专利摘要

本发明公开了一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。该基因工程菌是将含有优化的基因LS和基因NDPS1的重组载体转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)构建而成，所述优化的基因LS和NDPS1的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNo.1～2所示。在此基础上同时过表达基因HMG1和基因ERG12，能使柠檬烯达到0.67mg/gDCW的极高产量。此外，通过对该基因工程菌两相发酵时添加的丙酮酸和十二烷的浓度进行选择，进一步提高柠檬烯的产量。该基因工程菌能用于大规模商业化生产，前景良好。

权利要求

1.一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，其是将含有优化的基因LS和优化的基因NDPS1的重组载体转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Polf构建而成，所述优化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示；所述优化的基因NDPS1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示；所述重组载体为质粒pINA1312LN，所述质粒pINA1312LN的核苷酸序列如序列表SEQ ID No: 5所示。

2.如权利要求1所述的产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，其是将质粒pINA1269-HMG1转化转化体A后构建而成，所述质粒pINA1269- HMG1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:3所示；所述转化体A是将所述质粒pINA1312LN转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Polf构建而成。

3.如权利要求1所述的产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，其是将质粒pINA1269-HMG1-ERG12转化转化体A后构建而成，所述质粒pINA1269-HMG1-ERG12的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4所示；所述转化体A是将所述质粒pINA1312LN转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Polf构建而成。

4.一种产柠檬烯的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：培养如权利要求1~3任一项所述的产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，添加十二烷进行两相发酵得发酵液，萃取发酵液的十二烷相。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培养还添加丙酮酸。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸的浓度为2~8g/L，所述浓度为所述丙酮酸的质量与添加所述丙酮酸前所述培养的体系的体积之比。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸的浓度为4g/L，所述浓度为所述丙酮酸的质量与添加所述丙酮酸前所述培养的体系的体积之比。

8.如权利要求4~7任一项所述的方法，其特征在于，所述十二烷的浓度为2~10%，所述百分比为所述十二烷与添加所述十二烷前所述发酵液的体积百分比。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述十二烷的浓度为为6~8%，所述百分比为所述十二烷与添加所述十二烷前所述发酵液的体积百分比。

10.如权利要求1~3任一项所述的产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备柠檬烯中的应用。

11.一种制备产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：

（1）构建含有优化的基因LS和优化的基因NDPS1的重组载体，所述优化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示；所述优化的基因NDPS1的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo:2所示；所述重组载体为质粒pINA1312LN，所述质粒pINA1312LN的核苷酸序列如序列表SEQ ID No: 5所示；

（2）将步骤（1）制备的重组载体转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Polf，得转化体。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，其还包括以下的步骤：

（3）构建质粒pINA1269-HMG1和质粒pINA1269-HMG1-ERG12，将所述质粒pINA1269-HMG1或质粒pINA1269-HMG1-ERG12转化步骤（2）所得的转化体，其中，所述质粒pINA1269-HMG1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:3所示；所述质粒pINA1269-HMG1-ERG12的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4所示。

13.一种用于制备如权利要求1~3任一项所述的产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌的重组载体，其特征在于，其含有优化的基因LS和优化的基因NDPS1，所述优化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示；所述优化的基因NDPS1的核苷酸序列如序列表SEQID No:2所示；所述的重组载体为将所述的优化的基因LS和优化的基因NDPS1导入质粒pINA1312而得的质粒pINA1312LN，所述质粒pINA1312LN的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:5所示。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。

背景技术

柠檬烯普遍存在于天然植物中，因具有令人愉悦的柑橘香味而在食物香精中得到广泛的应用。在香料工业中，柠檬烯本身可用作配制人造橙花、甜花、柠檬、香柠檬油的原料，亦可作为新鲜的头香香料。由于柠檬烯具备药理活性，其在医药领域也有着广泛的应用。同时柠檬烯也是喷气燃料的一种替代品。另外其还是许多重要芳香物质和药物比如紫苏醇、香芹酮和薄荷醇等的前体。

柠檬烯的生产方法主要有天然提取法和微生物发酵法两种。由于从工业废弃物柑橘皮中提取的柠檬烯难免会有农药残留，不适合作为食品添加剂，因此微生物发酵生产柠檬烯具有明显的优势。特别是随着生物技术的快速发展，利用微生物发酵生产柠檬烯及其衍生物成为目前研究的热点之一。

一般通过外源引入柠檬烯合成酶基因生物发酵法生产柠檬烯，目前亟需高产柠檬烯的基因工程菌。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏高产柠檬烯的基因工程菌的不足，提供一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。

