专利摘要

本发明公开了一种黄葵内酯的制备方法。该方法是从药用真菌槐生多年卧孔菌(Perenniporiarobiniophila(Murrill)Rvarden)制取大环麝香类名贵天然香料黄葵内酯。以野生的或人工栽培或发酵培养的槐生多年卧孔菌为原料，通过有机溶剂提取，冷冻脱蜡，碱洗去除游离酸，柱色谱分离纯化等步骤得到黄葵内酯。所得黄葵内酯产品具有浓郁优雅的麝香香气，可作为定香剂和增效剂应用于日用及食用香精中。

权利要求

1.一种通过人工培养槐生多年卧孔菌Perenniporia robiniophila(Murrill)Ryvarden制取黄葵内酯的方法，其特征是该方法包含以下工艺步骤：

(1)从生长于刺槐Robinia pseudoacacia的活树上的野生槐生多年卧孔菌子实体分离纯化得到槐生多年卧孔菌菌种；

(2)菌种以马铃薯200克，蔗糖20克，酵母浸膏20克，琼脂15克，硫酸镁2克，磷酸二氢钾3克，维生素B1为0.01克，加水至1升，pH＝6.0，为培养基，在25℃暗处培养8天-10天，得到药用真菌槐生多年卧孔菌培养总物；

(3)得到的培养总物用5倍乙醇充分萃取3次，每次萃取24小时，过滤，滤液合并，冷却至0℃左右，待沉淀析出完全后滤除，滤液于50℃以下减压浓缩回收乙醇，得到粗膏；

(4)粗膏用石油醚溶解后，用5％碳酸氢钠水溶液或5％碳酸钠水溶液或1％氢氧化钠水溶液洗去游离酸，再用饱和食盐水洗至中性，分去水层得到石油醚萃取液；

(5)石油醚萃取液用无水硫酸钠或无水硫酸镁脱水干燥后，于50℃以下减压浓缩回收石油醚，得到浸膏；

(6)浸膏用10-12倍无水乙醇充分溶解，一步冷冻到-20℃左右，待沉淀全部析出后滤除，滤液于50℃以下减压浓缩回收乙醇后，得到净油；

(7)净油经硅胶柱色谱纯化，以体积比100∶0-90∶10石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，薄层色谱跟踪，得到无色油状黄葵内酯。

说明书

技术领域

本发明是关于一种黄葵内酯的制备方法。更具体地说，本发明是通过人工培养药用真菌槐生多年卧孔菌(Perenniporia robiniophila(Murrill)Rvarden)制备天然香料黄葵内酯，属于香精香料技术领域。

背景技术

黄葵内酯(ambrettolide)又称麝葵内酯、葵籽麝香，存在于锦葵科植物黄葵(Ablemoschus moschauts(L.)Mdeic)的种子中，化学名为(Z)-1-氧杂环十七碳-8-烯-2-酮，分子式为C₁₆H₂₈O₂，CAS登录号123-69-3，结构式为：

其中，数字1-17为环原子系统编号。

黄葵内酯是一种名贵的大环麝香香料，具有强烈的麝香香气，广泛应用于日用和食用香精中，具有定香剂和增效剂的作用。由于受资源的限制，黄葵内酯难以大量生产，因而人们一直致力于研究其人工合成。虽然人们已研究开发出许多合成路线可以合成黄葵内酯，但因为合成步骤长和合成条件要求苛刻导致合成产品成本较高，难以推广应用于工业生产。

发明内容

本发明的目的是为香精香料行业提供一种从药用真菌槐生多年卧孔菌(Perenniporia robiniophila(Murrill)Rvarden)制取黄葵内酯的方法。

本发明的另一目的是提供一种通过人工培养槐生多年卧孔菌制取黄葵内酯的工艺。

本发明的再一目的是为槐生多年卧孔菌的人工培养提供一种培养条件。

本发明为了达到上述目的而采用的技术解决方案如下：

本发明所述一种黄葵内酯的制备方法，是从药用真菌槐生多年卧孔菌制取黄葵内酯。具体是，通过人工培养药用真菌槐生多年卧孔菌获得子实体或菌丝体，进一步通过提取分离纯化制备大环麝香类香料黄葵内酯，该方法包含以下工艺步骤：

(1)药用真菌槐生多年卧孔菌经人工培养得到子实体或菌丝体；

(2)取槐生多年卧孔菌子实体或菌丝体，用有机溶剂提取；

(3)提取液合并，冷却至0℃左右，待沉淀析出完全后滤除；

(4)滤液于50℃以下减压浓缩回收溶剂，得到粗膏；

(5)粗膏用石油醚溶解后，用碳酸氢钠水溶液或碳酸钠水溶液或氢氧化钠水溶液洗去游离酸，再用水洗至中性，分去水层得到石油醚萃取液；

(6)石油醚萃取液用无水硫酸钠或无水硫酸镁脱水干燥后，于50℃以下减压浓缩回收石油醚，得到浸膏；

(7)浸膏用无水乙醇溶解，一步冷冻到-20℃左右，待沉淀全部析出后滤除，滤液于50℃以下减压浓缩回收乙醇后，得到净油；

(8)净油经硅胶柱色谱纯化，得到黄葵内酯。

其中步骤(1)槐生多年卧孔菌的培养条件是：以马铃薯200克，蔗糖20克，酵母浸膏20克，琼脂15克，硫酸镁2克，磷酸二氢钾3克，维生素B1 0.01克，加水至1升，pH＝6.0，为培养基，在25℃暗处培养8天-10天。

