专利摘要

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种用于生产桧烯的重组载体及重组酵母菌株及其构建方法和应用。本发明所述重组质粒包含编码F96W和N127W双重突变的ERG20的序列ERG20ww，以及来源于Salviapomifera和/或Citrusjambhiri的桧烯合酶编码序列。本发明选择合适的双重突变的ERG20的序列ERG20ww以及外源桧烯合酶基因进行搭配组合，构建出能够生产桧烯的重组载体并利用该载体转化到酵母菌株中，可显著提高菌株生产桧烯的能力，在此基础上继续优化改造，可进一步提高菌株生产桧烯的产量。

权利要求

1.一种用于生产桧烯的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，转化有重组载体和表达异源外排蛋白的载体，所述重组载体包含编码F96W和N127W双重突变的ERG20的序列ERG20ww，以及来源于Salvia pomifera并去除桧烯合酶N端1-34位氨基酸残基的截短桧烯合酶编码序列，Salvia pomifera桧烯合酶编码序列如SEQ ID NO:9所示；

所述异源外排蛋白编码序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述重组载体包含如下任意一种或两种以上形式的基因模块：

（1）终止子-ERG20ww-双向启动子-桧烯合酶编码序列-终止子；

（2）终止子-桧烯合酶编码序列-双向启动子- ERG20ww -终止子；

（3）启动子- ERG20ww-终止子-启动子-桧烯合酶编码序列-终止子；

（4）启动子-桧烯合酶编码序列-终止子-启动子-ERG20ww -终止子；

（5）启动子- ERG20ww-桧烯合酶编码序列-终止子；

（6）启动子-桧烯合酶编码序列- ERG20ww -终止子；

（7）终止子- ERG20ww-桧烯合酶编码序列-反向启动子；

（8）终止子-桧烯合酶编码序列-ERG20ww -反向启动子；

（9）终止子-双向启动子- ERG20ww和桧烯合酶的融合蛋白编码序列-终止子；

（10）终止子- ERG20ww和桧烯合酶的融合蛋白编码序列-双向启动子-终止子；

（11）启动子- ERG20ww和桧烯合酶的融合蛋白编码序列-终止子；

（12）终止子- ERG20ww和桧烯合酶的融合蛋白编码序列-反向启动子。

3.根据权利要求1-2任意一项所述重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述重组载体还包括1个以上拷贝的额外ERG20ww。

4.根据权利要求1所述重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株内源ERG20的启动子为弱启动子，所述弱启动子相对于酵母菌株内源ERG20的原始启动子为弱启动子。

5.权利要求1-4任意一项所述重组酿酒酵母菌株在生产桧烯中的应用。

6.权利要求1所述用于生产桧烯的重组酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，将权利要求1中的所述重组载体以及表达异源外排蛋白的载体转化至酵母菌株中，获得所述重组酵母菌株。

7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，还包括：

构建酵母菌株内源ERG20原始启动子上游同源序列-弱启动子-酵母菌株内源ERG20原始启动子下游同源序列的基因模块，或构建酵母菌株内源ERG20原始启动子上游同源序列-弱启动子-酵母菌株内源ERG20-酵母菌株内源ERG20下游同源序列的基因模块；

将所述基因模块利用酵母同源重组机制替换酵母菌株内源ERG20原始启动子为弱启动子。

8.根据权利要求6或7所述构建方法，其特征在于，还包括：

分别设计启动子、异源外排蛋白的编码序列和终止子两端的同源序列，然后连同酶切后的载体转化到所述酵母菌株中，同源重组为表达异源外排蛋白的载体；其中，相邻的两个基因元件之间具有同源区域，可同源重组连接。

9.一种生产桧烯的方法，其特征在于，包括：

步骤1、将权利要求1-4任意一项所述重组酿酒酵母菌株接入培养基活化，制备种子液；

步骤2、将种子液接种于培养基中并添加十四酸异丙酯进行两相培养，培养后收集培养基上层有机相分离出桧烯。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种用于生产桧烯的重组载体及重组酵母菌株及其构建方法和应用。

背景技术

桧烯(Sabinene，1-异丙基-4-亚甲基双环[3.1.0]己烷，C10H16，分子量为136.23)是一种天然存在的双环不饱和单萜。桧烯长期以来一直作为香水添加剂、精细化学品，同时因其具有良好的抗炎和抗真菌活性应用于制药行业。目前研究者正在开发其作为生物燃料：桧烯化学结构比普通碳氢化合物更加紧凑，所以具有很高的密度和燃烧热，可作为喷气式飞机混合燃料的重要组成成分。

目前，桧烯的主要来源是从植物中提取，但植物中可提取的桧烯含量很低，很难满足工业需要，并且需要消耗大量自然资源。因此，微生物合成则以低成本、高产量和产品安全性被认为是最有前途的生产方法。在微生物合成桧烯的研究中，所采用的宿主主要是大肠杆菌和酿酒酵母。2014年，中国科学家咸漠等人在大肠杆菌中构建了产桧烯的异源途径：首先，大肠杆菌具有天然的MEP途径，可以为桧烯的合成提供丰富的前体物质GPP。此外，过表达了大肠杆菌中的天然基因IspA(编码法呢基二磷酸合成酶)，以增加GPP的含量；引入了酿酒酵母中存在的甲羟戊酸途径，以进一步丰富前体物质。最后，通过对GPP合成酶的筛选和过表达，引入桧烯合酶，得到了高产桧烯的大肠杆菌菌株，摇瓶发酵可达82.18mg/L，发酵罐产量达2.65g/L；2017年，他们又通过底物MVA喂养方式，得到一株摇瓶发酵产量达150mg/L的大肠杆菌。2017年，Bowie等人设计了体外合成单萜的系统，这个系统引入了27种酶用来将葡萄糖转化为单萜，并利用两种辅助因子NAD(P)H和ATP合成萜烯，最终合成了15.9g/L的桧烯。

