专利摘要

本发明公开了一种离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法，其特征在于包括如下步骤：构建反胶束体系；利用反胶束体系对含纤维素酶的离子液体溶液中的酶进行回收，然后用盐溶液反向萃取至水相，获得含纤维素酶的离子液体溶液中的纤维素酶。本发明方法获得的纤维素酶可继续用于酶解反应，在回收酶的同时，使酶与离子液体分开，有利于离子液体这种高值处理溶剂的回收利用。

权利要求

1.一种离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法，其特征在于包括如下步骤：构建反胶束体系；利用反胶束体系对含纤维素酶的离子液体溶液中的酶进行回收，然后用盐溶液反向萃取至水相，获得含纤维素酶的离子液体溶液中的纤维素酶。

2.根据权利要求1所述的离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法，其特征在于：所述反胶束体系为Triton X-100/二甲苯、正己醇反胶束体系、AOT/异辛烷反胶束体系或CTAB/异辛烷/正己醇反胶束体系。

3.根据权利要求1所述的离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法，其特征在于：所述含纤维素酶的离子液体溶液为将纤维素酶加入到离子液体/纤维素体系中进行原位酶解后的溶液。

4.根据权利要求1或3所述的离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法，其特征在于：所述含纤维素酶的离子液体溶液中，离子液体的比例为10-30%(v/v)。

5.根据权利要求1或3所述的离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法，其特征在于：所述含纤维素酶的离子液体溶液的pH值为4.0-5.0。

6.根据权利要求1或3所述的离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法，其特征在于：所述含纤维素酶的离子液体溶液中，纤维素酶的浓度为3-16FPU/mL。

7.根据权利要求1所述的离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法，其特征在于：所述盐溶液为KCl或NaCl溶液。

说明书

技术领域

本发明涉及一种离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法。

背景技术

石油等不可再生资源的日益短缺和石化工业造成的污染问题日益严重。纤维素是地球上含量最多的天然有机物，全球每年的产量为1000-1500亿吨，秸秆等天然纤维素材料丰富的可再生资源备受人们关注。然而天然生物质材料在制备燃料过程中存在一种主要困难，天然纤维素中存在着较高的结晶度和分子间与分子内存在大量的氢键，导致其不溶于普通溶剂，这已成为纤维素材料应用的最大障碍之一。因此目前人们正在寻找新型绿色的纤维素材料的溶剂，以期破坏纤维素材料的紧密结构达到高效利用天然纤维素材料的目的。

秸秆中纤维素大多以结晶态存在，加上木质素的缠绕和包裹，不溶于水，在环境中比较稳定，从而形成了微生物降解和酶降解纤维素的强大障碍。因此，对其进行适当的预处理是高效利用秸秆的重要措施，可以进一步降低纤维素酶生产成本，提高效率。预处理目的就是破坏木质素的包裹作用以及纤维素的结晶结构，使纤维素易于酶解转化为可发酵糖，它是实现天然植物纤维制备生物能源的重要过程。以往溶解和分离木质纤维素时多用酸、碱溶液和有机溶剂，这些溶剂体系普遍存在着污染重、成本高和回收率低等问题。

离子液体作为一种室温或近室温条件下熔融的盐，近年来开始应用于纤维素材料的开发中，取得了较大的研究进展。离子液体是绿色的溶剂，而且离子液体处理过的纤维素材料易于酶解，因此离子液体预处理纤维素材料的研究成为目前的研究热点。近3年来人们开发了离子液体体系中纤维素酶原位酶解技术。离子液体体系中纤维素酶原位酶解技术的应用首先采用离子液体预处理纤维素材料，然后不分离离子液体，将纤维素酶加入离子液体/纤维素体系中进行原位酶解。原位酶解技术减少了工艺步骤，避免了纤维素原料在操作过程中的损失，这项技术以天然植物纤维中生物量全利用为目的，是对预处理技术的深化和提升。

但是纤维素酶添加至离子液体体系中造成了离子液体这种高价值预处理剂的回收困难，纤维素酶也难于回收利用。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于针对上述技术难题，提供一种离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法，既可以将纤维素酶回收再利用，又有利于离子液体的回收和纯化。

技术方案：本发明所述离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法，包括如下步骤：构建反胶束体系；利用反胶束体系对含纤维素酶的离子液体溶液中的酶进行回收，然后用盐溶液反向萃取至水相，获得含纤维素酶的离子液体溶液中的纤维素酶。该反胶束体系提取的酶为浓度为30-500FPU/g底物的纤维素酶。