发明人付出创造性劳动后发现，针对引入柠檬烯合成基因后解脂耶氏酵母产生柠檬烯的代谢途径，将两个柠檬烯合成相关基因——即来源于番茄，可将异戊烯基焦磷酸和甲基烯丙基焦磷酸缩合为橙花基二磷酸的基因NDPS1；和来源于藿香，可将橙花基二磷酸异构为柠檬烯的基因LS分别进行优化后，将这两个优化的基因转化解脂耶氏酵母能够使其产柠檬烯。发明人进一步发现，在优化上述两个基因的基础上过表达将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因HMG1，并同时过表达将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因ERG12，能极大幅度地提高柠檬烯的产量(参见图1)。此外，发明人发现特定的十二烷的添加量能够在两相发酵中更好地促进解脂耶氏酵母高产柠檬烯。

本发明提供的技术方案如下：

本发明的技术方案之一为：一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将含有优化的基因LS和优化的基因NDPS1的重组载体转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)构建而成，所述优化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述优化的基因NDPS1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明中，所述尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)为本领域常规的尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，即自身难以合成尿嘧啶和亮氨酸的解脂耶氏酵母。较佳地，所述尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母Po1f，其按照Madzak C,Tréton B and Roland SB.Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.J Mol Microbiol Biotechnol.2000,2(2):207-216中记载的制备方法制得。

所述的优化的基因LS通过将来源于藿香(Agastache rugosa)LS基因(GB:AY055214)的核苷酸序列进行优化后得到；所述优化的基因NDPS1通过将来源于番茄(Solanum lycopersicum)的NDPS1基因(GB:NM_001247704)的核苷酸序列进行优化后得到。

本发明中，较佳地，所述的重组载体含有PmlI的酶切位点。较佳地，所述重组载体还含有启动子和/或终止子序列。更佳地，所述重组载体还含有强启动子hp4d。

本发明所述的重组载体为本领域常规的重组载体，其能够转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，并含有上述的优化的基因LS和基因NDPS1即可。

较佳地，所述的重组载体为将上述的优化的基因LS和优化的基因NDPS1导入质粒pINA1312而得的质粒pINA1312LN，所述质粒pINA1312LN的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示。

本发明中，将上述的质粒pINA1312LN转化上述的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1f构建而成的解脂耶氏酵母基因工程菌能够产较多的柠檬烯，将其命名为解脂耶氏酵母Po1f-LN-000。

更佳地，本发明所述的产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌是将质粒pINA1269-HMG1转化上述的解脂耶氏酵母Po1f-LN-000构建而成，所述质粒pINA1269-HMG1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。

其中，所述质粒pINA1269-HMG1中含有来源于解脂耶氏酵母的基因HMG1(在NCBI中登录号为GB:NC_006071)。

本发明中，将上述的质粒pINA1269-HMG1转化上述的解脂耶氏酵母Po1f-LN-000构建而成的解脂耶氏酵母基因工程菌命名为解脂耶氏酵母Po1f-LN-004，其能够产更多的柠檬烯。

最佳地，本发明所述的产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌是将质粒pINA1269-HMG1-ERG12转化上述的解脂耶氏酵母Po1f-LN-000构建而成，所述质粒pINA1269-HMG1-ERG12的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。

其中，所述质粒pINA1269-HMG1-ERG12中同时含有来源于解脂耶氏酵母的基因HMG1(在NCBI中登录号为GB:NC_006071)和ERG12(在NCBI中登录号为GB:NC_006068)。

本发明中，将上述的质粒pINA1269-HMG1-ERG12转化上述的解脂耶氏酵母Po1f-LN-000构建而成的解脂耶氏酵母基因工程菌命名为解脂耶氏酵母Po1f-LN-051，其能够极大幅地高产柠檬烯。

本发明的技术方案之二为：一种产柠檬烯的方法，其包括以下的步骤：培养上述的产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，添加十二烷进行两相发酵得发酵液，萃取发酵液的十二烷相。

本发明中，所述培养的培养基为本领域常规的培养基，较佳地为YPD培养基。更佳地，所述的YPD培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比。

较佳地，所述培养基还含有辅助碳源。所述辅助碳源为本领域常规的辅助碳源，较佳地为丙酮酸。所述丙酮酸的浓度为本领域常规的浓度，较佳地为2～8g/L，更佳地为4g/L，所述浓度为所述丙酮酸的质量与添加所述丙酮酸前所述培养的体系的体积之比。