酿酒酵母作为公认的安全模式微生物，遗传背景清楚、基因操作简单、可进行大规模发酵生产，而且酿酒酵母还拥有更强大的蛋白表达和翻译后修饰系统以及完整的内膜系统，更适于P450蛋白的表达。与大肠杆菌相比，它的菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用药用和饲料酵母；与体外合成相比，体系简单，成本低，并且体系中酶的稳定性高。因此，实现桧烯在酿酒酵母中的高产显得尤为重要。然而，截止目前公开报道的利用酿酒酵母合成桧烯的报道极少。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于生产桧烯的重组载体及重组酵母菌株及其构建方法和应用，使得所述重组载体转化到酵母菌株中能够显著提高菌株生产桧烯的能力。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于生产桧烯的重组载体，包含编码F96W和N127W双重突变的ERG20的序列ERG20ww，以及来源于Salvia pomifera和/或Citrus jambhiri的桧烯合酶编码序列。

针对现有的生产桧烯重组酵母菌株，本发明选择合适的双重突变的ERG20的序列ERG20ww以及外源桧烯合酶基因进行搭配组合，构建出能够生产桧烯的重组载体并利用该载体转化到酵母菌株中，可显著提高菌株生产桧烯的能力。

作为优选，所述ERG20ww和桧烯合酶编码序列按照如下任意一种或两种以上形式的基因模块嵌入到所述重组载体中：

(1)终止子-ERG20ww-双向启动子-桧烯合酶编码序列-终止子；

(2)终止子-桧烯合酶编码序列-双向启动子-ERG20ww-终止子；

(3)启动子-ERG20ww-终止子-启动子-桧烯合酶编码序列-终止子；

(4)启动子-桧烯合酶编码序列-终止子-启动子-ERG20ww-终止子；

(5)启动子-ERG20ww-桧烯合酶编码序列-终止子；

(6)启动子-桧烯合酶编码序列-ERG20ww-终止子；

(7)终止子-ERG20ww-桧烯合酶编码序列-反向启动子；

(8)终止子-桧烯合酶编码序列-ERG20ww-反向启动子；

(9)终止子-双向启动子-ERG20ww和桧烯合酶的融合蛋白编码序列-终止子；

(10)终止子-ERG20ww和桧烯合酶的融合蛋白编码序列-双向启动子-终止子；

(11)启动子-ERG20ww和桧烯合酶的融合蛋白编码序列-终止子；

(12)终止子-ERG20ww和桧烯合酶的融合蛋白编码序列-反向启动子；

其中，所述双向启动子优选为GAL1&GAL10启动子；所述终止子优选自ADH1t终止子和TDH2t终止子，一般情形下，上述各基因模块中的多个终止子和启动子各不相同。

在本发明具体实施方式中，本发明采用ADH1t-ERG20ww-GAL1&GAL10-桧烯合酶编码序列-TDH2t形式的基因模块；所述重组载体以YGG415质粒为基础质粒，YGG415质粒图谱见图1，质粒全基因序列如SEQ ID NO:1所示；

本发明选取7种不同来源的来源的桧烯合酶，在其余条件相同前提下制备不同重组载体，来源包括Salvia pomifera、Salvia officinalis、Picea sitchensis、Thujaplicata、Murraya koenigii、Citrus jambhiri和Litsea cubeba依次简写为SpSabS1、SoSabS1、PsSabS1、TpSabS1、MkSabS1、CjSabS1和LcSabS1；将转化不同重组载体的重组酵母菌株以及空白酵母菌株通过摇瓶发酵检测桧烯，结果显示，转化有含SpSabS1和CjSabS1重组载体的菌株可产出桧烯，而其余菌株均无桧烯产出，表明本发明所述重组载体可显著提高菌株的桧烯生产能力。

此外，本发明对不同截短的桧烯合酶编码序列进行对比，截短方式分别为去掉桧烯合酶N端1-43位氨基酸残基的截短桧烯合酶编码序列、去掉桧烯合酶N端1-34位氨基酸残基的截短桧烯合酶编码序列、去掉桧烯合酶N端1-52位氨基酸残基的截短桧烯合酶编码序列、去掉桧烯合酶423-449位氨基酸残基的截短桧烯合酶编码序列，将各截短的桧烯合酶编码序列在其余条件相同前提下制备不同重组载体，将转化不同重组载体的重组酵母菌株以及转化含有完整桧烯合酶编码序列的重组酵母菌株通过摇瓶发酵检测桧烯，结果显示，与转化含有完整桧烯合酶编码序列的重组酵母菌株相比，转化含有去掉完整桧烯合酶N端1-34位氨基酸残基的截短桧烯合酶编码序列的重组酵母菌株的桧烯产量提高了近5倍，而其余截短方式均无桧烯产出。

根据上述技术效果，本发明所述桧烯合酶编码序列既可以是完整桧烯合酶编码序列也可以是去除桧烯合酶N端1-34位氨基酸残基的截短桧烯合酶编码序列。

作为优选，所述ERG20ww和桧烯合酶的融合蛋白通过刚性linker或柔性linker进行正向融合或反向融合；其中，所述刚性linker氨基酸序列为GGGGS，所述柔性linker氨基酸序列为PAPAP；所述正向融合为ERG20ww-刚性/柔性linker编码序列-桧烯合酶编码序列，所述反向融合为桧烯合酶编码序列-刚性/柔性linker编码序列-ERG20ww；