优选的，所述反胶束体系为Triton X-100/二甲苯、正己醇反胶束体系、AOT/异辛烷反胶束体系或CTAB/异辛烷/正己醇反胶束体系。

所述含纤维素酶的离子液体溶液为将纤维素酶加入到离子液体/纤维素体系中进行原位酶解后的溶液。

所述含纤维素酶的离子液体溶液中，离子液体的比例为10-30%(v/v)。

所述含纤维素酶的离子液体溶液的pH值为4.0-5.0。

所述含纤维素酶的离子液体溶液中，纤维素酶的浓度为3-16FPU/mL。

所述盐溶液为KCl或NaCl等无机盐溶液。

有益效果：1、本发明方法获得的纤维素酶可继续用于酶解反应，在回收酶的同时，使酶与离子液体分开，有利于离子液体这种高值处理溶剂的回收利用；2、本发明的酶回收方法萃取效率高、成本低，液液萃取有利于大规模应用，适于工业化生产。

具体实施方式

下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例1  玉米秸秆的离子液体/纤维素酶体系中纤维素酶的回收

（1）离子液体/纤维素酶原位降解秸秆工艺：利用离子液体1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸盐([EMIM]DEP)在130℃条件下处理玉米秸秆，冷却后在离子液体中加入水和纤维素酶酶粉，用氨水调节pH为4.8，使离子液体的终浓度为10%（v/v），纤维素酶的终浓度为12.5FPU/mL。

（2）反胶束体系的构建：吸取2ml二甲苯和4ml正己醇于试管中互溶，称取0.97g Triton X-100溶液溶于二甲苯、正己醇混合液中，并轻轻震荡试管，混合液体澄清透明即可。然后向混合液中加入27μml一定pH的酶缓冲溶液，得到ω_o=1的反胶束体系。充分震荡试管直至试管底部没有无色透明分层液体，且混合溶液为澄清透明，则为250mmol/L的Triton X-100/二甲苯、正己醇（1:2，v/v）反胶束溶液。

（3）反胶束体系回收纤维素酶：利用反胶束体系对步骤（1）中的pH4.8的纤维素酶/10%（v/v）的离子液体体系中的纤维素酶进行回收，然后进行反萃，将上层有机相加入到另一具塞三角瓶中，加入2倍体积的反萃液(1mol/L KCl的水溶液)。反胶束萃取后，采用DNS法测定获得的纤维素酶的总酶活，用考玛斯亮蓝法测定回收的蛋白含量。结果获得的酶活为9.6 FPU/mL，回收率为98.3%。获得的纤维素酶可继续用于酶解反应，同时将酶蛋白与离子液体分开有利于离子液体的回收。

实施例2  甘蔗渣的离子液体/纤维素酶体系中纤维素酶的回收

（1）离子液体/纤维素酶原位酶解甘蔗渣工艺：利用离子液体1-乙基-3-甲基咪唑二乙基磷酸盐([EMIM]DEP)在100℃条件下处理甘蔗渣，冷却后在离子液体中加入柠檬酸缓冲液和纤维素酶酶粉，调节pH4.8，使离子液体的终浓度为20%（v/v），纤维素酶的终浓度为13FPU/mL。

（2）反胶束体系的构建：称取2.2228g丁二酸二异辛酯磺酸钠（AOT）于烧杯中，用2,2,4-三甲基戊烷（异辛烷）溶解，移入100ml容量瓶中定容，且震荡至无色透明，则为50mmol/L AOT/异辛烷反胶束体系。

（3）反胶束体系回收纤维素酶：利用反胶束体系对步骤（1）中pH4.8的纤维素酶/20%（v/v）的离子液体体系中的纤维素酶进行回收，然后进行反萃，将上层有机相加入到另一具塞三角瓶中，加入2倍体积的反萃液(1mol/L NaCl的水溶液)。反胶束萃取后，采用DNS法测定获得的纤维素酶的总酶活，用考玛斯亮蓝法测定回收的蛋白含量。结果获得的酶活为10.5 FPU/mL，回收率为96.5%。获得的纤维素酶可继续用于酶解反应，同时将酶蛋白与离子液体分开有利于离子液体的回收。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

一种离子液体原位酶解纤维素体系中纤维素酶的回收方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。