专利摘要

本发明公开了一种氧化型辅酶NAD(P)+的化学再生方法，在氧气或空气气氛条件下，加入催化量的桥联黄素，氧化NAD(P)H得到NAD(P)+。本发明方法具有以下优点：再生辅因子的催化剂为不含贵金属并且廉价易得的有机小分子；该再生体系可再生NADH及NADPH；该再生体系具有较宽的pH范围和温度范围，适用于多种依赖烟酰胺的氧化还原酶催化的氧化反应。

权利要求

1.一种氧化型辅酶NAD(P)⁺的化学再生方法，其特征在于，在氧气或空气气氛条件下，加入催化量的桥联黄素，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺。

2.根据权利要求1所述的氧化型辅酶NAD(P)⁺的化学再生方法，其特征在于，所述的桥联黄素，其结构通式如下：

其中，R₁和R₂相互独立地选自：氢、甲基、三氟甲基、甲氧基、卤原子、硝基、氨基；R₃选自：氢、C1～C5的烷基、苯基、苄基；X^-选自：卤离子，硝酸根，三氟甲磺酸根。

3.根据权利要求1所述的氧化型辅酶NAD(P)⁺的化学再生方法，其特征在于，所述的桥联黄素为7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐、8-氯-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐、或1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐。

4.根据权利要求1所述的氧化型辅酶NAD(P)⁺的化学再生方法，其特征在于，所述的催化量为桥联黄素占NAD(P)H的摩尔百分比为0.1-5％。

5.根据权利要求1所述的氧化型辅酶NAD(P)⁺的化学再生方法，其特征在于，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH4-10，温度30-70℃。

6.根据权利要求1所述的氧化型辅酶NAD(P)⁺的化学再生方法，其特征在于，桥联黄素作为NAD(P)⁺再生催化剂，与依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶催化的氧化反应偶联，构成辅酶NAD(P)⁺的再生循环体系。

7.根据权利要求6所述的氧化型辅酶NAD(P)⁺的化学再生方法，其特征在于，所述的依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶包括EC1.1.1.X、EC1.2.1.X、EC1.3.1.X、EC1.4.1.X、EC1.5.1.X、EC1.6.1.X、EC1.7.1.X、EC1.8.1.X、EC1.10.1.X、EC1.12.1.X、EC1.13.1.X、EC1.16.1.X、EC1.17.1.X、EC1.18.1.X、EC1.20.1.X、EC1.22.1.X的所有酶。

8.根据权利要求7所述的氧化型辅酶NAD(P)⁺的化学再生方法，其特征在于，所述的依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶为马肝醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或甘油脱氢酶。

9.一种氧化反应，其以依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶为催化剂，其特征在于，以桥联黄素作为NAD(P)⁺再生催化剂，在氧气或空气气氛条件下，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺，形成辅酶NAD(P)⁺的再生循环体系。

10.根据权利要求9所述的氧化反应，其特征在于，所述的桥联黄素，其结构通式如下：

其中，R₁和R₂相互独立地选自：氢、甲基、三氟甲基、甲氧基、卤原子、硝基、氨基；R₃选自：氢、C1～C5的烷基、苯基、苄基；X^-选自：卤离子，硝酸根，三氟甲磺酸根。

11.根据权利要求10所述的氧化反应，其特征在于，所述的桥联黄素为7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐、8-氯-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐、或1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐。

12.根据权利要求9所述的氧化反应，其特征在于，桥联黄素的催化摩尔量占酶催化底物的摩尔量的0.1-5％。

13.根据权利要求9所述的氧化反应，其特征在于，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH4-10，温度30-70℃。

14.根据权利要求9所述的氧化反应，其特征在于，所述的依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶包括EC1.1.1.X、EC1.2.1.X、EC1.3.1.X、EC1.4.1.X、EC1.5.1.X、EC1.6.1.X、EC1.7.1.X、EC1.8.1.X、EC1.10.1.X、EC1.12.1.X、EC1.13.1.X、EC1.16.1.X、EC1.17.1.X、EC1.18.1.X、EC1.20.1.X、EC1.22.1.X的所有酶。

15.根据权利要求14所述的氧化反应，其特征在于，所述的依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶为马肝醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或甘油脱氢酶。