作为优选，本发明所述重组载体还可以额外多表达1份或2份以上的ERG20ww，即所述重组载体上还包括1个或2个以上拷贝的额外ERG20ww。出于简便的考虑，所述1个或2个以上拷贝的额外ERG20ww插入位置为前述12种基因模块中的启动子和终止子之间，插入方式通过设计相同酶切位点实现。更为具体地，所述1个或2个以上拷贝的额外ERG20ww插入在前述第(9)或第(10)种基因模块中的启动子和终止子之间。

根据本发明所述重组载体转化到酵母菌株后的桧烯生产效果，本发明提出了所述重组载体在制备用于生产桧烯的重组酵母菌株中的应用；作为优选，所述酵母菌株优选为酿酒酵母菌株，更优选为CEN.PK系列酿酒酵母菌株或BY系列酿酒酵母菌株。

根据所述重组载体的应用，本发明还对应提供了一种用于生产桧烯的重组酵母菌株，其转化有本发明所述重组载体的酵母菌株。在此基础上，所述酵母菌株内源ERG20的启动子可替换为弱启动子，所述弱启动子指相对于酵母菌株内源ERG20的原始启动子为弱启动子。在本发明具体实施方式中，所述弱启动子为HXT1p启动子。

对所述重组酵母菌株的进一步改进方案还包括转化有表达异源外排蛋白的载体。其中，所述异源外排蛋白来自于子囊菌Grosmannia clavigera和/或来自于解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica的外排蛋白；在本发明具体实施方式中，所述表达异源外排蛋白的载体以PRS424为基础质粒，嵌入启动子-外排蛋白编码序列-终止子基因模块；更为具体地，所述启动子-外排蛋白编码序列-终止子基因模块为GAL7-外排蛋白编码序列-GPDt；在本发明具体实施方式中，所述来自于松木的病原菌Grosmannia clavigera的外排蛋白编码序列如SEQ ID NO:2所示，简写为SC-GcABCG1；所述来自于解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica的外排蛋白编码序列如SEQ ID NO:3或4所示，简写为SC-YL-ABC2、SC-YL-ABC3；

同时，基于本发明所述重组载体的桧烯摇瓶发酵试验结果，本发明还提出了所述重组酵母菌株在生产桧烯中的应用。具体的生产桧烯的方法，包括：

步骤1、将所述重组酵母菌株接入培养基活化，制备种子液；

步骤2、将种子液接种于培养基中并添加十四酸异丙酯进行两相培养，培养后收集培养基上层有机相分离出桧烯。

其中，所述培养基40g/L葡萄糖，6.7g/LYNB，2g/Ldrop-out去除亮氨酸的氨基酸混合物(SC-leu培养基)。

在本发明具体实施方式中，所述步骤1为：

将所述重组酵母菌株挑单菌落接种于3mL SC-leu培养基中，30℃，220rpm培养24h，获得一级种子液；将一级种子以初始OD600＝0.2转接到5mL SC-leu培养基中，30℃，220rpm培养12～18h，获得二级种子液；

在本发明具体实施方式中，所述步骤2为：

将二级种子液以初始OD600＝0.1转接到50mL SC-leu培养基中，同时加入20％的十四酸异丙酯进行两相培养(220rpm，30℃，培养96h)。

此外，本发明还提供了所述重组载体的构建方法，首先构建含启动子和终止子的表达盒，在所述表达盒两端以及在启动子和终止子之间设计酶切位点，通过酶切表达盒两端的酶切位点和有相同酶切位点的载体，将表达盒接入到载体中；

分别在ERG20ww和桧烯合酶编码序列的两端设计与所述启动子和终止子之间的酶切位点相同的酶切位点，或先构建ERG20ww和桧烯合酶的融合蛋白的编码序列，在ERG20ww和桧烯合酶编码序列的两端设计与所述启动子和终止子之间的酶切位点相同的酶切位点，通过酶切方式接入到表达盒中，从而连接到载体中，获得重组载体。

优选地，先构建第一酶切位点-终止子-第二酶切位点-双向启动子-第三酶切位点-终止子-第一酶切位点、第一酶切位点-启动子-第二酶切位点-终止子-启动子-第三酶切位点-终止子-第一酶切位点、第一酶切位点-启动子-第二酶切位点-第三酶切位点-终止子-第一酶切位点或者第一酶切位点-终止子-第二酶切位点-第三酶切位点-反向启动子-第一酶切位点表达盒；

通过酶切表达盒两端和载体中的第一酶切位点，将表达盒接入到载体中；

在ERG20ww两端设计第二酶切位点，在桧烯合酶编码序列的两端设计第三酶切位点，或者在ERG20ww两端设计第三酶切位点，在桧烯合酶编码序列的两端设计第二酶切位点，通过酶切方式接入到表达盒中，从而连接到载体中，获得重组载体。

其中，所述第一至第三酶切位点可以选择任何适宜的酶切位点，第一酶切位点根据所要接入的载体而定；在本发明具体实施方式中，所述第二酶切位点和第三酶切位点均选自BsmBI酶切位点和BsaI酶切位点，所述第二酶切位点或第三酶切位点均为背靠背模式，即两个第二酶切位点或两个第三酶切位点以背靠背形式直接相连，以BsmBI酶切位点和BsaI酶切位点为例，示意图可参见图2。图2中显示两个BsmBI酶切位点或BsaI酶切位点的识别序列背靠背连接，由于BsmBI和BsaI这两个酶切位点识别序列和切割序列不是同一段序列，它们均是在识别序列后隔一个碱基切割，这样可以人为设计切割后的切口序列，本发明设计的切口均为catt和taaa，在接入外源基因(如ERG20ww和桧烯合酶编码序列)时可以将外源基因前后两端人为设计为BsmBI或BsaI的酶切位点，设计切口为aatg和ttta，与表达盒上的切口互补配对，连接到表达盒上。