其中步骤(2)所述有机溶剂选自石油醚、乙醚、乙酸乙酯、乙醇中的一种，或它们的混合物。

与现有技术相比，本发明具有如下突出优点：

1.药用真菌槐生多年卧孔菌来源丰富，可以通过人工栽培和工业发酵生产，与从黄葵种籽制取黄葵内酯相比，本发明没有原材料的后顾之忧。

2.与人工合成黄葵内酯相比，本发明使用原料价廉易得，制取工艺简单方便，可以规模化生产，产品成本更加低廉。

3.与人工合成黄葵内酯相比，本发明从药用真菌槐生多年卧孔菌制取的黄葵内酯，属于天然香料，更受消费者喜爱。

附图说明

图1黄葵内酯化学结构式。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：槐生多年卧孔菌的培养

菌种：药用真菌槐生多年卧孔菌(Perenniporia robiniophila(Murrill)Rvarden)菌种是从生长于刺槐(Robinia pseudoacacia)的活树上的野生槐生多年卧孔菌子实体分离纯化得到，属于真菌界中的多孔菌目多孔菌科多年卧孔菌属Perenniporia高等真菌。

培养条件：在以综合马铃薯培养基(CPDA培养基)为基础培养基的基础上，通过单因素法研究了碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉和玉米淀粉)、氮源(酵母浸膏、蛋白胨、牛肉浸膏、尿素和硫酸铵)、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、pH值、培养时间和培养温度等因素对菌丝生长情况的影响，得到槐生多年卧孔菌最佳培养条件为：以马铃薯200克，蔗糖20克，酵母浸膏20克，琼脂15克，硫酸镁2克，磷酸二氢钾3克，维生素B1 0.01克，加水至1升，pH＝6.0，为培养基，在25℃暗处培养8天-10天。

培养方法：将槐生多年卧孔菌菌种接种到灭菌后冷却至室温的培养基中，在25℃暗处静置培养8天-10天。

实施例2：槐生多年卧孔菌净油的制备

在室温搅拌下，将实施例1得到的培养总物用5倍乙醇充分萃取3次，每次萃取24小时，过滤。滤液合并，冷却至0℃左右，待沉淀析出完全后滤除，滤液于50℃以下减压浓缩回收乙醇，得到粗膏。

粗膏用石油醚溶解后，用5％碳酸氢钠水溶液或5％碳酸钠水溶液或1％氢氧化钠水溶液洗去游离酸，再用饱和食盐水洗至中性，分去水层得到石油醚萃取液。

石油醚萃取液用无水硫酸钠或无水硫酸镁脱水干燥后，于50℃以下减压浓缩回收石油醚，得到浸膏。

浸膏用10-12倍无水乙醇充分溶解，一步冷冻到-20℃左右，待沉淀全部析出后滤除，滤液于50℃以下减压浓缩回收乙醇后，得到净油。

实施例3：黄葵内酯的分离纯化

净油用硅胶柱色谱纯化，石油醚-乙酸乙酯(100∶0-90∶10，v/v)梯度洗脱，薄层色谱跟踪，得到无色油状黄葵内酯。其波谱数据如下：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ5.32(t，2H，J＝4.6Hz，H-8，9)，4.13(t，2H，J＝5.4Hz，H-17)，2.32(t，2H，J＝6.4Hz，H-3)，2.05(m，4H，H-7，10)，1.63(m，4H，H-6，11)，1.33(m，14H，H-4，5，12，13，14，15，16)。

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ174.05(s，C-2)，130.31(d，C-8或C-9)，130.15(d，C-9或C-8)，63.82(t，C-17)，34.64(t，C-3)，29.52(t，C-7或C-10)，28.90(t，C-10或C-7)，28.81(t)，28.62(t)，28.56(t)，28.47(t)，27.76(t)，27.05(t)，26.91(t)，25.43(t)，25.37(t)(C-4，5，12，13，14，15，16)。

EI-MS(m/z)：252[M]⁺。

本发明的创造性和创新性在于首次从药用真菌槐生多年卧孔菌制备得到天然香料黄葵内酯。本发明还提供了一种用于槐生多年卧孔菌人工培养的培养条件和一种从槐生多年卧孔菌制取黄葵内酯的工艺，这既是本发明的创造之处，也是本发明的创新之处。

一种黄葵内酯的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。