16.桥联黄素作为催化剂在氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺中的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的桥联黄素，其结构通式如下：

其中，R₁和R₂相互独立地选自：氢、甲基、三氟甲基、甲氧基、卤原子、硝基、氨基；R₃选自：氢、C1～C5的烷基、苯基、苄基；X^-选自：卤离子，硝酸根，三氟甲磺酸根。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述的桥联黄素为7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐、8-氯-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐、或1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐。

19.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，桥联黄素的催化摩尔量占NAD(P)H的摩尔量的0.1-5％。

20.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH4-10，温度30-70℃。

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化型辅酶NAD(P)⁺的化学再生方法，属于辅酶再生技术领域。

背景技术

氧化还原酶是继水解酶之后应用最广泛的一类酶，其催化的氧化还原反应大多数都需要NAD(P)H/NAD(P)⁺提供还原氢或接受氢，而NAD(P)H/NAD(P)⁺昂贵价格限制了氧化还原酶在工业生产中的应用，需要进行辅酶原位再生以降低成本。目前辅酶再生包括全细胞法、酶法、电化学法、光学化学法和化学法五种方法。全细胞法成本较低，但产物分离比较复杂，方法相对较原始。酶法包括底物偶联法和酶偶联法两种方法，其中底物偶联法是同一种酶同时催化两种不同的底物向相反的方向进行，同时实现主底物与辅底物的转化，构成辅酶再生循环，辅底物与主底物竞争酶的活性中心，酶的一部分活性用于再生辅酶，使用于催化主底物的酶活性降低；酶偶联法是氧化反应酶系统与还原反应酶系统在一个体系中平行进行，生产酶催化底物转化消耗辅酶，再生酶则催化辅酶进行再生，此法要求两个酶系统中的底物必须相对独立，以免互相竞争同一个酶的活性中心，而且两种酶的最适反应条件往往不一致。电化学法中电的成本较低，没有化学计量的再生试剂存在，但效率较低，常需要介质的参与，且此法与很多生物化学催化系统不相容，选择性很差。化学法利用特殊的催化剂将氧化还原剂的氧化还原当量传递给氧化还原辅因子NAD(P)H/NAD(P)⁺从而形成辅因子再生循环，常用的化学催化剂为有机贵金属配合物(Rh/Ru/Ir)，价格昂贵而且中心金属会脱落，中心金属常会与酶的氨基酸残基进行配位，使金属催化剂与酶都失去活性。光化学再生法常受限于缺乏高效的光敏剂，一般效率较低。

目前用于再生氧化型辅因子NAD(P)⁺的化学法常用核黄素单核苷酸(FMN)[J.Am.Chem.Soc.1982,104,4659-4665]和铁(Ⅲ)卟啉[Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,2397–2400]两种再生催化剂。用FMN再生时，要用过量剂量[J.Am.Chem.Soc.1982,104,4659-4665]或特殊光源照射下[ChemCatChem2011,3,338-342]进行催化再生。铁卟啉属于金属有机配合物，再生效率不高，且易与酶进行配位造成失活现象。

发明内容

针对上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用桥联型黄素再生NAD(P)+的新的化学方法，以克服其他再生方法的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明要保护的第一技术方案是一种氧化型辅酶NAD(P)⁺的化学再生方法。

一种氧化型辅酶NAD(P)⁺的化学再生方法，在氧气或空气气氛条件下，加入催化量的桥联黄素，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺。

本发明所述的NAD(P)⁺为NAD⁺或者NADP⁺。

本发明所述的NAD(P)H为NADH或者NADPH。

其中，氧化NADH得到NAD⁺，氧化NADPH得到NADP⁺。

本发明所述的桥联黄素(英文名称N¹,N¹⁰-Ethylene-bridgedflavins)，其结构通式如下：

其中，R₁和R₂相互独立地选自：氢、甲基、三氟甲基、甲氧基、卤原子、硝基、氨基；R₃选自：氢、C1～C5的烷基、苯基、苄基；X^-选自：卤离子，硝酸根，三氟甲磺酸根。

优选的是，R₁包括但不限于氢、甲基、卤原子；R₂包括但不限于氢、甲基、卤原子、三氟甲基；R₃包括但不限于氢、甲基；X^-为卤离子。

最优选的是，所述的桥联黄素包括但不限于7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物I)、8-氯-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物II)、或1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物III)。

