g，搅拌5分钟之后，静置了10分钟。将水层除去之后，进一步进行了4次利用碳酸氢钠水溶液的萃取纯化。向所得有机层中加入硫酸镁4.5g，进行了脱水。通过过滤而滤除了不溶物后，使用蒸发仪将滤液的溶剂蒸馏除去，得到了褐色固体(以下称为“di-Ms体”)29.4g。

<1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)>

所得化合物di-Ms体的1H-NMR谱的分析结果如下所示。

δ2.95～3.20ppm(m、CH3-SO2-O-CH2-CH2-S-、10H)、δ4.45～4.50ppm(t、CH3-SO2-O-CH2-CH2-S-、4H)

<叔氨基化>

向di-Ms体1.2g(4mmol)中加入乙腈31mL，于20～25℃使其溶解之后，加入碳酸钾1.3g(关东化学工业公司制)(10mmol)，并进行了5分钟搅拌。其后，加入4-哌嗪乙醇5.0g(东京化成工业公司制)(39mmol)，于25～35℃进行了13小时反应。通过TLC分析(展开溶剂:氯仿/甲醇/28％氨水＝80/20/2(v/v/v)、碘显色)而确认到di-Ms体的斑点消失，结束了反应。通过过滤而滤除了不溶物后，利用蒸发仪将滤液的溶剂蒸馏除去。将所得褐色液体溶解在氯仿25mL中之后，加入蒸馏水25mL并进行了5分钟搅拌。搅拌后，静置10分钟，然后除去了水层。其后，进一步进行了2次利用蒸馏水的萃取纯化。向所得有机层中加入硫酸镁0.6g，进行了脱水。通过过滤而滤除了不溶物后，使用蒸发仪将滤液的溶剂蒸馏除去，得到了淡黄色的液体(以下称为“di-PZ4C2体”)1.0g。

<1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)>

所得化合物di-PZ4C2体的1H-NMR谱的分析结果如下所示。

δ2.40～2.66ppm(m、HO-CH2-CH2-N-CH2-CH2-N-、20H)、δ2.67～2.72ppm(m、-N-CH2-CH2-S-、4H)、2.74～2.85ppm(m、HO-CH2-、-N-CH2-CH2-S-、6H)、3.60～3.65ppm(t、HO-CH2-CH2-、4H)

<酰基化>

将di-PZ4C2体3.0g(8mmol)和D-α-生育酚丁二酸酯8.4g(SIGMA-ALDRICH公司制)(16mmol)于20～25℃溶解在氯仿45mL中。其后，加入4-二甲基氨基吡啶0.4g(广荣化学工业公司制)(3mmol)、EDC4.6g(东京化成工业公司制)(24mmol)，于30℃进行了4小时反应。通过TLC分析(展开溶剂:氯仿/甲醇＝9/1(v/v)、磷酸硫酸铜显色)而确认到D-α-生育酚丁二酸酯的斑点消失，结束了反应。利用蒸发仪将反应溶剂蒸馏除去之后，加入了己烷200mL。其后，加入乙腈100mL，并进行了5分钟搅拌。静置10分钟之后，回收己烷层，利用蒸发仪将溶剂蒸馏除去，得到了淡黄色的液体10.7g。将该液体9.0g利用硅胶柱色谱法进行纯化(溶离液:氯仿/甲醇＝99/1～98/2(v/v))，得到了作为目标物的5.7g的TS-PZ4C2。

<1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)>

所得化合物TS-PZ4C2的1H-NMR谱的分析结果如下所示。

δ0.83～0.88ppm(m、(CH3)2CH-(CH2)3-(CH3)CH-(CH2)3-(CH3)CH-、24H)、δ1.03～1.82ppm(m、(CH3)2CH-(CH2)3-(CH3)CH-(CH2)3-(CH3)CH-(CH2)3-(CH3)C-、-C-CH2-CH2-C-C-O-、52H)、δ1.95～2.09ppm(m、Ar-CH3、18H)、δ2.40～2.60ppm(m、-N-CH2-CH2-N-、-C-CH2-CH2-C-C-O-、20H)、δ2.61～2.68ppm(m、-O-CH2-CH2-N-、-N-CH2-CH2-S-、8H)、δ2.75～2.84ppm(m、Ar-O-C(O)-CH2-、-N-CH2-CH2-S-、8H)、δ2.91～2.95ppm(m、Ar-O-C(O)-CH2-CH2-、4H)、δ4.21～4.25ppm(t、-C(O)-CH2-CH2-N-、4H)

[实施例2]L-PZ4C2的合成

<酰基化>

将di-PZ4C2体2.5g(7mmol)和亚油酸3.7g(日油公司制)(13mmol)于20～25℃溶解在氯仿25mL中。其后，加入4-二甲基氨基吡啶0.3g(3mmol)、EDC3.8g(20mmol)，并于30℃进行了4小时反应。通过TLC分析(展开溶剂:氯仿/甲醇＝9/1(v/v)、磷酸硫酸铜显色)而确认到亚油酸的斑点消失，结束了反应。利用蒸发仪将反应溶剂蒸馏除去之后，加入了己烷57mL。其后，加入乙腈24mL，并进行了5分钟搅拌。静置10分钟之后，回收己烷层，利用蒸发仪将溶剂蒸馏除去，得到了淡黄色的液体4.9g。将该液体4.9g利用硅胶柱色谱法进行纯化(溶离液:氯仿/甲醇＝99/1～97/3(v/v))，得到了作为目标物的3.1g的L-PZ4C2。

<1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)>

所得化合物L-PZ4C2的1H-NMR谱的分析结果如下所示。

δ0.87～0.91ppm(t、CH3-(CH2)3-CH2-、6H)、δ1.25～1.38ppm(m、CH3-(CH2)3-CH2-、-(CH2)4-CH2-CH2-C(O)-、28H)、δ1.58～1.63ppm(m、-(CH2)4-CH2-CH2-C(O)-、4H)、δ2.00～2.07ppm(m、-CH2-CH＝CH-CH2-CH＝CH-CH2-、8H)、δ2.30～2.32ppm(t、-(CH2)4-CH2-CH2-C(O)-、4H)、δ2.50～2.70ppm(m、-N-CH2-CH2-N-、-N-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-N-、24H)、δ2.75～2.84ppm(m、-CH＝CH-CH2-CH＝CH-、-N-CH2-CH2-S-、8H)、δ4.18～4.21ppm(t、-O-CH2-CH2-N-、4H)、δ5.30～5.41ppm(m、-CH2-CH＝CH-CH2-CH＝CH-CH2-、8H)

[实施例3]O-PZ4C2的合成

将di-PZ4C2体0.8g(2mmol)和油酸1.2g(日油公司制)(4mmol)于20～25℃溶解在氯仿8mL中。其后，加入4-二甲基氨基吡啶0.1g(1mmol)、EDC1.2g(6mmol)，并于30℃进行了3小时反应。通过TLC分析(展开溶剂:氯仿/甲醇＝9/1(v/v)、磷酸硫酸铜显色)而确认到油酸的斑点消失，结束了反应。利用蒸发仪将反应溶剂蒸馏除去之后，加入了己烷12mL。其后，加入乙腈5mL，并进行了5分钟搅拌。静置10分钟之后，回收己烷层，利用蒸发仪将溶剂蒸馏除去，得到了淡黄色的液体1.8g。将该液体1.7g利用硅胶柱色谱法进行纯化(溶离液:氯仿/甲醇＝99/1～97/3(v/v))，得到了作为目标物的1.1g的O-PZ4C2。

<1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)>

所得化合物O-PZ4C2

阳离子性脂质专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。