以ADH1t-ERG20ww-GAL1&GAL10-桧烯合酶编码序列-TDH2t基因模块和YGG415质粒为例说明本发明所述重组载体的构建过程：

从BY4741酿酒酵母基因组DNA扩增GAL1&GAL10启动子，ADH1t和TDH2t终止子，同时设计两个背靠背的BsmBI酶切位点和两个背靠背的BsaI酶切位点。通过OE-PCR按照所需顺序组装PCR产物，获的NotI酶切位点-ADH1t-背靠背BsmBI酶切位点-GAL1&GAL10-背靠背BsaI酶切位点-TDH2t-NotI酶切位点的表达盒，NotI酶切表达盒和YGG415质粒，将表达盒接入到载体中；

然后在ERG20ww两端设计BsmBI酶切位点(也可以设计BsaI酶切位点，只要保证BsaI和BsmBI人为设计的切口一致，表达盒用BsmBI酶切，ERG20ww用BsaI酶切也可接入表达盒，这样所有需要导入的基因序列统一设计成BsaI酶切位点会更加简便)，在桧烯合酶编码序列的两端设计BsaI酶切位点，通过BsmBI酶切和BsaI酶切连接到ADH1t-背靠背BsmBI酶切位点-GAL1&GAL10-背靠背BsaI酶切位点-TDH2t表达盒中，从而完成重组载体的构建。

作为优选，所述构建方法中还包括在所述重组载体中接入1个或2个以上拷贝的额外ERG20ww，更优选为在所述表达盒上接入1个或2个以上拷贝的额外ERG20ww，具体的构建方式可通过构建相同的酶切位点来实现。

本发明用于生产桧烯的重组酵母菌株的构建方法，直接将所述重组载体转化至酵母菌株中，获得所述重组酵母菌株。

作为优选，所述重组菌株构建过程中还包括：

构建酵母菌株内源ERG20原始启动子上游同源序列-弱启动子-酵母菌株内源ERG20原始启动子下游同源序列的基因模块，或构建酵母菌株内源ERG20原始启动子上游同源序列-弱启动子-酵母菌株内源ERG20-酵母菌株内源ERG20下游同源序列的基因模块；

将所述基因模块利用酵母同源重组机制替换酵母菌株内源ERG20原始启动子为弱启动子。

作为优选，所述重组菌株构建过程中还包括：

分别设计启动子、异源外排蛋白的编码序列和终止子两端的同源序列，然后连同酶切后的载体转化到所述酵母菌株中，同源重组为表达异源外排蛋白的载体；其中，相邻的两个基因元件之间具有同源区域。

由以上技术方案可知，本发明选择合适的双重突变的ERG20的序列ERG20ww以及外源桧烯合酶基因进行搭配组合，构建出能够生产桧烯的重组载体并利用该载体转化到酵母菌株中，可显著提高菌株生产桧烯的能力，在此基础上继续优化改造，可进一步提高菌株生产桧烯的产量。

附图说明

图1所示为YGG415质粒图谱；

图2所示为BsmBI酶切位点背靠背模式和BsaI酶切位点背靠背模式的示意图；A为BsmBI酶切位点，B为BsaI酶切位点；箭头所指为切口位置，阴影位置为背靠背的识别序列；

图3所示为本发明所述重组载体的示意图；

图4所示为本发明所述重组载体的示意图；

图5所示为替换菌株内源ERG20原始启动子为弱启动子的示意图；

图6所示为表达不同来源的桧烯合酶的重组酿酒酵母的摇瓶发酵产量；横坐标表示各菌株的名称以及下方表格中对应的缩写；

图7所示为表达不同截短的SpSabS1桧烯合酶的重组酿酒酵母的摇瓶发酵产量；横坐标表示各菌株的名称以及下方表格中对应的缩写；

图8所示为YGG416质粒图谱；

图9所示为表达ERG20ww和桧烯合酶融合蛋白以及多表达一份ERG20ww的重组酿酒酵母的摇瓶发酵产量；横坐标表示各菌株的名称；

图10所示为表达不同异源外排蛋白的重组酿酒酵母的摇瓶发酵产量；横坐标表示各菌株的名称以及下方表格中对应的缩写；

图11所示为下调内源ERG20表达的重组酿酒酵母的摇瓶发酵产量；

图12所示为本发明不同优势改造策略组合的重组酿酒酵母的摇瓶发酵产量。

具体实施方式

本发明公开了一种用于生产桧烯的重组载体及重组酵母菌株及其构建方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述重组载体、菌株以及构建方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的重组载体、菌株以及构建方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中所出现的序列均优选经过酿酒酵母密码子优化并适当规避常用限制酶切位点；

ADH1t序列如SEQ ID NO:5所示；

ERG20ww序列如SEQ ID NO:6所示；

GAL1&GAL10序列如SEQ ID NO:7所示；

TDH2t序列如SEQ ID NO:8所示；

Salvia pomifera桧烯合酶编码序列如SEQ ID NO:9所示；

Salvia officinalis桧烯合酶编码序列如SEQ ID NO:10所示；

Picea sitchensis桧烯合酶编码序列如SEQ ID NO:11所示；

Thuja plicata桧烯合酶编码序列如SEQ ID NO:12所示；

Murraya koenigii桧烯合酶编码序列如SEQ ID NO:13所示；

Citrus jambhiri桧烯合酶编码序列如SEQ ID NO:14所示；

Litsea cubeba桧烯合酶编码序列如SEQ ID NO:15所示；

HXT1p序列如SEQ ID NO:16所示；

GAL7序列如SEQ ID NO:17所示；

GPDt序列如SEQ ID NO:18所示；

GPM1t序列如SEQ ID NO:19所示；

背靠背BsmBI酶切位点序列SEQ ID NO:20所示；

背靠背BsaI酶切位点序列SEQ ID NO:21所示；

上述各基因元件序列可按照本发明所述基因模块或表达盒情形进行顺序连接，即为对应基因模块或表达盒的序列。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：构建本发明所述重组载体