本发明所述的桥联黄素可以参考现有公开的文献自行合成文献，例如文献[Tetrahedron,2001,57,4507-4522]；或者直接从市场上购买。

其中，所述的催化量为桥联黄素占NAD(P)H的摩尔百分比为0.1-5％，优选0.25-2％，最优选2％。

其中，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH4-10，温度30-70℃；优选氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH6-8，温度30-40℃；最优选氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH7，温度30℃。

其中，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的反应时间一般以反应完全为准或者以大部分反应完全为准，本领域技术人员可以采用紫外分光光度法检测，因为NAD(P)H在340nm处有紫外吸收，而NAD(P)⁺在340nm处没有吸收，所以可以采用紫外分光光度法检测反应进程，当减去桥联黄素空白吸光度后样品吸光度降为0时，视为反应完全，当吸光度接近0时，视为大部分反应完全，当然本领域技术人员也可以采用现有的其他检测方法监控反应过程使得反应完全。

其中，桥联黄素作为NAD(P)⁺再生催化剂，可以与依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶催化的氧化反应偶联，构成辅酶NAD(P)⁺的再生循环体系。

其中，所述的依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶包括但不限于EC1.1.1.X、EC1.2.1.X、EC1.3.1.X、EC1.4.1.X、EC1.5.1.X、EC1.6.1.X、EC1.7.1.X、EC1.8.1.X、EC1.10.1.X、EC1.12.1.X、EC1.13.1.X、EC1.16.1.X、EC1.17.1.X、EC1.18.1.X、EC1.20.1.X、EC1.22.1.X的所有酶。优选的是，所述的依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶包括但不限于马肝醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或甘油脱氢酶。

当桥联黄素作为NAD(P)⁺再生催化剂，与依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶催化的氧化反应偶联时，桥联黄素的使用量为依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶所催化底物摩尔量的0.1-5％，优选0.25-2％，最优选2％。

本发明要保护的第二技术方案是一种氧化反应。

一种氧化反应，其以依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶为催化剂，以桥联黄素作为NAD(P)⁺再生催化剂，在氧气或空气气氛条件下，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺，形成辅酶NAD(P)⁺的再生循环体系。

本发明所述的NAD(P)⁺为NAD⁺或者NADP⁺。

本发明所述的NAD(P)H为NADH或者NADPH。

其中，氧化NADH得到NAD⁺，氧化NADPH得到NADP⁺。

本发明所述的桥联黄素(英文名称N¹,N¹⁰-Ethylene-bridgedflavins)，其结构通式如下：

其中，R₁和R₂相互独立地选自：氢、甲基、三氟甲基、甲氧基、卤原子、硝基、氨基；R₃选自：氢、C1～C5的烷基、苯基、苄基；X^-选自：卤离子，硝酸根，三氟甲磺酸根。

优选的是，R₁包括但不限于氢、甲基、卤原子；R₂包括但不限于氢、甲基、卤原子、三氟甲基；R₃包括但不限于氢、甲基；X^-为卤离子。

最优选的是，所述的桥联黄素包括但不限于7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物I)、8-氯-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物II)、或1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物III)。

本发明所述的桥联黄素可以参考现有公开的文献自行合成文献，例如文献[Tetrahedron,2001,57,4507-4522]；或者直接从市场上购买。

其中，桥联黄素的催化摩尔量占依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶所催化底物摩尔量的0.1-5％，优选0.25-2％，最优选2％。

其中，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH3-12，温度30-70℃；优选氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH6-8，温度30-40℃；最优选氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH7，温度30℃。

其中，所述的依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶包括但不限于EC1.1.1.X、EC1.2.1.X、EC1.3.1.X、EC1.4.1.X、EC1.5.1.X、EC1.6.1.X、EC1.7.1.X、EC1.8.1.X、EC1.10.1.X、EC1.12.1.X、EC1.13.1.X、EC1.16.1.X、EC1.17.1.X、EC1.18.1.X、EC1.20.1.X、EC1.22.1.X的所有酶。优选的是，所述的依赖NAD(P)⁺的氧化还原酶包括但不限于马肝醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或甘油脱氢酶。