本发明中，由于柠檬烯是高度挥发性的单萜，需要在培养基中额外添加1mL十二烷作为萃取剂进行两相发酵，从而随时萃取分泌到胞外的柠檬烯。较佳地，添加所述十二烷的时间为所述两相发酵的起始时间。添加所述十二烷的浓度为本领域常规的浓度，较佳地为2～10％，更佳地为6～8％，最佳地为8％，所述百分比为所述十二烷与添加所述十二烷前所述发酵液的体积百分比。

本发明的技术方案之三为：上述的产柠檬烯解脂耶氏酵母基因工程菌在制备柠檬烯中的应用。

本发明的技术方案之四为：一种制备上述的产柠檬烯解脂耶氏酵母基因工程菌的方法，其包括以下的步骤：

(1)构建含有优化的基因LS和基因NDPS1的重组载体，所述优化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述优化的基因NDPS1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；

(2)将步骤(1)制备的重组载体转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，得转化体。

较佳地，还包括以下的步骤：

(3)构建质粒pINA1269-HMG1和质粒pINA1269-HMG1-ERG12，将所述质粒pINA1269-HMG1或质粒pINA1269-HMG1-ERG12转化步骤(2)所得的转化体，其中，所述质粒pINA1269-HMG1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；所述质粒pINA1269-HMG1-ERG12的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。

本发明的技术方案之五为：一种用于制备上述的解脂耶氏酵母基因工程菌的重组载体，其含有优化的基因LS和基因NDPS1，所述优化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述优化的基因NDPS1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

较佳地，所述的重组载体为将上述的优化的基因LS和优化的基因NDPS1导入质粒pINA1312而得的质粒pINA1312LN，所述质粒pINA1312LN的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明通过将来源于番茄的基因NDPS1和来源于藿香的基因LS的核苷酸序列优化后导入解脂耶氏酵母，在此基础上过表达基因HMG1，并更进一步同时过表达基因HMG1和基因ERG12，获得能更大幅度地提高柠檬烯的产量的产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌。该产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌能使柠檬烯达到0.67mg/g DCW的极高产量，超过仅导入基因NDPS1和基因LS的菌株所产柠檬烯的产量111倍。

同时，通过对解脂耶氏酵母基因工程菌两相发酵时添加的丙酮酸和十二烷的浓度进行选择，进一步提高柠檬烯的产量。此外，利用本发明提供的解脂耶氏酵母基因工程菌产柠檬烯的方法，操作简便，反应稳定可靠，能够利用于大规模的商业化生产，所得的柠檬烯能够安全地用于食品添加剂的制备，前景良好。

附图说明

图1为引入柠檬烯合成基因后解脂耶氏酵母生成柠檬烯的代谢途径。

图2为含有两个柠檬烯合成基因的质粒pINA1312LN的质粒结构图。

图3为含有两个过表达基因HMG1和ERG12的质粒pINA1269-HMG1-ERG12的质粒结构图。

图4为菌株Po1f-LN-000、Po1f-LN-004和Po1f-LN-051摇瓶发酵生产柠檬烯的结果图。

图5为菌株Po1f-LN-051经过发酵条件优化后摇瓶发酵生产柠檬烯的结果图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明实施例尽管采用菌株Po1f作为出发菌株，但是常规的尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)均能够作为出发菌株，用以转化，以进行实施例中的试验。

实施例中的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的出发菌株Po1f根据Madzak C,Tréton B and Roland SB.Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.J Mol Microbiol Biotechnol.(2000)2(2):207-216所记载的制备方法制得。

质粒pINA1312的制备方法参见Nicaud,J.M.,Madzak,C.,Broek,P.,Gysler,C.,Duboc,P.,Niederberger,P.,Gaillardin,C.,2002,Protein expression and secretion in the yeast Yarrowia lipolytica.FEMS yeast research 2,371-379。

质粒pINA1269的制备方法参见Madzak C,Tréton B and Roland SB.Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.J Mol Microbiol Biotechnol.(2000)2(2):207-216。

实施例1构建菌株Po1f-LN-000

(1)分别将来源于藿香(Agastache rugosa)的基因LS的优化序列(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示)和来源于番茄(Solanum lycopersicum)的基因NDPS的优化序列(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示)通过酶切位点PmlI构建到质粒pINA1312，得到质粒pINA1312-LS和pINA1312-NDPS1。