1、表达盒的构建和连接载体过程

从BY4741酿酒酵母基因组DNA扩增GAL1&GAL10启动子，ADH1t和TDH2t终止子，同时设计两个背靠背的BsmBI酶切位点和两个背靠背的BsaI酶切位点。通过OE-PCR按照所需顺序组装PCR产物，获的NotI酶切位点-ADH1t-背靠背BsmBI酶切位点-GAL1&GAL10-背靠背BsaI酶切位点-TDH2t-NotI酶切位点的表达盒，NotI酶切表达盒和YGG415质粒，将表达盒接入到载体中；

2、外源基因的导入

(1)ERG20ww和桧烯合酶编码序列分别导入表达盒

在ERG20ww两端设计BsmBI酶切位点，在桧烯合酶编码序列的两端设计BsaI酶切位点，通过BsmBI酶切和BsaI酶切连接到ADH1t-背靠背BsmBI酶切位点-GAL1&GAL10-背靠背BsaI酶切位点-TDH2t表达盒中，从而完成重组载体的构建，获得本发明所述重组载体YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-桧烯合酶编码序列-TDH2t；示意图见图3；

(2)ERG20ww和桧烯合酶融合蛋白的编码序列导入表达盒

将ERG20ww和桧烯合酶编码序列，采用刚性linker GGGGS的编码序列或柔性linkerPAPAP的编码序列进行正向或反向融合连接，在融合蛋白序列两端设计BsaI酶切位点，通过BsaI酶切连接到ADH1t-背靠背BsmBI酶切位点-GAL1&GAL10-背靠背BsaI酶切位点-TDH2t表达盒中，从而完成重组载体的构建，获得本发明所述重组载体YGG415-ADH1t-GAL1&10-ERG20ww和桧烯合酶融合蛋白的编码序列-TDH2t；示意图见图4；

(3)多表达一份ERG20ww的构建过程

在(2)的基础上，在ERG20ww两端设计BsmBI酶切位点，通过BsmBI酶切连接到ADH1t-背靠背BsmBI酶切位点-GAL1&GAL10-ERG20ww和桧烯合酶融合蛋白的编码序列-TDH2t表达盒中，从而完成重组载体的构建，获得本发明所述重组载体YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-ERG20ww和桧烯合酶融合蛋白的编码序列-TDH2t；

其中，桧烯合酶编码序列为来源于Salvia pomifera和/或Citrus jambhiri的桧烯合酶编码序列；或者为在来源于Salvia pomifera和/或Citrus jambhiri的桧烯合酶编码序列基础上，去除N段1-43位氨基酸残基编码序列的截短桧烯合酶编码序列。

实施例2：构建本发明所述重组酿酒酵母菌株

1、底盘菌株

底盘菌株选择为YJGZ1，其是在市售模式菌株CEN.PK2-1C的基础上，通过敲除GAL80的同时过表达了前体基因IDI1和tHMGR1，即增加了前体GPP的供应，以更多的提供桧烯合成需要的底物。具体改造方法如下：

从BY4741基因组DNA扩增PGAL1,10启动子，TADH1和TTDH2终止子和HIS3标记以及Gal80p的上下400bp同源臂。通过OE-PCR按照所需顺序组装PCR产物，获为Gal80up-TADH1-PGAL1,10-TTDH2-His-Gal80down的表达盒。然后将表达盒用NotI-HF酶切并插入到pRS415K的相同位点，产生质粒pJGZ3，其在TADH1和PGAL1,10之间具有两个背靠背的BsmBI位点、PGAL1,10和TTDH2之间有两个背靠背的BsaI位点。用BsmBI酶切从BY4741基因组DNA扩增的IDI1，并连接到相同酶切位点的pJGZ3中以产生pJGZ4。通过NotI-HF从pJGZ4切割片段Gal80up-TADH1-IDI1-PGAL1,10-TTDH2-His-Gal80down并插入重建的不含卡那霉素抗性基因和BsaI位点的pEASY-Blunt载体中以产生质粒pJGZ5。随后，将从BY4741基因组DNA扩增的tHMGR通过BsaI限制性位点插入pJGZ5中以获得pJGZ6。最后，将来自pJGZ6的NotI-HF切割的整合片段Gal80up-TADH1-IDI1-PGAL1,10-tHMGR-TTDH2-His-Gal80down转化到CEN.PK2-1C中，得到YJGZ1。

本实施例所选YJGZ1为前期系统性科研工作已获得的菌株，出于方便考虑直接采用，并非必须使用，在后续的对比菌株中，本发明将同样采用该种菌株作为空白菌株进行对比，其本身并不会产生桧烯。

2、转化所述重组载体

采用醋酸锂转化法将本发明所述重组载体转入YJGZ1中，转化后采用SC-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母质粒进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存，为本发明所述重组酿酒酵母。

3、异源外排蛋白基因的表达

在2中所述重组酿酒酵母基础上，转化能够表达外排蛋白的重组载体。能够表达外排蛋白的重组载体构建方法如下：

首先，使用Not I和BamH I s双酶切载体PRS424。然后，设计引物将表达盒GPM1t-GAL7-GPDt(本发明前期系统科研已获得，为方便起见直接采用)分为GPM1t-GAL7和GPD两段进行PCR，并与外排基因SC-GcABCG1、SC-YL-ABC2、SC-YL-ABC3之间分别设计同源序列，使相邻的两个基因元件之间拥有20～40bp的同源区域，以便利用酵母同源重组拼接载体PRS424，然后转化到酵母菌株中，根据PRS424所带的筛选标签采用SC-LEU-TRP(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸和亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)固体板进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母质粒进行PCR验证，获得本发明所述重组酿酒酵母。