本发明要保护的第三个技术方案是桥联黄素作为催化剂在氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺中的应用。

本发明所述的NAD(P)⁺为NAD⁺或者NADP⁺。

本发明所述的NAD(P)H为NADH或者NADPH。

其中，氧化NADH得到NAD⁺，氧化NADPH得到NADP⁺。

本发明所述的桥联黄素(英文名称N¹,N¹⁰-Ethylene-bridgedflavins)，其结构通式如下：

其中，R₁和R₂相互独立地选自：氢、甲基、三氟甲基、甲氧基、卤原子、硝基、氨基；R₃选自：氢、C1～C5的烷基、苯基、苄基；X^-选自：卤离子，硝酸根，三氟甲磺酸根。

优选的是，R₁包括但不限于氢、甲基、卤原子；R₂包括但不限于氢、甲基、卤原子、三氟甲基；R₃包括但不限于氢、甲基；X^-为卤离子。

最优选的是，所述的桥联黄素包括但不限于7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物I)、8-氯-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物II)、或1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物III)。

本发明所述的桥联黄素可以参考现有公开的文献自行合成文献，例如文献[Tetrahedron,2001,57,4507-4522]；或者直接从市场上购买。

其中，桥联黄素的催化摩尔量占NAD(P)H的摩尔量的0.1-5％，优选0.25-2％，最优选2％。

其中，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH4-10，温度30-70℃；优选氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH6-8，温度30-40℃；最优选氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的条件为pH7，温度30℃。

其中，氧化NAD(P)H得到NAD(P)⁺的反应时间一般以反应完全为准或者以大部分反应完全为准，本领域技术人员可以采用紫外分光光度法检测，因为NAD(P)H在340nm处有紫外吸收，而NAD(P)⁺在340nm处没有吸收，所以可以采用紫外分光光度法检测反应进程，当减去桥联黄素空白吸光度后样品吸光度降为0时，视为反应完全，当吸光度接近0时，视为大部分反应完全，当然本领域技术人员也可以采用现有的其他检测方法监控反应过程使得反应完全。

有益效果：与现有技术相比，本发明的主要优势在于：桥联黄素再生NAD(P)⁺的效率很高，TOF可高达19min^-1，并且能够完全转化率，适用范围广泛，pH4-10，温度30-70℃。可以与各种最适条件氧化还原酶催化的氧化反应偶联，构成辅因子再生体系。

附图说明

图1为7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐合成的路线图；

图2为7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐作为NAD⁺再生催化剂与马肝醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶偶联反应的路线图。

具体实施方式

根据下述实例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐的合成。

将4-溴-3-硝基三氟甲苯(1.76g，6.53mmol)和乙醇胺(1.19g，19.59mmol)溶解到20mL乙醇中，加入碳酸钾(1.08g，7.83mmol)搅拌回流5-6h，待反应液冷却后，过滤，滤液减压浓缩，得到橘色固体，加入20mL饱和食盐水，用乙酸乙酯(3×40mL)萃取，合并有机相用饱和食盐水反洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸，硅胶柱层析纯化得到4-三氟甲基-2-硝基-N-(2-羟基乙基)苯胺(1.58g，产率96％)。

在4-三氟甲基-2-硝基-N-(2-羟基乙基)苯胺(1.20g，4.80mmol)的无水甲醇溶液(5℃)中，加入甲酸铵(1.51g，24.0mmol)和5％Pd/C(1.60g)，在0-25℃下搅拌反应1h，过滤，滤渣用甲醇冲洗，滤液减压浓缩，产生红色固体，加入30mL饱和食盐水，用乙酸乙酯(3×30mL)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到白色固体(1.04g，94％)。