(2)将步骤(1)所得的质粒pINA1312-NDPS1中NDPS1基因的表达盒通过酶切位点StuI连接到步骤(1)所得的质粒pINA1312-LS上得到含有基因LS和NDPS1的质粒pINA1312LN。其中质粒pINA1312LN的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示。质粒pINA1312LN的质粒结构参见图2。

(3)将步骤(2)所得的质粒pINA1312LN线性化利用同源重组的方法转化入解脂耶氏酵母Po1f中，获得能够生成柠檬烯的初始菌株Po1f-LN-000。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation II^TM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。

实施例2构建菌株Po1f-LN-004和Po1f-LN-051

(1)将来源于解脂耶氏酵母的基因HMG1(在NCBI中登录号为GB:NC_006071)和ERG12(在NCBI中登录号为GB:NC_006068)通过酶切位点PmlI分别连接到质粒pINA1269上，得到质粒pINA1269-HMG1和pINA1269-ERG12。质粒pINA1269-HMG1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

(2)将步骤(1)所得的质粒pINA1269-ERG12中将ERG12基因的表达盒通过酶切位点SpeI连接到步骤(1)所得的质粒pINA1269-HMG1上得到含有基因HMG1和ERG12的质粒pINA1269-HMG1-ERG12。其中质粒pINA1269-HMG1-ERG12的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。质粒pINA1269-HMG1-ERG12的质粒结构参见图3。

(3)将步骤(1)所得的质粒pINA1269-ERG12和步骤(2)所得的质粒pINA1269-HMG1-ERG12线性化，利用同源重组的方法分别转化入实施例1所得的初始菌株Po1f-LN-000中，依次得到菌株Po1f-LN-004和Po1f-LN-051。其中，转化的方法与实施例1中转化的方法相同。

实施例3测定菌株产柠檬烯的产量

将菌株解脂耶氏酵母Po1f、实施例1制备的初始菌株Po1f-LN-000、实施例2制备的菌株Po1f-LN-004和Po1f-LN-051分别接种于2mL YPD培养基(该YPD培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)，培养24小时，然后以初始OD为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基进行培养，并加入2％十二烷，所述百分比为所述十二烷与添加所述十二烷前所述发酵液的体积百分比。两相发酵培养3天后，取十二烷相用GC-MS检测柠檬烯。检测的方法参见Jongedijk,E.,Cankar,K.,Ranzijn,J.,van der Krol,S.,Bouwmeester,H.,Beekwilder,J.,2015.Capturing of themonoterpene olef in limonene produced in Saccharomyces cerevisiae.Yeast.32,159-171。

检测的结果参见图4和表1。表1的结果说明，菌株Po1f-LN-004和Po1f-LN-051产柠檬烯的能力大幅度提升。

表1不同菌株的柠檬烯产量

实施例4提高菌株产柠檬烯的产量的优化发酵方法

A、使用较优浓度的丙酮酸

将实施例2制备的菌株Po1f-LN-051接种于2mL YPD培养基培养24小时，然后以初始OD为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基进行培养。添加不同浓度的丙酮酸作为辅助碳源进行培养。同时在培养基中额外添加2％的十二烷作为萃取剂进行两相发酵，所述百分比为所述十二烷与添加所述十二烷前所述发酵液的体积百分比。

两相发酵培养3天后，取十二烷相用GC-MS检测柠檬烯的含量，结果如图5和表2所示。表2的结果说明，所添加的丙酮酸的浓度为4g/L时，柠檬烯的产量最高，达到0.985mg/g DCW，其中，所述单位(g/L)为所述丙酮酸的质量与添加所述丙酮酸前所述培养的体系的体积之比。

表2发酵条件优化后的柠檬烯产量-1

B、使用较优浓度的十二烷

将实施例2制备的菌株Po1f-LN-051接种于2mL YPD培养基培养24小时，然后以初始OD为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基进行培养。添加4g/L的丙酮酸作为辅助碳源进行培养，所述浓度为所述丙酮酸的质量与添加所述丙酮酸前所述培养的体系的体积之比。同时在培养基中添加不同浓度的十二烷作为萃取剂进行两相发酵。

两相发酵培养3天后，取十二烷相用GC-MS检测柠檬烯的含量，结果如图5和表3所示。表3的结果说明，在50mL培养基中添加4mL十二烷时，柠檬烯的产量最高，达到1.36mg/g DCW。其中，所述百分比为所述十二烷与添加所述十二烷前所述发酵液的体积百分比。

表3发酵条件优化后的柠檬烯产量-2

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。