4、下调YJGZ1内源ERG20的表达

在2或3中所获的重组酿酒酵母基础上，设计引物以酵母YJGZ1全基因组DNA为模板扩增片段HXT1p和内源ERG20(也可通过其他方式扩增获得)，选择URA3营养标签loxP-URA3-loxP片段，相邻两个片段之间拥有20～40bp的同源区域，然后通过重叠延伸PCR获得片段loxP-URA3-loxP-HXT1p-ERG20，替换YJGZ基因组上的ERG20p-ERG20，示意图见图5，转化后酵母采用SC-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，后续可通过5-氟乳清酸平板对URA3营养标签回收，获得本发明所述重组酿酒酵母。

实施例3：不同重组酿酒酵母菌株的摇瓶发酵试验

(1)不同来源的桧烯合酶编码序列

按照实施例1中“(1)ERG20ww和桧烯合酶编码序列分别导入表达盒”的方法构建重组载体，桧烯合酶编码序列分别来源于Salvia pomifera、Salvia officinalis、Piceasitchensis、Thuja plicata、Murraya koenigii、Citrus jambhiri和Litsea cubeba依次简写为SpSabS1、SoSabS1、PsSabS1、TpSabS1、MkSabS1、CjSabS1和LcSabS1，将7种重组载体转化到相同的YJGZ1菌株，同时设空白对照菌株YJGZ1，如下：

SyBE_Sc04100001：YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-SpSabS1-TDH2t；

SyBE_Sc04100002：YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-SoSabS1-TDH2t；

SyBE_Sc04100003：YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-PsSabS1-TDH2t；

SyBE_Sc04100004：YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-TpSabS1-TDH2t；

SyBE_Sc04100005：YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-MkSabS1-TDH2t

SyBE_Sc04100006：YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-CjSabS1-TDH2t；

SyBE_Sc04100007：YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-LcSabS1-TDH2t；

对SyBE_Sc04100001-SyBE_Sc04100007和空白对照菌株为底盘菌YJGZ1进行摇瓶发酵。

种子培养基：40g/L葡萄糖；6.7g/LYNB；2g/Ldrop-out去除亮氨酸的氨基酸混合物。

发酵培养基：40g/L葡萄糖；6.7g/LYNB；2g/Ldrop-out去除亮氨酸的氨基酸混合物。

将上述菌株挑单菌落接种于3mL SC-leu培养基中，30℃，220rpm培养24h。将一级种子以初始OD600＝0.2转接到5mL SC-leu培养基中，30℃，220rpm培养12～18h。将二级种子以初始OD600＝0.1转接到50mL SC-leu培养基中，同时加入20％的十四酸异丙酯进行两相培养(220rpm，30℃，培养96h)。

桧烯定量方法：发酵终点取发酵培养基上层有机相1mL，加入无水硫酸钠静置于四度冰箱除水4～5小时。除水后使用2μm有机滤膜将有机相过滤。然后使用气相色谱测定：桧烯的沸点为164℃at 760mmHg，所以检测器温度设置为260℃，进样口250℃，柱温250℃。色谱条件为DB-5硅胶毛细管色谱柱,进样量1μL；柱温起始温度50℃，保持4min；然后以5℃·min-1升至100℃，保持1min；最后以25℃·min-1升至250℃，保持5min；

结果见图6，空白对照菌株YJGZ1中未检测到桧烯色谱峰，菌株SyBE_Sc04100001和SyBE_Sc04100006在12.098min检测到与标准品相同出峰时间的色谱峰，其余菌株未检测到桧烯色谱峰，证明菌株SyBE_Sc04100001和SyBE_Sc0410000实现了桧烯的合成，且SyBE_Sc04100001产量为0.519mg/L，高于菌株SyBE_Sc04100006。因此SpSbS1和CjSabS1来源的桧烯合酶编码序列均可显著提高菌株的桧烯合成能力，其中以SpSbS1来源为最佳。

(2)不同截短方式的桧烯合酶编码序列

以SpSbS1来源的桧烯合酶编码序列为基础，进行如下四种截短操作获得不同截短的桧烯合酶编码序列：

t1SpSabS1：去掉桧烯合酶N端1-43位氨基酸残基的截短桧烯合酶编码序列；

t2SpSabS1：去掉桧烯合酶N端1-34位氨基酸残基的截短桧烯合酶编码序列；

t3SpSabS1：去掉桧烯合酶N端1-52位氨基酸残基的截短桧烯合酶编码序列；

t4SpSabS1：去掉桧烯合酶423-499位氨基酸残基的截短桧烯合酶编码序列；

将上述各截短的桧烯合酶编码序列分别按照实施例1中“(1)ERG20ww和桧烯合酶编码序列分别导入表达盒”方法获得4种不同的重组载体，并转入YJGZ1中，依顺序获得菌株SyBE_Sc04100008、SyBE_Sc04100009、SyBE_Sc04100010和SyBE_Sc04100011，然后连同之前获得的SyBE_Sc04100001进行摇瓶发酵试验；

结果见图7，仅1～34位氨基酸的截短方式获得的重组酿酒菌株SyBE_Sc04100009使桧烯产量提高了近五倍，桧烯产量达到了2.57mg/L，是对照菌株SyBE_Sc04100001产量的4.95倍。其余三种截短方式获得的菌株SyBE_Sc04100008、SyBE_Sc04100010和SyBE_Sc04100011均未有桧烯合成。