在50℃充满氩气4-三氟甲基-N-(2-羟基乙基)邻苯二胺(1g，4.35mmol)的冰乙酸溶液中，加入四氧嘧啶一水合物(0.73g，4.35mmol)和硼酸(0.29g，4.67mmol)，反应1h，冷却，生成的黄色固体过滤得到，用二氯甲烷冲洗，真空干燥，得到的黄色固体立刻置于充满氮气的圆底烧瓶中，缓缓加入氯化亚砜(20mL)的同时剧烈搅拌，50℃氮气保护下反应16h，然后冷却过滤，得到的固体用二氯甲烷冲洗，粗产品溶解到最小量的98％的甲酸溶液中，用乙醚重结晶，得到黄色固体(1.28g，95％)。ESI-MS⁺：309；¹HNMR(CD3COOD-CF₃COOH,1:6)δ4.96(t,J＝8.9Hz,2H),5.58(t,J＝8.9Hz,2H),8.20(d,J＝8.8Hz,1H),8.47(d,J＝8.8Hz,1H),8.81(s,1H),；¹³CNMR(CD3COOD-CF₃COOH,1:6)δ46.2,52.1,122.6(q,J＝272.6Hz,CF₃),118.9,131.4,131.7,133.9,135.4(q,J＝35.5Hz,CCF₃),136.8,141.1,145.2,146.4,158.8。

实施例2：1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐的合成。

将2-氟硝基苯(0.92g，6.53mmol)和乙醇胺(1.19g，19.59mmol)溶解到20mL乙醇中，加入碳酸钾(1.08g，7.83mmol)搅拌回流5-6h，待反应液冷却后，过滤，滤液减压浓缩，得到橘色固体，加入20mL饱和食盐水，用乙酸乙酯(3×40mL)萃取，合并有机相用饱和食盐水反洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸，硅胶柱层析纯化得到2-硝基-N-(2-羟基乙基)苯胺(0.98g，产率82.9％)。

在2-硝基-N-(2-羟基乙基)苯胺(0.87g，4.80mmol)的无水甲醇溶液(5℃)中，加入甲酸铵(1.51g，24.0mmol)和5％Pd/C(1.60g)，在0-25℃下搅拌反应1h，过滤，滤渣用甲醇冲洗，滤液减压浓缩，产生红色固体，加入30mL饱和食盐水，用乙酸乙酯(3×30mL)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到白色固体(0.67g，92％)。

在50℃充满氩气N-(2-羟基乙基)邻苯二胺(0.66g，4.35mmol)的冰乙酸溶液中，加入四氧嘧啶一水合物(0.73g，4.35mmol)和硼酸(0.29g，4.67mmol)，反应1h，冷却，生成的黄色固体过滤得到，用二氯甲烷冲洗，真空干燥，得到的黄色固体立刻置于充满氮气的圆底烧瓶中，缓缓加入氯化亚砜(20mL)的同时剧烈搅拌，50℃氮气保护下反应16h，然后冷却过滤，得到的固体用二氯甲烷冲洗，粗产品溶解到最小量的98％的甲酸溶液中，用乙醚重结晶，得到黄色固体(0.88g，73％)。ESI-MS+：240.8，¹HNMR(CD3COOD-CF₃COOH,1:6)δ4.94(t,J＝8.9Hz,2H),5.53(t,J＝8.9Hz,2H),8.04-8.57(4H)；¹³CNMR(CD3COOD-CF₃COOH,1:6)δ45.9,51.9,117.2,130.3,131.9,133.2,134.2,142.1,142.2,144.1,146.7,159.4。

实施例3：8-氯-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐的合成。

将2,4-二氯硝基苯(1.25g，6.53mmol)和乙醇胺(1.19g，19.59mmol)溶解到20mL乙醇中，加入碳酸钾(1.08g，7.83mmol)搅拌回流5-6h，待反应液冷却后，过滤，滤液减压浓缩，得到橘色固体，加入20mL饱和食盐水，用乙酸乙酯(3×40mL)萃取，合并有机相用饱和食盐水反洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸，硅胶柱层析纯化得到5-氯-2-硝基-N-(2-羟基乙基)苯胺(1.26g，产率89％)。

在含有5-氯-2-硝基-N-(2-羟基乙基)苯胺(1.04g，4.80mmol)和Sn(1.71g,14.40mmol)的20mL水溶液(100℃)中，缓慢滴9mL浓盐酸，然后将反应置于5℃冷却30min，用50％的NaOH水溶液中和，并用乙酸乙酯(3×30mL)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到白色固体(0.47g，52％)。