(3)ERG20ww和桧烯合酶编码序列融合表达以及多表达一份ERG20ww

分别以柔性linker(GGGGS，SEQ ID NO:22所示)和刚性linker(PAPAP，SEQ ID NO:23所示)的编码序列将ERG20ww与t2SpSabS1分别进行正向和反向融合，参照实施例1“(2)ERG20ww和桧烯合酶融合蛋白的编码序列导入表达盒”的方法构建不同重组载体并转入YJGZ1中，转化后酵母采用SC-LEU固体板进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母质粒进行PCR验证，对验证正确的正向融合柔性linker连接菌株、反向融合柔性linker连接菌株、正向融合刚性linker连接菌株和反向融合刚性linker连接菌株保存甘油菌并依次命名为SyBE_Sc04100012、SyBE_Sc04100013、SyBE_Sc04100014、SyBE_Sc04100015；

参照实施例1“(3)多表达一份ERG20ww的构建过程”的方法构建在SyBE_Sc04100012、SyBE_Sc04100013、SyBE_Sc04100014、SyBE_Sc04100015基础上多表达一份ERG20ww的重组菌株，依次命名为SyBE_Sc04100016、SyBE_Sc04100017、SyBE_Sc04100018、SyBE_Sc04100019；

为排除多表达一份ERG20ww带来的拷贝数差异，构建了阳性对照菌株，即以菌株SyBE_Sc04100009为出发菌株，多表达了一份ERG20ww构建在载体YGG416(质粒图谱见图8，全基因序列如SEQ ID NO:24所示，其与YGG415类似)上，具体构建方法：使用SalⅠ和Bam HⅠ双酶切已构建的YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-TDH2t(实施例1构建重组载体过程中可以获得)得到片段ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-TDH2t，连入使用SalⅠ和BamⅠ双酶切后的载体YGG416，得到YGG416-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-TDH2t，然后转化入菌株SyBE_Sc04100009中，采用SC-LEU-URA固体板进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母质粒进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌命名SyBE_Sc04100020。

将上述SyBE_Sc04100009、SyBE_Sc04100012-SyBE_Sc04100020进行摇瓶发酵试验，图9结果显示，对照菌株SyBE_Sc04100009产量为2.23mg/L。对于柔性linker(GGGGS)，正向融合菌株SyBE_Sc04100012产量为1.94mg/L，反向融合菌株SyBE_Sc04100013产量为2.56mg/L，所以反向融合比正向融合效果要好，而在反向融合基多加一份ERG20ww的效果更好，即菌株SyBE_Sc04100017产量为3.18mg/L。推测原因为t2SpSabS1的N端带有正电荷，吸引带有负电荷的另一份拷贝的ERG20ww，因而可以充分利用前体加速反应。而ERG20ww/tSpSabS1的正向融合会暴露负电荷，与另一份拷贝的ERG20ww所带电荷相同。

对于刚性接头(PAPAP)，正向融合菌株SyBE_Sc04100014产量0.146mg/L，反向融合菌株SyBE_Sc04100015产量为2.17mg/L，与对照菌株SyBE_Sc04100009相比产量要低，但对于多表达一份ERG20ww的菌株SyBE_Sc041000018、SyBE_Sc041000019，产量分别为4.39mg/L和3.31mg/L。这表明对于采用刚性接头(PAPAP)，融合的效果不是很明显，相比而言，多表达一份ERG20ww更有提产效果。

同时，对比SyBE_Sc04100009和SyBE_Sc04100020，SyBE_Sc04100020产量为2.33mg/L，与对照菌株2.23mg/L差异不大，排除了多表达一份ERG20ww带来的拷贝数差异。

实施例4：异源外排基因表达的影响

以菌株SyBE_Sc04100009为出发菌株，参照实施例2“3、异源外排蛋白基因的表达”中的方法构建表达三种不同异源外排蛋白的重组酵母菌株，依次命名为SyBE_Sc04100021(SC-GcABCG1)、SyBE_Sc04100022(SC-YL-ABC2)、SyBE_Sc04100023(SC-YL-ABC3)，进行摇瓶发酵试验，结果见图9；

图10结果显示，对照菌株SyBE_Sc04100009产量为2.23mg/L，菌株SyBE_Sc04100021产量为4.57mg/L，菌株SyBE_Sc04100022产量为3.70mg/L，菌株SyBE_Sc04100023产量为2.54mg/L。SC-YL-ABC2、SC-YL-ABC3和SC-GcABCG1相比而言，SC-GcABCG1达到了很好的外排效果，桧烯产量提升了约一倍。

实施例5：下调内源ERG20的表达的影响

参照实施例2“4、下调YJGZ1内源ERG20的表达”中的方法，构建重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc041000025并进行摇瓶发酵试验，SyBE_Sc041000025内转化有本发明重组载体YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-t2SpSabS1-TDH2t；

图11结果显示，对照菌株SyBE_Sc04100009(其转化有本发明重组载体YGG415-ADH1t-ERG20ww-GAL1&10-t2SpSabS1-TDH2t)产量为2.03mg/L，菌株SyBE_Sc04100025产量为4.19mg/L，表明内源ERG20的下调可以有效减少GPP转变为FPP，减少了下游的支路代谢，从而更多的GPP用来合成桧烯。