在50℃充满氩气4-三氟甲基-N-(2-羟基乙基)邻苯二胺(0.37g，2.0mmol)的冰乙酸溶液中，加入四氧嘧啶一水合物(0.32g，2.0mmol)和硼酸(0.13g，2.14mmol)，反应1h，冷却，生成的固体过滤得到，用二氯甲烷冲洗，真空干燥，得到的固体立刻置于充满氮气的圆底烧瓶中，缓缓加入氯化亚砜(10mL)的同时剧烈搅拌，50℃氮气保护下反应16h，然后冷却过滤，得到的固体用二氯甲烷冲洗，粗产品溶解到最小量的98％的甲酸溶液中，用乙醚重结晶，得到固体(0.43g，69％)。ESI-MS+：274,9，¹HNMR(CD3COOD-CF₃COOH,1:6)δ4.92(t,J＝8.9Hz,2H),5.49(t,J＝8.9Hz,2H),8.06(d,J＝8.4Hz,2H),8.50(d,J＝8.4Hz,1H)；¹³CNMR(CD3COOD-CF₃COOH,1:6)δ45.9,51.9,117.2,130.9,131.8,134.2,135.1,140.6,144.6,146.6,150.1,159.1。

实施例4：7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐氧化NADH为NAD⁺。

30℃下，在10mL50mMpH7磷酸钾缓冲液中，NADH的初始浓度为0.2mM，7-三氟甲基1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐的浓度为4μM，将反应液与外界空气相连通。每隔1min检测340nm下反应体系吸光值变化，计算转化率，结果如表1。

表1.7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐氧化NADH随时间的转化率

实施例5：7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐氧化NADPH为NADP⁺

30℃下，在10mL50mMpH7磷酸钾缓冲液中，NADPH的初始浓度为0.2mM，7-三氟甲基1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐的浓度为4μM，将反应液与外界空气相连通。每隔1min检测340nm下反应体系吸光值变化，计算转化率，结果如表2。

表2.7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐氧化NADPH随时间的转化率

实施例6：8-氯-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐氧化NADH为NAD⁺。

30℃下，在10mL50mMpH7磷酸钾缓冲液中，NADH的初始浓度为0.2mM，8-氯-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐的浓度为4μM，将反应液与外界空气相连通。每隔1min检测340nm下反应体系吸光值变化，计算NADH的转化率，结果如表3。

表3.8-氯-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐氧化NADH随时间的转化率

实施例7：1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐氧化NADH为NAD⁺。

30℃下，在10mL50mMpH7磷酸钾缓冲液中，NADH的初始浓度0.2mM，1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐的浓度为4μM，将反应液与外界空气相连通。每隔1min检测340nm下反应体系吸光值变化，计算NADH的转化率，结果如表4。

表4.1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐氧化NADH随时间的转化率

实施例8：7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐在不同pH下氧化NADH。

30℃下，分别在10mLpH4-10的50mM磷酸钾缓冲液中，NADH的初始浓度为0.2mM，加入7-三氟甲基1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐的浓度为0.5μM，将反应液与外界空气相连通，反应10min后，检测340nm下的吸光值，计算NADH和NAD⁺的浓度，计算不同pH下的TON和TOF，结果如表5，当pH＜7时，TON和TOF随pH的增大而增大，当pH＞7时，TON和TOF随pH的增大而降低。

表5.7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐在不同pH下氧化NADH的TON和TOF

实施例9：7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐在不同温度下氧化NADH。

在pH7的50mM磷酸钾缓冲液中，NADH的初始浓度0.2mM，7-三氟甲基1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐的浓度为0.5μM，将反应液与外界空气相连通，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下反应10min后，检测340nm下的吸光值，计算NADH和NAD+的浓度，计算不同温度下的TON和TOF，结果如表6，当T＜40℃，TON和TOF随温度变化不大，当T＞40℃，TON和TOF随温度的增大而降低，原因是随温度的增加空气在水中的溶解度降低。

表6.7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐在不同pH下氧化NADH的TON和TOF

实施例10：1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐的取代物氧化NADH到NAD⁺。

30℃下，在pH7的50mM磷酸钾缓冲液中，NADH的初始浓度0.2mM，7-三氟甲基-3-甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物A)、7-甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物B)、8-甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物C)、7,8-二甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物D)、3-苄基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物E)的浓度为0.5μM，将反应液与外界空气相连通，反应10min后，检测340nm下的吸光值，计算NADH和NAD+的浓度，计算不同温度下的TON和TOF，结果如表7。

表7.几种桥联黄素催化剂氧化NADH的TON和TOF

实施例8：7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐作为再生NAD⁺的催化剂与马肝醇脱氢酶偶联催化1,4-丁二醇氧化内酯化为γ-丁内酯。

30℃下，在1mL50mM的pH8磷酸钾缓冲液中，1,4-丁二醇20mM、NAD⁺0.1mM、7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪0.05mM、过氧化氢酶50U/mL、马肝醇脱氢酶20U/mL，反应液与外界空气相连通。分别取反应1h、2h、4h、8h的反应液200μL，加入200μL乙酸乙酯萃取，气相检测反应进程，结果如表8：

表8.7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐与马肝醇脱氢酶偶联催化1,4-丁二醇随反应时间的转化率

实施例9：7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐作为再生NAD⁺的催化剂与马肝醇脱氢酶偶联催化环己醇氧化为环己酮。

30℃下，在1mL50mM的pH8磷酸钾缓冲液中，环己醇20mM、NAD⁺0.1mM、7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪0.05mM、过氧化氢酶50U/mL、马肝醇脱氢酶20U/mL，反应液与外界空气相连通。分别取反应1h、2h、4h、8h、12h、24h的反应液200μL，加入200μL乙酸乙酯萃取，气相检测反应进程，结果如表9：

表9.7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐与马肝醇脱氢酶偶联催化环己醇随反应时间的转化率

实施例10：7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐作为再生NAD⁺的催化剂与马肝醇脱氢酶偶联催化3-甲基-1,5-戊二醇氧化内酯化为3-甲基戊内酯。

30℃下，在1mL50mM的pH8磷酸钾缓冲液中，3-甲基-1,5-戊二醇20mM、NAD⁺0.1mM、7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪0.05mM、过氧化氢酶50U/mL、马肝醇脱氢酶20U/mL，反应液与外界空气相连通。分别取反应1h、2h、4h、8h、12h、24h的反应液200μL，加入200μL乙酸乙酯萃取，气质检测反应进程，结果如表10。

表10.7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐与马肝醇脱氢酶偶联催化3-甲基-1,5-戊二醇随反应时间的转化率

实施例11：7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐作为再生NAD⁺的催化剂与葡萄糖脱氢酶偶联催化氧化葡萄糖为葡萄糖酸。

30℃下，在10mL反应体系中，葡萄糖25mM、NAD⁺0.5mM、7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪0.5mM、NaCl50mM、过氧化氢酶50U/mL、葡萄糖脱氢酶120U/mol(葡萄糖)，反应液与外界空气相连通。分别取反应1h、2h、4h、6h的反应液200μL，加入800μL水稀释，液相检测反应进程，结果如表11。

表11.7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐与葡萄糖脱氢酶偶联催化葡糖糖随反应时间的转化率

实施例12：7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐作为再生NAD⁺的催化剂与葡萄糖脱氢酶偶联催化氧化木糖为木糖酸。

30℃下，在10mL反应体系中，木糖25mM、NAD⁺0.5mM、7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪0.5mM、NaCl50mM、过氧化氢酶50U/mL、葡萄糖脱氢酶120U/mol(木糖)，反应液与外界空气相连通。分别取反应1h、2h、4h、6h、12h、24h的反应液200μL，加入800μL水稀释，液相检测反应进程，结果如表12。

表12.7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐与葡萄糖脱氢酶偶联催化木糖随反应时间的转化率

实施例13：7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐作为再生NAD⁺的催化剂与甘油脱氢酶偶联催化氧化甘油为1,3-二羟丙酮。

30℃下，在10mL反应体系(50mM的pH10磷酸钾缓冲液)中，甘油25mM、NAD⁺0.5mM、7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐0.5mM、过氧化氢酶50U/mL、甘油脱氢酶120U/mol，反应液与外界空气相连通。分别取反应1h、2h、4h、8h、12h、24h的反应液200μL，加入800μL水稀释，液相检测反应进程，结果如表13。

表13.7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐与甘油脱氢酶偶联催化甘油随反应时间的转化率

一种氧化型辅酶NAD(P)+的化学再生方法专利购买费用说明

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A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

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4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

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