实施例6：优势整合的重组酿酒酵母菌株

将实施例1和2中的优势改造策略整合，按照表1中组合方式构建重组酿酒酵母，仍以YJGZ1为底盘菌株。

表1

将所构建的SyBE_Sc04100026-SyBE_Sc04100029菌株进行摇瓶发酵试验，结果如图12所示，从产量上来看，发酵96小时，菌株SyBE_Sc04100029产量最高，达到了17.57mg/L。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种用于生产桧烯的重组载体及重组酵母菌株及其构建方法和应用

<130> MP1900919

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6929

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt gtcacagctt 60

gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 120

ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata 180

tcgactacgt cgtaaggccg tttctgacag agtaaaattc ttgagggaac tttcaccatt 240

atgggaaatg gttcaagaag gtattgactt aaactccatc aaatggtcag gtcattgagt 300

gttttttatt tgttgtattt tttttttttt agagaaaatc ctccaatatc aaattaggaa 360

tcgtagtttc atgattttct gttacaccta actttttgtg tggtgccctc ctccttgtca 420

atattaatgt taaagtgcaa ttctttttcc ttatcacgtt gagccattag tatcaatttg 480

cttacctgta ttcctttact atcctccttt ttctccttct tgataaatgt atgtagattg 540

cgtatatagt ttcgtctacc ctatgaacat attccatttt gtaatttcgt gtcgtttcta 600

ttatgaattt catttataaa gtttatgtac aaatatcata aaaaaagaga atctttttaa 660

gcaaggattt tcttaacttc ttcggcgaca gcatcaccga cttcggtggt actgttggaa 720

ccacctaaat caccagttct gatacctgca tccaaaacct ttttaactgc atcttcaatg 780

gccttacctt cttcaggcaa gttcaatgac aatttcaaca tcattgcagc agacaagata 840

gtggcgatag ggtcaacctt attctttggc aaatctggag cagaaccgtg gcatggttcg 900

tacaaaccaa atgcggtgtt cttgtctggc aaagaggcca aggacgcaga tggcaacaaa 960

cccaaggaac ctgggataac ggaggcttca tcggagatga tatcaccaaa catgttgctg 1020

gtgattataa taccatttag gtgggttggg ttcttaacta ggatcatggc ggcagaatca 1080

atcaattgat gttgaacctt caatgtaggg aattcgttct tgatggtttc ctccacagtt 1140

tttctccata atcttgaaga ggccaaaaca ttagctttat ccaaggacca aataggcaat 1200

ggtggctcat gttgtagggc catgaaagcg gccattcttg tgattctttg cacttctgga 1260

acggtgtatt gttcactatc ccaagcgaca ccatcaccat cgtcttcctt tctcttacca 1320

aagtaaatac ctcccactaa ttctctgaca acaacgaagt cagtaccttt agcaaattgt 1380

ggcttgattg gagataagtc taaaagagag tcggatgcaa agttacatgg tcttaagttg 1440

gcgtacaatt gaagttcttt acggattttt agtaaacctt gttcaggtct aacactaccg 1500

gtaccccatt taggaccacc cacagcacct aacaaaacgg catcaacctt cttggaggct 1560

tccagcgcct catctggaag tgggacacct gtagcatcga tagcagcacc accaattaaa 1620

tgattttcga aatcgaactt gacattggaa cgaacatcag aaatagcttt aagaacctta 1680

atggcttcgg ctgtgatttc ttgaccaacg tggtcacctg gcaaaacgac gatcttctta 1740

ggggcagaca taggggcaga cattagaatg gtatatcctt gaaatatata tatatattgc 1800

tgaaatgtaa aaggtaagaa aagttagaaa gtaagacgat tgctaaccac ctattggaaa 1860

aaacaatagg tccttaaata atattgtcaa cttcaagtat tgtgatgcaa gcatttagtc 1920

atgaacgctt ctctattcta tatgaaaagc cggttccggc ctctcacctt tcctttttct 1980

cccaattttt cagttgaaaa aggtatatgc gtcaggcgac ctctgaaatt aacaaaaaat 2040

ttccagtcat cgaatttgat tctgtgcgat agcgcccctg tgtgttctcg ttatgttgag 2100

gaaaaaaata atggttgcta agagattcga actcttgcat cttacgatac ctgagtattc 2160

ccacagttaa ctgcggtcaa gatatttctt gaatcaggcg ccttagaccg ctcggccaaa 2220

caaccaatta cttgttgaga aatagagtat aattatccta taaatataac gtttttgaac 2280

acacatgaac aaggaagtac aggacaattg attttgaaga gaatgtggat tttgatgtaa 2340

ttgttgggat tccattttta ataaggcaat aatattaggt atgtggatat actagaagtt 2400

ctcctcgacc gtcgatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg 2460

catcaggaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc 2520

agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag 2580

accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg 2640

gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca 2700

tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa 2760

gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg 2820

aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta 2880

accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtcgcgcca ttcgccattc 2940

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 3000

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 3060

cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcgtaatacg actcactata gggcgaattg 3120

ggtaccgggc cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcctgcag 3180

cccccagtag agaccgcctg gctctagtag cgatctacac tagcactatc agcgttatta 3240

agcaccggtg gagtgacgac cttcagcacg ttcgtactgt tcaacgatgg tgtagtcttc 3300

gttgtgggag gtgatgtcca gtttgatgtc ggttttgtaa gcacccggca gctgaaccgg 3360

ttttttagcc atgtaggtgg ttttaacttc agcgtcgtag tgaccaccgt ctttcagttt 3420

cagacgcatt ttgatttcac ctttcagagc accgtcttcc gggtacatac gttcggtgga 3480

agcttcccaa cccatggttt ttttctgcat aaccggaccg tcggacggga agttggtacc 3540

acgcagttta actttgtaga tgaactcacc gtcttgcagg gaggagtcct g

一种用于生产桧烯的重组载体及重组酵母菌株及其构建方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。